导入β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶基因的转基因可育油菜及其抗菌核病的研究

利用农杆菌转化法,将组成型表达β1,3葡聚糖酶及几丁质酶基因的双价植物表达载体pBLGC转化优质甘蓝型油菜品种H165,并得到了抗卡那霉素(Kanamycin,Kan)的再生植株。我们对所得到的抗Kan的再生苗进行了初步分子生物学检测,结果表明,在K15(Kan15mg/L)培养基上的绿苗中有30%为PCR阳性植株,而在K25(Kan10mg/L)培养基上的绿苗有53%的阳性率。对部分PCR阳性的转基因植株进行了点杂交分析,结果均表现出较强的杂交信号,这初步说明外源基因已整合到油菜基因组中。转基因植株的活体接种油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorium)试验表明,部分转基因植株比对照显示较强抗病性。

转几丁质酶基因(RC24)水稻中大2号抗纹枯病特性研究

导入外源几丁质酶基因“RC2 4”的水稻中大 2号接种纹枯病菌的结果表明 ,接种病菌后病斑扩展速率和田间病情指数小 ,表现为对水稻纹枯病高抗。组织病理学研究表明纹枯病菌能侵入中大 2号 ,并引发纹枯病 ,入侵时间和症状出现的时间与非转基因感病对照没有显著差异 ,但病菌菌丝体消解现象出现早于对照 ,其抗病性主要表现为限制病菌扩展。以中大 2号与非转基因水稻材料配制的杂交组合的抗病性表明 ,杂交组合的抗病性均高于非转基因亲本 ,但其抗病性也会因母本的不同而有所变化。

向大豆导入几丁质酶基因的初步研究

以根癌农杆菌的Ｔｉ质粒为介导，将抗真菌病的几丁质酶基因，导入黑龙江省栽培大豆－东农３７号，吉林２８号等１４个品种。从子叶节和下胚轴诱导出丛生芽，并再生植株，经ＰＣＲ和ＤＮＡ分子杂交检测，确认为转化植株。用花粉管通道导入法，直接导入几丁质酶基因，共获２２３粒种子，经ＰＣＲ和ＤＮＡ分子杂交检测的１１３株大豆幼苗中，有７株呈阳性反应，证明几丁质酶基因已导入并整合到大豆的基因组中。

基因枪法向小麦导入几丁质酶基因的研究

利用基因枪法,以菜豆几丁质酶基因转化小麦幼胚愈伤组织。在轰击压力1300psi,轰击距离6cm、100μg金粉/枪和轰击距离9cm、150μg金粉/枪的2种处理条件下,获得4株春小麦东农7742转化植株,转化频率分别为0.36%和0.56%。经PCR和PCR-Southern杂交分析,证实菜豆几丁质酶基因已整合到T0和T1小麦基因组中。采用氨基葡萄糖法测定几丁质酶活力,结果表明,转基因小麦的几丁质酶活力明显高于对照株;转基因植株对白粉病症状减缓,并获得一株赤霉菌接种未扩展的转基因T1植株。

