凋亡信号调节激酶1通过c-Jun氨基末端激酶通路调控高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤

目的研究细胞凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase1,ASK1)对高糖诱导的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)损伤的保护作用及其可能的机制。方法建立大鼠RGC细胞的分离培养和体外高糖(50 mmol/L葡萄糖)损伤模型。转染ASK1 siRNA沉默ASK1的表达。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ASK1 mRNA表达水平;Western blot检测ASK1、JNK蛋白表达量和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)磷酸化水平;MTT和CCK-8方法、Ki67染色分别检测RGC生长活力和增殖情况;Annexin-V FITC/PI方法和TUNEL检测RGC凋亡情况;试剂盒方法检测Caspase-3活性。结果 RGC高糖环境下培养4d,细胞生长活力降低明显(P<0.05);ASK1表达水平在高糖损伤的RGC中明显上升(P<0.05);ASK1 siRNA的转染实验结果显示:ASK1的表达水平明显下降(P<0.05),说明沉默表达实验成功;ASK1表达被抑制后RGC的生长活力(P<0.05)和增殖能力(P<0.05)明显上升,RGC的凋亡(P<0.01)和Caspase-3的活力(P<0.01)明显降低。沉默ASK1的表达有效地降低JNK蛋白的磷酸化水平。结论抑制ASK1的表达对RGC的高糖损伤有保护作用,其机制可能与抑制JNK通路有关。

加味脑泰方对卵巢摘除脑缺血大鼠海马细胞外信号调节蛋白激酶1/2和c-Jun氨基末端蛋白激酶蛋白活化的影响

目的探讨加味脑泰方对卵巢摘除脑缺血大鼠神经细胞凋亡的影响及其机制。方法雌性Sprague-Dawley大鼠40只随机分为假手术组(n=10)、模型组(n=10)、雌激素组(n=10)和加味脑泰方组(n=10)。模型组、雌激素组、加味脑泰方组大鼠摘除卵巢。去卵巢术后11 d,雌激素组、加味脑泰方组分别予雌激素和加味脑泰方灌胃3 d;术后14 d,模型组、雌激素组、加味脑泰方组线栓法制备局灶性脑缺血模型。缺血24 h后取脑组织,TUNEL法观察神经细胞凋亡率,Western blotting检测海马细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)蛋白活化程度。结果与模型组比较,加味脑泰方组和雌激素组神经细胞凋亡率显著降低(P<0.001),ERK1/2蛋白活化程度明显升高(P<0.01),p-JNK蛋白活化程度明显降低(P<0.01)。结论加味脑泰方可能通过提高p-ERK1/2蛋白活化,降低p-JNK蛋白活化,降低脑缺血后神经细胞凋亡率。

冠心宁通过TNFAIP3-ASK1/JNK通路对动脉粥样硬化血管平滑肌细胞表型转换的调控作用

目的探讨冠心宁(GXN)调控动脉粥样硬化(AS)斑块稳定性的分子机制。方法制备含有GXN药物的血清,利用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)构建AS体外模型,Western blot和qPCR检测VSMC表型转换情况。通过沉默肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3),检测GXN对VSMC表型转换的影响。构建凋亡信号调节激酶1(ASK1)过表达载体,并利用Lip3000转染进细胞,检测GXN是否通过凋亡信号调节激酶1/c-Jun氨基末端激酶(ASK1/JNK)通路发挥作用。结果与对照组比较,ox-LDL组的细胞表型转换,表现为I型胶原蛋白(COLIA1和COLIA2)、TNFAIP3和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平降低(均P<0.01),基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、MMP13、骨桥蛋白(OPN)、ASK1磷酸化与ASK1比值(p-ASK1/ASK1)、JNK磷酸化与JNK比值(p-JNK/JNK)升高(均P<0.01);GXN处理后VSMC表型转换为收缩型,表现为与ox-LDL组相比COLIA1、COLIA2和α-SMA水平增高(均P<0.01),MMP2、MMP9、MMP13、OPN、TNFAIP3的表达水平、p-ASK1/ASK1以及p-JNK/JNK都降低(均P<0.01)。沉默TNFAIP3后,与ox-LDL+10%GXN+sh-NC组相比,COLIA1、COLIA2、TNFAIP3和α-SMA水平降低(均P<0.01),MMP2、MMP9、MMP13、OPN、p-ASK1/ASK1以及p-JNK/JNK都升高(均P<0.01)。过表达ASK1后,与ox-LDL+10%GXN+oe-NC组相比,COLIA1、COLIA2和α-SMA的表达水平降低(均P<0.01),MMP2、MMP9、MMP13、OPN、p-ASK1/ASK1以及p-JNK/JNK都升高(均P<0.01)。结论GXN可能通过TNFAIP3调控ASK1/JNK通路介导VSMC表型转换,从而起到稳定动脉硬化斑块的作用。

