影响凝胶迁移率实验因素的教学改进

凝胶迁移实验(EMSA-Electrophoretic Mobility Shift Assay)是一种研究蛋白质与核酸相互作用的常用实验技术。在凝胶迁移率实验的教学工作中,由于受实验材料的影响,尤其是EMSA探针浓度的变化,对实验结果的影响很大。为进一步提高实验教学效果,将探针浓度对实验结果的影响进行了比较。通过设置一系列浓度梯度实验,发现采用浓度为5nmol的探针实验效果最好,改进后的实验效果更加明显。

橡胶树HbCBF1蛋白的原核表达及其CRT结合活性分析(简报)

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis），是大戟科橡胶树属植物．原产于巴西亚马逊河流域，是典型的热带高大乔木．所生产的橡胶是天然橡胶的重要来源。在我国．橡胶树栽培区主要分布在北纬18°到24°．冬季常常遭到寒潮和冷空气的侵袭。30多年来的植胶历史证明．寒害是我国植胶区较为严重的自然灾害．是影响我国橡胶栽培的主要自然灾害之一。对橡胶树进行低温、抗寒生理研究，明确橡胶树的低温反应和抗寒机制．在理论和实践上都有重要意义。

丙丁酚抑制氧化型低密度脂蛋白诱导系膜细胞转化生长因子-β_1表达

目的 观察丙丁酚对ox- LDL诱导系膜细胞AP -1活性和TGF -β1 表达的作用 ,探讨抗氧化剂治疗脂质肾损伤的分子机制。方法 大鼠系膜细胞随机分为正常细胞组、ox- LDL处理组和ox- LDL +丙丁酚处理组。运用凝胶迁移率实验检测AP-1活性变化 ,Western杂交检测c- Jun、JNK/SAPK磷酸化及TGF- β1 蛋白表达水平的改变。运用Northern杂交检测TGF- β1- mRNA表达。结果 丙丁酚 5 0 μmol/L预处理系膜细胞 2 0h ,显著降低ox LDL诱导系膜细胞AP 1活性。丙丁酚浓度为 5 0、1 0 0、2 0 0 μmol/L时 ,均显著抑制ox- LDL诱导JNK ,/SAPK磷酸化 ;且ox LDL +丙丁酚处理组的c Jun蛋白表达分别为ox- LDL处理组的 6 0 %、5 1 %和 4 6 %。Northern杂交显示 :ox LDL为 1 0 μg/mL时并不激活TGF- β1 mRNA表达 (P >0 .0 5 ) ;而当ox-LDL浓度增至 5 0、1 0 0 μg/mL时 ,TGF -β1 mRNA表达分别增加 1 .8和 1 .9倍。Western杂交显示ox -LDL呈剂量依赖方式增加TGF β1 蛋白质表达。加入丙丁酚后显著降低ox LDL诱导系膜细胞的TGF -β1- mRNA和蛋白质表达 (P <0 .0 5 )。结论 丙丁酚可能通过抑制JNK1 /SAPK磷酸化和AP 活性下调ox- LDL诱导系膜细胞TGF- β1 表达。

康氏木霉中调控纤维素酶形成的两个调控因子的克隆及功能性分析

锌指蛋白ACEI和Xyr1是里氏木霉中调控纤维素酶和木聚糖酶形成的两个调控因子,它们能竞争性结合木聚糖酶基因xyn1的启动子。为进一步研究ACEI和Xyr1调控纤维素酶基因表达的机制,本研究利用PCR技术扩增康氏木霉ACEI和Xyr1 DNA结合区的基因序列,并使其在大肠杆菌中得到表达。凝胶迁移率移动试验表明ACEI和Xyr1的DNA结合区均可与纤维素酶基因cbh1启动子的287 bp序列特异性结合。提示ACEI与Xyr1不仅能竞争性结合xyn1启动子,也能竞争性结合cbh1启动子。