中华稻蝗几丁质酶基因10(OcCht10)的分子特性及功能

【目的】获得中华稻蝗(Oxya chinensis)几丁质酶基因1 0(OcCht10)的cDNA序列,预测其功能域,并做聚类分析明确该基因的系统发育关系。绘制OcCht10在5龄若虫不同组织部位和发育时间的表达图谱,研究其在中华稻蝗蜕皮过程中的生物学功能,为害虫防治提供高效安全的候选基因。【方法】从中华稻蝗转录组数据库搜索OcCht10cDNA片段,经过blast分析、比对、拼接后,翻译为氨基酸序列,预测其功能域,并与其他昆虫几丁质酶家族基因进行聚类分析,进一步确认该基因的系统发育关系并进行准确命名;选取中华稻蝗5龄第6天不同组织部位及5龄若虫不同天数表皮样本,总RNA提取后反转录为cDNA模板,采用Real-time quantitative PCR(qPCR)方法获得OcCht10在5龄稻蝗若虫不同组织部位和不同发育阶段的表达谱;设计OcCht10 dsRNA引物,用试剂盒体外合成dsOcCht10,采用注射法进行RNA干扰;取注射24 h稻蝗表皮样本,用qPCR方法检测OcCht10基因沉默效率;并仔细观察dsRNA注射后稻蝗表型,统计其死亡率。【结果】经对中华稻蝗转录组数据库的搜索,获得OcCht10cDNA片段长度为9 318 bp,开放阅读框为8 61 3 bp,编码2 870个氨基酸;其3'非编码区为705 bp,推测OcCht105'端有500多碱基尚未获得;预测其氨基酸序列具有多个结构域,包含有5个几丁质酶催化域和6个几丁质结合域;与其他昆虫几丁质酶基因聚类分析结果显示OcCht10属于昆虫几丁质酶家族基因Ⅱ组,该组基因与昆虫蜕皮相关;5龄若虫组织特异性分析表明该基因主要在表皮、前肠和后肠等外胚层发育而成的组织器官中表达,提示OcCht10可能参与表皮几丁质代谢;发育时间表达图谱表明该基因在5龄第6—7天,即蜕皮前的表皮中高表达,表明OcCht10可能负责蜕皮时表皮几丁质降解;5龄若虫第2天注射该基因的dsRNA,24 h后取表皮检测其干扰效率,结果显示该基因被沉默7 0%;与注射dsGFP的对照组相比,注射dsOcCht105龄若虫表现为龄期延长,旧表皮无法开裂,蜕皮受阻,昆虫无法正常活动导致死亡,死亡率达到1 00%。【结论】获得OcCht10的部分cDNA序列,该基因在昆虫蜕皮前表皮中高表达;OcCht10参与中华稻蝗的蜕皮发育,注射dsOcCht10可有效沉默靶基因,并导致试虫无法完成正常蜕皮而死亡。

转几丁质酶基因黑杨的获得

以G1黑杨幼叶为外植体建立了组织培养高频再生体系 ,对传统的农杆菌介导法进行了改进 ,用来自于菜豆的几丁质酶基因 (CH5B)进行转化 ,经PCR和PCR Southern杂交鉴定 ,证实CH5B基因已整合入G1黑杨核基因组中。

转番茄几丁质酶基因西瓜植株的获得及其抗病性研究

构建了以C aM V 35s启动子驱动的含有番茄几丁质酶基因(Ch i3)的植物表达载体,通过冻融法导入根癌农杆菌(A g robacterium tum ef aciens)菌株EHA 105中,用叶盘法转化西瓜(C itru llus lana tus)栽培种“中育1号”,通过PCR、Sou thern b lot和RT-PCR鉴定,表明外源基因已成功整合到西瓜基因组中,并获得表达。利用尖孢镰刀菌西瓜专化型进行的转基因植株叶片粗提液抑菌效果检测,表明转基因植株的抗病性均有一定程度的增强。

苏云金杆菌以色列亚种几丁质酶基因的克隆及序列分析

从苏云金芽孢杆菌以色列亚种 (Bacillusthuringiensissubspisraelensis)中提取基因组DNA ,通过合成 1对特异性引物 ,用touchdownPCR的方法扩增几丁质酶ichi基因序列 (GenBank登录号 :AF5 2 6 379)。ichi序列全长为 2 5 70bp ,含有 1个 2 0 6 7bp的开放阅读框 (ORF) ,编码 6 88个氨基酸 ,推测分子量为 75 79kDa ,等电点pI=5 90的几丁质酶前体。序列和结构比较分析表明 :Ichi氨基酸序列与蜡状芽孢杆菌 (Bacilluscereus) 2 8 9几丁质酶CW、蜡状芽孢杆菌CH几丁质酶B及苏云金芽孢杆菌墨西哥亚种几丁质酶的同源性分别为 97 2 4 %、97 18%、97 6 3% ,而与苏云金芽孢杆菌巴基斯坦亚种的同源性只有 6 3 0 7%。Ichi编码区由分泌信号肽 (46AA)、催化区 (10 5AA)、粘蛋白Ⅲ型同源区 (74AA)及几丁质结合区 (40AA)组成。