解毒通利方对肺癌荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用及ASK1/JNK通路的调节作用

目的研究解毒通利方对肺癌荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用及对凋亡信号调节激酶(ASK)1/c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路的调节作用。方法采用接种NCI-H358细胞法建立肺癌荷瘤小鼠模型,小鼠随机分为生理盐水组、解毒通利方低、中、高剂量组及顺铂组各6只,解毒通利方低、中、高剂量组分别按照10、20、40 g/kg(以生药含量计)灌胃给予小鼠解毒通利方,顺铂组按照5 mg/kg腹腔注射给予顺铂,生理盐水组灌胃给予生理盐水,1次/d,连续30 d,末次给药24 h后,分离肿瘤组织,测定肿瘤体积及重量,苏木素-伊红(HE)染色法检查肿瘤组织病理学,原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色测定肿瘤组织细胞凋亡率,实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)及Western印迹测定肿瘤组织ASK1、JNK mRNA及蛋白水平,免疫组化法测定肿瘤组织ASK1及JNK的平均积分光密度(IOD)值。结果与生理盐水组比较,解毒通利方低、中、高剂量组及顺铂组肿瘤体积及重量显著降低,而肿瘤组织细胞凋亡率、肿瘤组织ASK1及JNK mRNA及蛋白水平、肿瘤组织ASK1及JNK免疫组化水平均显著升高(均P<0.05),小鼠肿瘤组织病理学改变明显。结论解毒通利方能够显著抑制肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织生长,促进肿瘤细胞凋亡,其机制可能与调节ASK1/JNK通路有关。

α-苦瓜素经LRP1受体介导的JNK信号通路诱导肝细胞L02早期凋亡的机制研究

目的:探讨α-苦瓜素诱导肝细胞L02(简称"L02细胞")早期凋亡的信号通路。方法:制备并纯化α-苦瓜素。采用流式细胞术检测0(阴性对照)、160、80μg/mLα-苦瓜素作用L02细胞2～8 h后的细胞凋亡率。小干扰RNA(siRNA)沉默低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)得到LRP1-siRNA细胞,然后采用液相芯片分析术检测α-苦瓜素(160μg/mL)分别作用L02细胞(正常组)和LRP1-siRNA细胞(沉默组)0、0.25、0.5、1、2 h后c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路中促调蛋白磷酸化JNK(p-JNK)、磷酸化凋亡前体蛋白(p-Bad)、胱天蛋白酶9(Caspase-9)及抑调蛋白磷酸化蛋白53(p-p53)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化B淋巴细胞瘤2(p-Bcl-2)、Caspase-8的表达情况,分析α-苦瓜素对L02细胞JNK信号通路的作用。结果:制备并纯化得到α-苦瓜素(纯度>97%);与阴性对照组比较,160μg/mLα-苦瓜素作用8 h时,可显著诱导细胞早期凋亡(P<0.05),80μg/mLα-苦瓜素诱导的早期凋亡不明显(P>0.05);与0 h比较,作用后0.25 h促调蛋白p-JNK、p-Bad和Caspase-9表达量显著增加(P<0.05),而抑调蛋白pp53、p-Akt、p-Bcl-2和Caspase-8表达量无变化;与正常组相比,沉默组各时间点的p-JNK、p-Bad和Caspase-9的表达均显著减少(P<0.05)。结论:α-苦瓜素可能通过LRP1受体介导JNK信号通路诱导肝细胞凋亡,为揭示其肝毒性提供了参考。