吡咯烷二硫代氨基甲酸盐对大鼠急性坏死性胰腺炎肝损伤的保护作用

目的:探讨核因子KB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对大鼠急性坏死性胰腺炎(ANP)的预防治疗作用。方法:大鼠80只随机分为正常对照组(Z)、胰腺炎组(Y)和干预纽.干预组又分为建模前1h PDTC干预组(A)、建模后1h PDTC干预组(B)和建模后6h干预组(C).干预组按不同时间ip PDTC.建模后6,12,24 h分批处死,临床全自动生化仪检测血清谷丙转氨酶(ALT)和淀粉酶(AMY),用凝胶迁移率改变分析法(EMSA)测定胰腺和肝脏中NF-κB的活性.同时观察胰腺和肝脏的病理改变.结果:正常大鼠组织中几乎测不到NF-κB的活性,与Z组比较,Y组胰腺和肝脏组织中6,12,24 h NF-κB活性分别明显增加(P<0.001).建模前1h,1h后使用PDTC,胰腺和肝脏组织中NF-κB活性均受到抑制(18.14±3.30,23.79±3.62 vs 24.82±4.57:10.68±2.51,13.83±2.70 vs 16.38±2.50;P<0.05),Y组血清ALT,AMY均高于对照组.病理学检查可以见到Y组和A,B,C组的胰腺和肝脏均有炎性改变,但A组较Y组明显为轻.结论:NF-κB的异常活化与SAP以及肝损伤有明显关系:PDTC对SAP时肝损伤的发生有一定的预防作用.

益气补肾药方对老龄小鼠T细胞中NF-κB活性的影响及作用机制

目的 :探讨益气补肾药方延缓衰老的免疫学机制。方法 :以老龄小鼠为衰老模型 ,用凝胶迁移率 (EMSA)法 ,观察益气、补肾和益气补肾药方对抗CD3抗体诱导的老龄小鼠T细胞中NF κB活性的影响。用Westernblot分析该药方对NF κB两个亚基 (p65和p50 )的表达。结果 :老龄小鼠T细胞中NF κB的活性低于幼龄小鼠 ,3种药方均可不同程度地提高老龄小鼠T细胞中NF κB的活性 ;而对p65和p50的表达没有明显影响。结论 :益气补肾药方可通过提高T细胞中NF κB的活性 ,改善因衰老而导致的免疫功能紊乱。

木质素降解条件下黄孢原毛平革菌lip基因转录调控序列的筛选与鉴定

用DNA蛋白质体外结合实验和凝胶迁移率变动分析技术筛选黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysospori um)木质素过氧化物酶基因lipA、lipC、lipF的5′端调控区内能与该菌在木质素降解条件下形成的蛋白特异结合的顺式作用元件。结果表明,来自lipC、lipF基因的5′端片段LG2P3(396bp)和LG6S12(738bp)能特异结合培养于Kirk低氮培养基中的菌丝体蛋白;而来自于lipF基因的5′端的LG6S2(226bp)DNA片段能特异结合培养于天然冷杉木片中的菌丝体蛋白。对这些片段的DNA序列分析表明,它们均存在各种顺式作用元件,由此推测它们可能是被一些木质素过氧化物酶基因转录调控相关的蛋白质所结合的序列。

NF-κB在冠心病中的表现

目的研究冠心病的病人外周血单个核细胞中NF-κB水平的变化。方法用凝胶迁移率试验(EMSA)检测冠心病患者60例和健康对照组14例静脉血单个核细胞中的NF-κB中的含量。结果冠心病组的NF-κB相对于健康对照组,明显升高,有显著性差异(31.07±15.98vs4.41±3.88,P<0.01)。结论冠心病病人除了有炎症反应蛋白的增加,还有早期的炎症前细胞激动因子的转录因子NF-κB的激活。

Zif268的锌指DNA结合区在大肠杆菌中的功能性表达

锌指蛋白是最大的蛋白家族 ,是识别核酸最常见的、最有效的结构元件。通过选择合适的表达载体及诱导表达条件 ,实现了小鼠转录因子Zif2 6 8的锌指DNA结合区在大肠杆菌中的部分可溶性表达。凝胶迁移率移动试验证实纯化的可溶部分锌指DNA结合区可以特异性识别、结合其天然靶序列 ,提示锌指DNA结合区在大肠杆菌中得到了功能性表达。锌指DNA结合区在大肠杆菌中的功能性表达成功为锌指蛋白 DNA相互作用的胞内遗传筛选模型的建立奠定了基础。

长非编码RNA与SAFB1相互作用中RNA二级结构的作用

为探究RNA与SAFB1蛋白相互作用过程中RNA二级结构的作用.采用足迹法确定SAFB1与LINC-PINT-1特定的结合区域,在此基础上根据RNA结构分析研究SAFB1结合区域所具有特定的二级结构.最后通过凝胶迁移率实验论证该二级结构在RNA与SAFB1蛋白结合中的作用.结果显示:在针对LINC-PINT-1的亚克隆发现只有包含30~55nt区域的亚克隆才能维持RNA结合区域的二级结构,并且证实了LINC-PINT-1与SAFB1蛋白相互作用依赖于特定的RNA二级结构.结果表明:长非编码RNA与SAFB1蛋白相互作用或依赖于特定的RNA二级结构,本研究为RNA与蛋白质相互作用的分子机制研究提供了有力的理论实验支撑.