反义磷脂酶Dγ基因与几丁质酶基因转化美洲黑杨G2

建立美洲黑杨G2组培再生体系,确立美洲黑杨G2分化最适宜培养基和生根培养基。然后分别进行卡那霉素和潮霉素敏感性试验,利用叶盘法依次将反义磷脂酶Dγ(Anti_PLDγ)基因和几丁质酶(CH5B)基因转入美洲黑杨G2中。首先转入反义磷脂酶Dγ基因,经诱导不定芽及生根阶段卡那霉素(选择性抗生素)连续筛选,获得了21株卡那霉素抗性植株。抗性植株经PCR及PCR_Southern杂交检测,有13株均呈阳性,证明Anti_PLDγ基因成功整合到美洲黑杨G2基因组中。耐盐性试验表明,4株转基因植株抗NaCl能力比对照都有不同程度提高。选择4号株系继续转入几丁质酶基因,通过潮霉素(选择性抗生素)筛选不定芽及诱导生根获6株潮霉素抗性植株,经PCR及PCR_Southern杂交检测,6株均呈阳性,证明CH5B基因成功整合到美洲黑杨G2基因组中。由于CH5B基因与报告基因GUS处于同一开放阅读框(ORF)内,因此通过GUS基因的组织化学染色分析,证明了6株转化植株几丁质酶基因均获得正常表达。

玉米几丁质酶基因导入甘蓝型油菜的研究

以甘蓝型油菜 (BrassicanapusL .)下胚轴为转化材料 ,通过根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)介导将玉米几丁质酶基因 (MaizeChitinasegene)导入双低油菜品种D2 中 ,获得了抗卡那霉素 (KanamycinKan)的再生植株 ,并对影响遗传转化的一些因素进行了研究。结果表明 :适当的预培养对油菜下胚轴的遗传转化是必要的 ;油菜下胚轴遗传转化过程中的过敏反应可通过一些措施缓解 ;延迟筛选可提高油菜下胚轴的转化率。对抗性植株进行PCR检测表明 :部分抗性植株在多次重复检测中均显示较强的阳性反应 。

用基因枪介导法将水稻几丁质酶基因导入小麦

利用PDS10 0 0 /氦气基因枪将水稻几丁质酶基因导入小麦幼胚盾片愈伤组织 .基因枪轰击后在含有 5 0mg/L硫酸卡那霉素的培养基上经过多步骤筛选和分化 ,从 5个小麦品种共 80 0多个幼胚中获得了 6株绿苗 ,对此 6株绿苗进行了PCR和Southern杂交分析 .结果表明 ,其中 4株绿苗为转基因植株 ,转化率最高可达 1.2 % .图 3表 2参

转几丁质酶基因水稻根系微生物群落分析

采用“直接观察法”和“分离培养法”对转基因水稻根系微生物群落的初步分析结果表明,导入外源水稻几丁质酶基因(RC24)的转基因水稻根内和根表的微生物群落发生显著变化,转基因水稻根部内生真菌总数显著减少,内生细菌总数显著增加,其内生细菌总数是未转基因亲本对照的10倍左右。采用“直接观察法”测得2个转基因水稻品种有内生真菌的根段率为55.2％和81.1％,而对照为100％,转基因水稻根系真菌和细菌种类与对照存在显著差异,有VA菌根泡囊的根段率显著降低。

几丁质酶基因克隆及其野生蕉转化

本研究根据GenBank公布的木霉几丁质酶基因(chitinase)序列设计一对引物,采用RT-PCR方法从木霉(Trichoderma spp.)中克隆获得了几丁质酶基因全序列,编码区共1275bp,推测其编码424个氨基酸,该基因与哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的内切几丁质酶基因chit42(GenBank accession No.L14614)具有99%的同源性。在此基础上,将获得的几丁质酶基因从pGEM-T载体中用XbaⅠ和BamHⅠ切下,克隆到pBI121植物表达载体的XbaⅠ和BamHⅠ位点,构建了植物表达载体pBI-chit并将其转入根癌农杆菌菌株EHA105。该菌株转化野生蕉(Musa itinerans Cheesm.)胚性细胞悬浮系,经过抗性筛选、胚的诱导和萌发,获得成熟体细胞胚和再生苗。通过GUS组织化学法检测和PCR方法鉴定,结果表明外源基因已经成功转入到野生蕉中。本研究为下一阶段转化香蕉栽培品种和筛选抗香蕉枯萎病新种质奠定一定的基础。

几丁质酶基因表达载体pET-chiB的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达(英文)

几丁质酶在降解几丁质的过程中起着重要作用,目前人们已从不同微生物体中分离并克隆出了多种几丁质酶基因。实验以pET-22b(+)为载体,利用从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)克隆出的chiB基因,构建出原核生物表达载体pET-chiB。通过表达载体pET-chiB的诱导表达,实验结果显示该基因表达的蛋白为可溶性蛋白,其分子量约为52 kD。利用不同参数包括时间、IPTG浓度和温度诱导表达载体pET-chiB表达并对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示其诱导表达的最佳参数分别为4 h,0.5 mmol/L和25℃。这些结果为几丁质酶基因的进一步研究和几丁质酶工程菌生产奠定了良好的工作基础。