橄榄苦苷对脑缺血再灌注损伤大鼠神经元凋亡及JNK/p38 MAPK信号通路的影响

目的研究橄榄苦苷对脑缺血再灌注损伤大鼠神经元凋亡及c-Jun氨基末端激酶(JNK)/促分裂素原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路的影响。方法SD大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组(0.5 mg/kg)及橄榄苦苷高、低剂量组(40、20 mg/kg),每组14只。连续灌胃给药14 d,末次给药结束后采用线栓法建立脑缺血再灌注损伤模型,进行2 h缺血后再灌注24 h,测定神经症状评分、脑梗死面积、脑组织含水量、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关的x蛋白(Bax)mRNA表达及磷酸化的JNK(p-JNK)、磷酸化的p38 MAPK(p-p38)蛋白表达等指标。结果与模型组比较,橄榄苦苷高、低剂量组大鼠神经症状评分、脑梗死面积及橄榄苦苷高剂量组脑组织含水量均显著降低(P<0.05);与模型组比较,橄榄苦苷高、低剂量组大鼠Caspase-3、Bax mRNA及p-JNK、p-p38蛋白表达均明显降低(P<0.05),而Bcl-2 mRNA表达明显增加(P<0.05)。结论橄榄苦苷对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用,该作用与抑制JNK/p38 MAPK信号通路的活化进而减少神经元凋亡有关。

急性百草枯中毒患儿外周血CD4^＋T淋巴细胞肌醇依赖酶1、凋亡信号调节激酶1及c-Jun氨基末端激酶水平变化的意义

目的探讨急性百草枯（PQ）中毒患儿外周血CD4^＋T淋巴细胞肌醇依赖酶1（IRE1）、凋亡信号调节激酶1（ASK1）及c-Jun氨基末端激酶（JNK）mRNA水平的变化。方法选择2014年6月至2016年6月于天津市儿童医院就诊的急性PQ中毒患儿30例，其中男18例，女12例；年龄2～14岁。记录患儿的一般临床资料及实验室检查资料，误服后2～20 h采集外周静脉血标本。选取同期来天津市儿童医院体检的健康儿童30例为健康对照组，男18例，女12例；年龄2～14岁。分离外周血CD4^＋T淋巴细胞，实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）测定外周血CD4＋T淋巴细胞IRE1、ASK1及JNK mRNA的相对表达水平。PCR产物行琼脂糖凝胶电泳鉴定特异性。数据采用SPSS 13.0软件进行分析。结果30例患儿均有口腔黏膜溃烂、恶心、呕吐、腹痛，少尿、无尿19例，消化道出血16例，头痛、头晕12例，胸闷、憋气、呼吸困难11例，抽搐8例，黄疸5例。PQ中毒组IRE1、ASK1及JNK mRNA相对表达水平均明显高于健康对照组（1.70±0.16比1.02±0.18、3.56±0.85比1.05±0.31、5.22±0.87比1.01±0.33，t=15.26、15.21、24.78，均P〈0.01）。结论PQ中毒患儿外周血CD4^＋T淋巴细胞IRE1、ASK1及JNK mRNA相对表达水平升高，可能与PQ所致氧化应激和免疫激活有关，通过内质网应激形成复杂的细胞因子网络，导致CD4^＋T淋巴细胞凋亡，影响多脏器衰竭的发生、发展。

对叶百部总生物碱对人肺癌A549细胞凋亡、PI3K/Akt和JNK/p38 MAPK信号通路的影响

目的:探讨对叶百部总生物碱对人肺癌A549细胞凋亡及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和c-Jun氨基末端激酶/p38丝裂原活化蛋白激酶(JNK/p38 MAPK)信号通路的影响。方法:以人肺癌A549细胞为研究对象,设置空白组和不同质量浓度(100、150、200、250、300 mg·L^(-1))对叶百部总生物碱组。利用噻唑蓝(MTT)比色法、平板克隆实验观察对叶百部总生物碱对A549细胞增殖的影响;采用Hoechst 33258染色法和流式细胞术膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(AnnexinV-FITC)/碘化丙锭(PI)双染法观察细胞凋亡;蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)和Bcl-2表达及PI3K、磷酸化(p)-PI3K、Akt、p-Akt、JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白的表达。结果:与空白组比较,对叶百部总生物碱组(150、200、250、300 mg·L^(-1))细胞增殖抑制率显著增高(P<0.01);对叶百部总生物碱组(150、200、250、300 mg·L^(-1))细胞克隆抑制率显著升高,细胞克隆形成率显著降低(P<0.01)。与空白组比较,对叶百部总生物碱组细胞出现染色质凝聚,荧光反应加强等典型的细胞凋亡特征。与空白组比较,对叶百部总生物碱组细胞凋亡率显著升高(P<0.01);对叶百部总生物碱(150、200、250、300 mg·L^(-1))能够明显上调Caspase-3、Bax蛋白表达(P<0.05,P<0.01),显著下调Bcl-2蛋白表达(P<0.01);对叶百部总生物碱对PI3K、Akt、JNK、p38 MAPK总蛋白表达无明显影响,对叶百部总生物碱(150、200、250、300 mg·L^(-1))能够明显下调PI3K、Akt磷酸化水平(P<0.05,P<0.01);明显上调p38 MAPK磷酸化水平(P<0.05,P<0.01);对叶百部总生物碱(200、250、300 mg·L^(-1))能够明显上调JNK磷酸化水平(P<0.05,P<0.01)。结论:对叶百部总生物碱可抑制人肺癌A549细胞的增殖,并能诱导A549细胞凋亡,其机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路和激活JNK/p38 MAPK信号通路有关。