EMSA法分析STAT5信号分子与周期蛋白cyclin B1的相互作用

利用蛋白凝胶电脉迁移率变动分析法 (EMSA)分析STAT5信号分子与周期蛋白cyclinB1的相互作用。探针位于cyclinB1启动子区的 - 783到 - 75 4之间 ,该区域包含SATAT5与cyclinB1的结合序列TTN5AA。STAT5与cyclinB1共形成a、b和c三条蛋白滞后带 ,当用点突变的探针作用时 ,仅剩下滞后带a和滞后带c 。

IRAK-M短发夹RNA对RAW264.7细胞内毒素耐受性的抑制作用

目的:观察白介素-1受体相关激酶-M(IRAK-M)基因沉寂后RAW264.7细胞内毒素耐受性的改变,进而探讨IRAK-M在内毒素耐受形成中的作用.方法:构建表达IRAK-M短发夹RNA(shRNA)的阳性重组质粒(pshIRAK-M-A)和阴性重组质粒(pshIRAK-M-B),转染RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞系)细胞;各组细胞经10μg/L脂多糖(LPS)预处理24h后(或直接)用100μg/LLPS刺激;3h后,酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养液中TNF-α水平,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中的TNF-α mRNA表达水平,蛋白印迹法(Western blotting)检测细胞中IRAK-M蛋白的表达,凝胶电迁移率分析法(EMSA)检测细胞中NF-κB的活性.结果:pshIRAK-M-A对IRAK-M蛋白表达抑制率为83%左右,pshIRAK-M-B对IRAK-M蛋白表达无明显抑制作用;两种转染细胞在用100μg/LLPS直接刺激后,其培养液中TNF-α水平、细胞内TNF-α mRNA表达及NF-κB活性无显著性差异;两种转染细胞对LPS的再次应答均明显弱于初次应答细胞(P<0.05),但pshIRAK-M-A转染组细胞对LPS的再次应答明显强于pshIR AK-M-B转染组细胞(P<0.05).结论:IRAK-M表达受抑导致细胞内毒素耐受性减弱,IRAK-M在内毒素耐受形成中起重要作用.

EMSA法分析STAT5信号分子与周期蛋白cyclin D1的相互作用

利用蛋白凝胶电脉迁移率变动分析法 (EMSA)分析STAT5信号分子与周期蛋白cyclinD1的相互作用。探针位于cyclinD1启动子区的 - 2 48到 - 2 2 0之间 ,该区域包含SATAT5与cyclinD1的结合序列TTN5AA。STAT5与cyclinD1共形成a、b两条蛋白滞后带 ,当用点突变的探针作用时 ,仅剩下滞后带a。

红霉素对过氧化氢刺激的支气管上皮细胞表达白细胞介素-8与谷胱甘肽的影响

目的探讨红霉素对过氧化氢(H2O2)诱导的支气管上皮细胞表达炎症介质白细胞介素8(IL8)及抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)的影响和可能的作用机制。方法培养16HBE株的人支气管上皮细胞,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察过氧化氢及红霉素对细胞生长的影响。将传代后的细胞按24、36、48h3个时间段分组,每个组再分为对照组、H2O2组、红霉素+H2O2组。通过酶联免疫吸附实验检测细胞上清中IL8的浓度;通过凝胶迁移率阻滞实验(EMSA)来检测转录因子核因子κB(NFκB)和激活蛋白1(AP1)的活性;通过酶联免疫检测仪检测细胞内GSH、谷氨酰半胱氨酸合成酶(γGCS)的含量;应用Western印迹检测谷氨酰半胱氨酸合成酶重链亚单位(γGCSHS)蛋白表达。结果红霉素(5μg/ml)预孵育36、48h后可以抑制H2O2(0.01mmol/L)诱导的HBE上清中IL8的含量;红霉素(5μg/ml)预孵育36、48h后可以下调H2O2(0.01mmol/L)诱导的支气管上皮细胞转录因子NFkB、AP1的活性;红霉素(5μg/ml)预孵育48h抑制H2O2(0.01mmol/L)诱导的HBE细胞GSH和γGCS的含量(3.46±0.41)以及γGCSHS蛋白表达、γGCSHS启动子区域AP1转录活性。结论红霉素通过下调NFκB、AP1的活性而抑制H2O2诱导的炎症介质IL8的释放,进而影响GSH及γGCS的合成调控。