转几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因烟草的研究

为选育出高抗真菌病害的烟草新品种 ,利用叶盘法 ,通过农杆菌介导 ,将来自芥菜和橡胶的抗真菌蛋白基因几丁质酶基因和 β 1,3 葡聚糖酶基因转入烟草品种K32 6和红花大金元 ,在含卡那霉素的MS培养基 (MS +NAA0 .1mg/L +6 BA 1.0mg/L为芽诱导培养基 ,根诱导培养基为不含激素的MS)上进行不定芽和根诱导 ,共获耐卡那霉素再生苗 10 1株 .经PCR扩增检测 ,TB 1等 5 7株呈阳性 ,即已成功导入外源目的基因 .初步接种炭疽病菌和黑胫病菌结果表明 ,转基因植株后代具有良好的抗病能力 .

转几丁质酶基因水稻对土壤化学性状及酶活性的影响研究

对种植转几丁质酶基因水稻“竹转 6 8”农田土壤化学性状的变化研究结果表明 ,当年种植和连续 2年种植转基因水稻“竹转 6 8”农田土壤有机质、可溶性N、P以及过氧化氢酶、多酚氧化酶、蔗糖酶和脲酶活性与非转基因水稻对照相比无显著差异 ,且其叶片的化感作用大于非转基因水稻对照 ,但其腐殖过程化感效应及残体腐殖速度均小于非转基因水稻对照 ;经过冬季腐殖过程 2种水稻土壤腐殖化程度基本一致 ,表明种植转基因水稻“竹转 6 8”对水稻生产不会产生不利影响。

昆虫几丁质酶基因的分子特性概述

昆虫几丁质酶是分解昆虫体壁和中肠围食膜几丁质的重要酶类。已从烟草天蛾、家蚕等多种昆虫中分离到几丁质酶的cDNA和DNA序列。昆虫几丁质酶基因有着相似的分子特性,这些特性可为构建杀虫工程菌及转几丁质酶基因植物奠定基础。作者结合自己在该领域的工作,着重就昆虫几丁质酶基因结构特点,基因的拷贝数,基因在体内的时空表达以及异源表达及活性测定等多个方面的研究方法和研究进展进行了较为全面地介绍。

水稻几丁质酶基因导入芥菜型油菜的研究

以芥菜型油菜 (BrassicajunceaL .)下胚轴为转化材料 ,通过根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)介导将水稻的几丁质酶基因 (Ricechitinasegene)导入“泸洲四陵”油菜品种中 ,获得抗潮霉素的再生转基因植株 ,并讨论了影响油菜再生及转化效率的几个因素。对部分经潮霉素筛选得到的再生植株进行了多次重复PCR检测 ,发现其中 40 %以上的潮霉素抗性植株均表现出较强的阳性反应 ,初步证明几丁质酶基因已整合到油菜细胞核基因组中。

小偃54和小偃81高温抗条锈性及其与几丁质酶基因表达的关系

为了探明小麦高温抗条锈性的遗传机理,以小麦条锈菌流行小种对小麦品种小偃54和小偃81进行了苗期接种鉴定,并采用RT-PCR方法从小偃54中克隆了几丁质酶基因Chi1编码区全长cDNA序列Chi1xy,利用半定量PCR技术比较分析了常温(14±1℃)和高温(21±1℃)处理下条锈菌侵染的小偃54几丁质酶基因Chi1xy的表达谱。结果表明,小偃54和小偃81均具有明显的高温抗条锈性。常温处理下,Chi1xy的表达没有明显变化,始终维持在较低水平。而高温处理下,Chi1xy的表达在处理后的前72 h变化不明显,96 h开始升高,并在144 h达到表达高峰,直到192 h仍维持较高的表达水平。两种温度处理下Chi1xy的表达谱差异显著,说明小偃54对条锈病的高温抗条锈性可能与几丁质酶基因Chi1xy的表达水平相关。这是首次发现几丁质酶和高温抗条锈性有关。

苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆及诱导表达

从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)T04A001中提取基因组DNA,通过PCR的方法克隆了几丁质酶chiAC基因(GenBank登录号为EF427670)。置换chiAC基因的启动子为T7启动子时,chiAC基因能在IPTG诱导下在大肠杆菌中大量表达,并产生大小约70 kDa的表达产物。