人参皂苷Rg1对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠海马p-ERK1/2与p-JNK表达的影响

目的探讨人参皂苷Rg1抗脑缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)损伤大鼠海马神经元凋亡的可能机制。方法成年健康雌性SD大鼠120只随机分为脑缺血再灌注模型组(模型组)、人参皂苷Rg1低(10mg/kg)、中(20mg/kg)、高剂量(40mg/kg)组及假手术组,每组18只。各组均腹腔注射给药,假手术组及模型组腹腔注射等量生理盐水,每天1次,连续7天,末次给药后30min,大鼠右侧大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)2h再灌注24h制备I/R模型。以LongaEZ法评定神经功能,尼氏染色、TUNEL染色观察海马锥体神经细胞的损伤情况,并计算神经细胞凋亡率。采用Westernblot法检测细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)及磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase1/2,p-ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK)及磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinases,p-JNK)表达。结果与假手术组比较,模型组神经功能评分、细胞凋亡率、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),锥体细胞存活数减少(P<0.01);与模型组比较,人参皂苷Rg1各剂量组神经功能评分、细胞凋亡率降低(P<0.05,P<0.01),人参皂苷Rg1中、高剂量组大鼠锥体细胞存活数增加,海马CA1区p-JNK蛋白表达降低,p-ERK1/2表达升高(P<0.05,P<0.01)。假手术组海马CA1区有3-4层锥体细胞,排列整齐、紧密,高倍镜下细胞核大而圆,有1～2个核仁。脑组织缺血损伤后,海马区神经细胞受损严重,CA1区失去正常结构,细胞排列散乱,细胞数量减少。部分神经元皱缩,核固缩、深染,呈三角形、长条形、梭形或不规则形,核染色聚集,核仁不清晰。与人参皂苷Rg1低剂量组比较,人参皂苷Rg1中、高剂量组神经功能评分、细胞凋亡率及p-JNK蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),锥体细胞存活数增加,p-ERK1/2表达升高(P<0.05,P<0.01)。人参皂苷Rg1中、高剂量能够改善缺血神经细胞形态,减少神经细胞的丢失,其中,高剂量组作用强于低剂量组。JNK蛋白条带分为两个亚带,JNK1是分子量为46kD的蛋白,JNK2分子量为54kD。ERK蛋白条带也分为两个亚带,ERK1是分子量为44kD的蛋白,ERK2分子量为42kD的蛋白。结论人参皂苷Rg1对I/R大鼠的保护作用与抑制海马神经元凋亡,调节p-JNK及p-ERK1/2表达水平有关。