康氏木霉纤维素酶转录因子ACEII与外切纤维二糖水解酶基因I(cbh1)启动子的结合分析

ACEI、ACEII和Xyr1是康氏木霉中调控纤维素酶基因表达的转录因子。体外实验已证实ACEI和Xyr1可与cbh1启动子上的287bp序列(-304bp^-18bp)结合从而调控cbh1基因转录,但ACEII是否可与此序列结合仍未清楚。为进一步研究ACEII调控纤维素酶基因表达的机制,利用PCR技术扩增康氏木霉ACEII DNA结合区的基因序列,并使其在大肠杆菌中表达。凝胶迁移率移动试验表明ACEII DNA结合区不能与cbh1启动子的287bp序列结合。提示了康氏木霉cbh1基因在诱导表达时起调控作用的主要是Xyr1,而不是ACEII。这对阐明真菌纤维素酶基因表达调控的分子机制具有重要的意义。

沉默信息调节因子1基因启动子区域单核苷酸多态性与老年退行性心脏瓣膜病的相关性分析

目的探讨沉默信息调节因子1(SIRT1)基因启动子序列单核苷酸多态性(SNPs)与老年退行性心脏瓣膜病(SDHVD)的相关性。方法对236例SDHVD组成员(2012年2月至2016年10月济宁医学院附属医院确诊为SDHVD的患者)与285名健康对照组成员(同期于济宁医学院附属医院体检中心体检的健康体检者)的SIRT1基因启动子序列进行统计分析。Sanger测序法检测SIRT1基因启动子序列SNPs;χ^2、Logistic回归对SNPs进行基因型、等位基因分析和相关性分析,Haploview 4.2软件对SNPs进行连锁不平衡分析,SHEsis程序进行单倍型分析,凝胶迁移率变异实验(EMSA)分析SNPs对转录因子与SIRT1基因启动子相结合的影响,Transfac程序预测受多态性影响的与SIRT1基因启动子相结合的转录因子。结果rs3740051位点GG基因型与SDHVD的发生具有相关性,校正年龄后,其致SDHVD效应是AA基因型的3.079倍(OR=3.079,95%CI:1.156~8.201,P=0.024)。SIRT1基因启动子中,5个SNPs位点间呈强连锁不平衡(均D′>0.8),共形成11种P<0.05的单倍型,其中*A**C、AA**C、*AG*C、AAG*C、AA*AC、*AGAC和AAGAC在SDHVD组中具有更高的频率(均P<0.05,OR>1,95%CI不包含1)。EMSA示正常序列探针与核蛋白所孵育出的结合条带较突变序列探针与核蛋白所孵育出的结合条带颜色深。结论rs3740051位点GG基因型与SDHVD具有相关性且可能是SDHVD发生的危险性基因型。单倍型AC(跨rs932658和rs2394443)可能是SDHVD发生的危险性单倍型。rs3740051可能通过干扰FOXC蛋白与SIRT1基因启动子的结合影响SDHVD的发生发展。

鸟分枝杆菌PhoP功能分析及其基因突变株的构建

【目的】对鸟分枝杆菌PhoP的功能进行分析及构建PhoP基因突变株,为深入研究PhoP的调控机制打下基础。【方法】利用PCR扩增出鸟分枝杆菌PhoP DNA结合区(PhoPC)编码序列,与表达载体p GEX-4T-3连接后,转化入大肠杆菌BL21(DE3)中表达GST-PhoPC融合蛋白。用凝血酶去除GST标签,制备PhoPC蛋白;利用PCR扩增出鸟分枝杆菌PhoP基因及其下游基因MAV0127、PhoU和Amt的启动子片段,采用凝胶迁移率移动试验(EMSA)分别检测PhoPC与PhoP、MAV0127、PhoU和Amt的启动子结合的情况。通过PCR扩增PhoP基因上、下游片段,构建PhoP基因缺失性同源核苷酸片段,与自杀质粒p GMB151连接后,通过电转化导入鸟分枝杆菌进行同源交换,利用PCR筛选出PhoP基因缺失突变株。【结果】EMSA结果显示,鸟分枝杆菌PhoP能与PhoP、MAV0127及Amt基因启动子结合,不能与PhoU结合。通过PCR和序列分析证实基因突变株的PhoP基因缺失了309个碱基。【结论】PhoP不仅可调控其下游基因MAV0127和Amt的转录水平,还可调控其自身基因的转录,但不参与调节PhoU二元调控系统。构建了PhoP基因缺失突变株,为进一步研究其在鸟分枝杆菌的调控功能奠定了基础。