基于JNK/p38 MAPK信号通路探讨加味春泽汤治疗脊髓损伤尿潴留大鼠的机制

目的:探讨加味春泽汤对脊髓损伤尿潴留大鼠及c-Jun氨基末端激酶/p38丝裂原活化蛋白激酶(JNK/p38 MAPK)信号通路的影响。方法:70只SD雌性大鼠造模前随机选出10只大鼠作为空白组,10只大鼠作为假手术组,剩余50只用脊髓横断法制备脊髓损伤尿潴留模型,将造模成功的大鼠随机分为模型组、加味春泽汤低、高剂量组和抑制剂组。造模结束后,空白组、假手术组和抑制剂组给予生理盐水2 mL灌胃,加味春泽汤高、低剂量组分别给予加味春泽汤28.8、14.4 g·kg^(-1)灌胃,抑制剂组每周给予JNK抑制剂SP600125腹腔注射2次15 mg·kg^(-1),各组大鼠均灌胃28 d。尿流动力学检测和膀胱肌拉力条检测评价大鼠膀胱功能;苏木素-伊红(HE)染色观察膀胱平滑肌组织形态;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测JNK、磷酸化(p)-p38 MAPK、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和胱天蛋白酶-3(Caspase-3)含量;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测膀胱逼尿肌p-JNK、p-p38 MAPK、转录激活因子ETS样蛋白-1(ELK-1)、激活蛋白1(AP1)蛋白表达;免疫荧光检测p-JNK、p-p38 MAPK、AP1表达量;原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡率。结果:与空白组和假手术组比较,模型组最大膀胱容量和膀胱顺应性显著增加,漏尿点压力显著降低,最小收缩力显著增加,收缩频率显著降低(P<0.01),膀胱平滑肌结构混乱,存在大量空泡细胞和组织水肿,有单核细胞浸润和明显的出血,结缔组织呈纤维化趋势,TUNEL阳性细胞明显增多,p-JNK、p-p38 MAPK、AP1和ELK-1蛋白表达显著增加(P<0.01);与模型组比较,各干预组的尿流动力学和膀胱肌条收缩检测均有明显改善,加味春泽汤低剂量组p-p38 MAPK含量显著降低(P<0.01),Caspase-3含量减低(P<0.05);高剂量组JNK、p-p38和Caspase-3含量显著降低(P<0.01),Bcl-2含量显著增加(P<0.01);p-JNK、p-p38 MAPK和AP1蛋白表达水平显著降低(P<0.01),ELK-1蛋白表达水平降低(P<0.05),p-JNK、AP1受体阳性率显著降低(P<0.01),阳性细胞率显著降低(P<0.01),而加味春泽汤高剂量组药效位于加味春泽汤低剂量组和抑制剂组之间,与抑制剂组之间比较差异无统计学意义。结论:加味春泽汤能改善脊髓损伤尿潴留,增强膀胱平滑肌收缩力,该作用与抑制JNK/p38 MAPK信号通路活化进而减少膀胱平滑肌细胞凋亡有关。

肿瘤特异性凋亡基因对人黑素瘤细胞凋亡诱导作用的机制研究

为研究肿瘤特异性凋亡基因(apoptin gene)在诱导人黑素瘤细胞A375发生凋亡时,c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路在细胞发生凋亡中的作用,用含有apoptin基因的真核表达载体瞬间转染体外培养的人黑素瘤细胞A375;采用流式细胞仪、蛋白印迹法(western blot)、锥虫蓝染色法及RT-PCR等方法研究其在不同时间对人黑素瘤细胞A375诱导凋亡的作用。结果表明,apoptin基因瞬间转染的人黑素瘤细胞A375可出现明显的细胞凋亡;而且凋亡细胞的数量与apoptin的转染时间有关;凋亡细胞内磷酸化型JNK蛋白随凋亡细胞数量的增加而增多,而非磷酸化型JNK蛋白表达无明显变化。结论:JNK信号通路的活化可能在apoptin诱导肿瘤细胞凋亡过程中发挥作用。

天麻钩藤饮含药血清对MPP^+诱导PC12细胞凋亡JNK通路的影响

目的:观察天麻钩藤饮含药血清对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenyl pyridinium,MPP^+)诱导的PC12细胞凋亡的影响,并且探讨其是否通过c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路发挥神经保护作用。方法:将32只SD大鼠随机分为空白组、天麻钩藤饮低、中、高剂量组,每组8只。天麻钩藤饮按照5.7,11.4,22.8 g·kg-1灌胃,空白组灌胃等体积生理盐水,采血制备空白和含药血清。PC12细胞常规培养并分为空白组、模型组、天麻钩藤饮含药血清低、中、高剂量组,空白组和模型组加空白血清,其他3组加10%的天麻钩藤饮含药血清,孵育30 min后,模型组和含药血清组再加500μmol·L^(-1)MPP^+共孵育48 h后收集细胞,采用Cell Titer 96Aoueous MTS Reagent powder(MTS法)检测细胞存活率。后续实验分为5组,即:空白组,MPP^+组,MPP^++含药血清高剂量组,MPP^++SP600125组,MPP^++含药血清高剂量+SP600125组,采用Annexin VFITC/PI双染色法检测细胞凋亡,分光光度法检测细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测JNK,p-JNK,c-Jun,p-c-Jun蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组细胞活力明显降低(P<0.05);与模型组比较,10%的天麻钩藤饮低、中、高剂量含药血清组细胞活力显著增加(P<0.05)。后续试验中,与空白组比较,MPP^+组细胞凋亡率,Caspase-3活性,p-JNK和p-c-Jun蛋白表达明显升高(P<0.05)。与MPP^+组比较,MPP^++含药血清高剂量组,MPP^++SP600125组均能够使细胞凋亡率,Caspase-3活性,p-JNK和p-c-Jun蛋白表达明显降低(P<0.05),而MPP^++含药血清高剂量+SP600125组的作用明显高于MPP^++含药血清高剂量组(P<0.05),但不高于MPP^++SP600125组。JNK和c-Jun蛋白表达无明显变化。结论:天麻钩藤饮含药血清对MPP^+诱导的PC12细胞的凋亡具有保护作用,其机制可能与JNK信号通路密切相关。

刺芒柄花素对单侧输尿管梗阻大鼠ASK1、JNK蛋白表达的影响

目的探讨刺芒柄花素对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠凋亡信号调节激酶1(ASK1)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白表达的影响。方法制备单侧输尿管梗阻诱导肾间质纤维化动物模型,将大鼠随机分为假手术组、模型组、依那普利组及刺芒柄花素高、中、低剂量(100、50、25 mg/kg)组;术后14 d处死大鼠并采集血清检测血清肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)水平;采用HE染色观察大鼠肾脏的病理改变及评定肾小管损伤指数;Masson染色观察肾间质胶原沉积的面积;采用Western blotting免疫印迹法检测肾组织ASK1、JNK蛋白表达水平;采用TUNEL法检测肾小管上皮细胞的凋亡。结果与模型组比较,各治疗组大鼠血清Scr、BUN水平均显著降低(P<0.05、0.01);肾小管损伤指数、肾间质胶原分布相对面积均显著降低(P<0.05、0.01);肾组织ASK1、JNK蛋白表达水平显著降低(P<0.05、0.01);肾小管上皮细胞凋亡指数显著降低(P<0.05、0.01)。刺芒柄花素高剂量组各项指标优于依那普利组。结论刺芒柄花素能够抑制UUO模型大鼠ASK1、JNK蛋白表达水平,阻止细胞凋亡,从而减缓梗阻性肾病病理进程的发生和发展。

基于MEKK1/SEK1/JNK1/AP-1通路探讨三七总皂苷对4T1乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤模型的影响

目的:通过研究三七总皂苷对4T1乳腺癌荷瘤小鼠促分裂原激活的蛋白激酶的激酶1(MEKK1)/应激激活的蛋白激酶/细胞外信号调节的蛋白激酶(SAPK/Erk激酶,SEK1)/c-Jun氨基末端激酶1(JNK1)/激活蛋白-1(AP-1)通路的影响,探讨三七总皂苷抑制肿瘤的可能机制。方法:建立4T1乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤模型,将48只造模成功的小鼠随机分为三七总皂苷低、中、高剂量组(10,20,40 mg·kg^-1)和模型组,每组12只,三七总皂苷各剂量组腹腔注射剂量为10 mL·kg^-1,模型组给予相同剂量的生理盐水,连续给药28 d。给药结束后分离肿瘤组织、称质量、切片、匀浆等,采用脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)染色检测肿瘤细胞凋亡;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肿瘤组织MEKK1,SEK1,JNK1,AP-1 mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测4T1乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤组织MEKK1,SEK1,JNK1,AP-1蛋白表达。结果:与模型组比较,三七总皂苷中、高剂量组的肿瘤质量明显下降(P<0.05);肿瘤细胞凋亡数量随三七总皂苷剂量的升高明显升高(P<0.05);三七总皂苷中、高剂量组肿瘤组织中MEKK1,SEK1,JNK1,AP-1 mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论:三七总皂苷对4T1乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤模型具有抑制作用,其作用机制可能与激活MEKK1/SEK1/JNK1/AP-1信号通路有关。

对叶百部总生物碱抑制非小细胞肺癌NCI-H460细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用机制

目的:观察对叶百部总生物碱对人非小细胞肺癌NCI-H460细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:以非小细胞肺癌NCI-H460细胞作为研究对象,设置空白组和对叶百部总生物碱组(50、100、150、200、250 mg·L^(-1))。通过噻唑蓝(MTT)比色法和平板克隆形成实验观察对叶百部总生物碱对人非小细胞肺癌NCI-H460细胞增殖的影响;Hoechst33258染色法和流式细胞术观察细胞凋亡;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测对叶百部总生物碱对胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和表皮生长因子受体(EGFR)mRNA的表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测对叶百部总生物碱对Caspase-3、Bax、Bcl-2、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化(p)-Akt、EGFR、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p-JNK、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)及p-p38 MAPK蛋白表达的影响。结果:与空白组比较,对叶百部总生物碱组细胞增殖抑制率显著升高(P<0.01);细胞克隆形成数目和克隆形成率明显降低(P<0.05,P<0.01);细胞核固缩、细胞质凝聚及细胞凋亡率显著增加(P<0.01);对叶百部总生物碱组(100、150、200、250 mg·L^(-1))Caspase-3 mRNA表达明显升高(P<0.05);对叶百部总生物碱组Bax mRNA表达显著升高(P<0.01),Bcl-2 mRNA表达显著降低(P<0.01);对叶百部总生物碱组(100、150、200、250 mg·L^(-1))EGFR mRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01);对叶百部总生物碱组(100、150、200、250 mg·L^(-1))Caspase-3、p-JNK蛋白表达显著上调(P<0.01);对叶百部总生物碱组Bax、p-p38 MAPK蛋白表达显著上调(P<0.01),Bcl-2蛋白表达显著下调(P<0.01);对叶百部总生物碱组(100、150、200、250 mg·L^(-1))EGFR、p-Akt蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01)。结论:对叶百部总生物碱可抑制人非小细胞肺癌NCI-H460细胞增殖,并能诱导其凋亡,其机制可能与抑制EGFR蛋白的表达和Akt蛋白的磷酸化及激活JNK/p38 MAPK信号通路有关。

不同剂量氟对大鼠肾皮质IRE1α-ASK1-JNK蛋白表达的影响

目的探讨内质网应激凋亡通路相关蛋白在慢性氟中毒大鼠肾皮质中的表达变化及意义。方法24只健康SD大鼠,根据体质量(100~120 g)采用随机数字表法分为4组(6只/组,雌雄各半);对照组大鼠饮用自来水(含氟量<0.5 mg/L),低、中、高氟组分别饮用含氟量为10、50、100 mg/L(氟化钠)的自来水。各组大鼠饲养180 d后,观察氟斑牙发生情况;收集24 h尿样,氟离子选择电极法检测尿氟含量;大鼠麻醉后处死取肾脏组织,苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠肾皮质病理学改变;免疫组织化学染色法观察大鼠肾皮质内质网应激凋亡通路相关蛋白[肌醇依赖性激酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)、凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)、C-Jun氨基酸末端激酶(C-Jun N-terminal kinase,JNK)及磷酸化JNK(phosphorylated-JNK,P-JNK)]的表达水平。结果对照组大鼠未检出氟斑牙,低氟组大鼠氟斑牙发生率为2/6,中氟组为5/6,高氟组为6/6。与对照组[(5.707±1.190)mg/L]比较,低、中、高氟组大鼠尿氟[(17.028±3.006)、(34.378±12.045)、(94.759±31.773)mg/L]均较高(P均<0.05),且高氟组明显高于低、中氟组(P均<0.05)。HE染色可见,与对照组比较,中、高氟组大鼠肾皮质区肾小管及肾小球细胞体积增大,细胞排列紧密,细胞质嗜酸性增强。免疫组织化学染色结果显示,对照组和低、中、高氟组大鼠肾皮质JNK蛋白表达水平比较差异无统计学意义(F=0.07,P>0.05);高氟组大鼠肾皮质IRE1α、ASK1、P-JNK蛋白表达水平与对照组和低、中氟组比较均较高(P均<0.05),且中氟组IRE1α、ASK1蛋白表达水平均明显高于对照组及低氟组(P均<0.05)。结论长期过量氟摄入可导致大鼠肾皮质损伤,其损伤机制可能与内质网应激凋亡通路IRE1α-ASK1-JNK的活化有关。

藁本内酯对帕金森病细胞模型的保护作用及其机制研究

目的研究藁本内酯对帕金森病细胞模型的保护作用及其作用机制。方法取对数生长期的SK-N-SH细胞使用200μmol·L^(-1)的MPP+处理48 h,构建帕金森病细胞模型;以正常培养基培养的细胞作为对照组。藁本内酯组加入终浓度为30.0μmol·L^(-1)藁本内酯进行培养;P79350组加入30.0μmol·L^(-1)的藁本内酯后,实验结束前1 h加入50μmol·L^(-1)的P79350处理细胞;对照组和MPP+组加入不含药物的培养基培养。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞活力;以流式细胞术检测细胞周期情况和细胞凋亡率;以蛋白质印迹法检测p38丝裂原活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(p38 MAPK/JNK)信号通路和增殖、凋亡相关蛋白的表达水平。结果对照组、MPP+组和10.0、20.0、30.0、50.0、100.0和200.0μmol·L^(-1)藁本内酯组的细胞存活率分别为(100.00±1.91)%、(35.63±3.40)%、(49.06±3.78)%、(54.08±6.63)%、(91.61±4.43)%、(79.87±6.15)%、(64.73±7.64)%和(42.99±6.09)%。藁本内酯可明显抑制MPP+诱导引起的p38 MAPK/JNK信号通路的激活,并明显抑制MPP+组细胞G0/G1期转变。对照组、MPP+组、藁本内酯组和P79350组细胞凋亡率分别为(4.66±0.68)%、(21.22±1.98)%、(10.43±0.96)%和(15.32±1.41)%。与MPP+组细胞相比,藁本内酯作用后可明显促进细胞中Ki-67、增殖细胞核抗原(PCNA)和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白的表达,而明显抑制Bcl-2相关X(Bax)蛋白和裂解的胱天蛋白酶-3(Cl-caspase-3)蛋白的表达,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论藁本内酯对帕金森病细胞模型具有保护作用,可增强细胞活力,抑制细胞凋亡,主要与抑制p38 MAPK/JNK信号通路的激活有关。

银杏内酯B对肌萎缩侧索硬化细胞模型的保护作用及其机制

目的:探讨银杏内酯B(ginkgolide B,GB)对肌萎缩侧索硬化细胞模型c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路及细胞凋亡的影响。方法:通过含过表达人突变超氧化物歧化酶1(SOD1)G93A基因(hSOD1G93A)和过表达人野生SODWT基因(hSOD1WT)与空质粒的慢病毒感染NSC34细胞,经一定浓度的嘌呤霉素筛选,倒置荧光显微镜下观察慢病毒的转染效率和细胞形态的变化,蛋白免疫印迹法(Western blot)检验感染细胞是否过表达SOD1蛋白,建立hSOD1G93A-NSC34细胞系后给予GB,细胞培养分组为正常组、模型组、不同浓度GB组(25,50,75,100 mg·L-1)组,48 h后噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率,筛选出最佳药物浓度,后续实验分组为以正常组,模型组,75 mg?L-1 GB组,SP600125组,75 mg·L-1GB+SP600125组,流式细胞术检测各组细胞的凋亡率,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测磷酸化(p-)JNK,c-Jun,p-c-Jun,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白的表达。结果:与正常的NSC34细胞比较,hSOD1G93ANSC34组细胞胞体变圆,突触减少、变短,而hSOD1WT NSC34组细胞和空质粒组细胞形态学未发生明显变化,与正常组比较,hSOD1G93ANSC34组,hSOD1WTNSC3组细胞内SOD1蛋白水平显著升高(P<0.01),肌萎缩侧索硬化(ALS)细胞模型成功建立。与正常组比较,模型组细胞存活率显著降低(P<0.01);与模型组比较,给予不同浓度GB后,细胞存活率均显著升高(P<0.01),药物质量浓度为75 mg·L-1时细胞存活率显著升高(P<0.01)。后续实验,与正常组比较,模型组凋亡率,p-JNK,p-c-Jun,cleaved Caspase-3蛋白表达量显著升高(P<0.01);与模型组比较,75 mg·L-1GB组,SP600125组,75 mg·L-1GB+SP600125组凋亡率,p-JNK,p-c-Jun,cleaved Caspase-3蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论:GB对肌萎缩侧索硬化细胞模型具有抑制细胞凋亡的保护作用,这种保护作用可能是通过JNK信号通路实现的。