用于多通道单分子定位的高精度图像配准方法

单分子定位技术可以绕过光学系统的衍射限制,在生物样品的单粒子追踪和超分辨显微成像中得到了广泛应用.多通道单分子定位采用多个成像通道,可以实现对不同目标的同时追踪或多色超分辨成像,也可以提升单粒子追踪的轴向深度或实现更高的定位精度和密度.但各通道图像间的差异会影响协同定位或定量分析,因此图像配准是其图像数据预处理的关键环节;且由于单分子定位精度高,其对多通道图像配准精度的要求也很高.现有技术一般采用基于控制点的配准方法,且多采用复杂而精密的方式来获取基准物网格图像用于定位得到控制点对,以实现高精度图像配准,对样品或实验设备要求高,难以直接推广.为此,本文基于局部非线性变换和误匹配点剔除,发展了一种可以直接采用随机分布荧光珠样品作为基准物的高精度图像配准方法,通过在特征匹配和变换模型参数估计的过程中对控制点进行监测和迭代筛选,以剔除因单分子定位不准确或精度差而导致未精确匹配的控制点对,从而消除以随机分布荧光珠样品作为基准物时对于控制点准确获取和精确匹配所带来的不良影响,同时采用基于局部加权平均的二阶多项式拟合进行变换模型参数估计,以更好地适用于不同通道间存在局部非线性形变的情形.结果表明,采用该方法只需要3次迭代,就可以将未准确定位和精确匹配的控制点对找到并剔除,从而实现更准确的变换模型参数估计,将配准精度提高一个数量级,在图像局部非线性形变情况严重的正交像散双通道单分子定位成像系统中实现了约6 nm的配准精度.

浓缩、富集与分子定位型表面增强拉曼光谱及应用

表面增强拉曼散射光谱(SERS)是一种能够提供分子指纹信息的振动光谱技术,具有单分子级的检测灵敏度、尖化的谱峰,以其无需标定、非破坏性、多个组分同时检测等优势,广泛应用于表面科学、材料科学、生物医学、药物分析、食品安全、环境检测等诸多领域。随着1997年单分子SERS现象的发现,表面等离激元效应受到了广泛的关注,科研人员集中研究了光与纳米结构相互作用所产生的表面等离激元现象这一基本科学问题,并对各种纳米结构进行了精准调控,促进了纳米技术的蓬勃发展。然而,过去几十年的研究表明:仅仅依靠电磁场增强机制及纳米结构构筑,难以实现高灵敏的单分子SERS检测。因此,针对不同分子与纳米结构表面相互作用规律、分子在热点处吸附-解吸附行为及复杂基质与待测分子的相互作用机制等一系列基本科学问题仍需要进行深入研究。本文系统介绍了当前SERS检测的技术瓶颈,包括灵敏度的提高、弱吸附物质的检测和复杂基质的影响等,重点关注浓缩富集和分子定位手段及其应用。详细介绍了构建多功能SERS基底时所使用的物理、化学和吸附剂策略,并分析了该领域目前所面临的挑战。同时提出新的研究方向,以实现对于实际应用非常重要的高效SERS基底设计思路。

正交像散高密度三维单分子定位显微的数值模拟

单分子定位显微(single molecule localization microscopy, SMLM)成像技术利用荧光分子的稀疏发光、探测及定位,实现了纳米级空间分辨率的超分辨成像.为了提高其时间分辨率,需要提高同时发光的荧光分子密度.但随着分子密度的提高,不同分子的点扩散函数(point spread function, PSF)在探测器上将发生严重的重叠现象,导致空间分辨率降低,尤其是在进行三维SMLM成像时.为了解决这一问题,本文提出了一种基于正交像散的高密度三维单分子定位超分辨成像方法,并对该方法进行分析和数值模拟研究.该方法的核心是在单分子定位显微镜中将采集的荧光分成两束成像在同一个探测器的两个区域,并在两个通道中各引入一个光学参数相同但取向相互正交的柱透镜,实现对同一个荧光分子正负两个像散PSF图像的同时探测,然后建立该成像过程的线性投影模型,利用压缩感知算法求解出荧光分子的三维定位信息.结果表明,由于两个正交柱透镜产生的一组正交像散PSF对作为一个分子的系统响应时具有较低的相关性,该方法的高密度三维定位准确性可显著优于采用单个柱透镜的传统像散方法,且离焦程度越大两个像散PSF的形状差异越大,这种准确定位的优势就越明显.

水稻稻瘟病抗性基因的分子定位及克隆研究进展

稻瘟病是全世界范围内影响水稻粮食生产的主要病害之一。培育和合理利用抗病品种是控制稻瘟病最经济、有效的措施。随着水稻(Oryza sativa)及稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)基因组测序的完成,水稻-稻瘟病菌的互作已成为研究植物与真菌相互作用的模式系统。在过去的50多年中,通过广泛的遗传分析,已经鉴定了84个稻瘟病抗性基因及大量的数量抗性遗传位点(quantitative trait locus)。其中,8个主效抗性基因及1个隐性部分抗性基因已被克隆。本文综述了迄今已鉴定及定位的稻瘟病抗性基因的研究情况,根据基因的定位信息将这些基因整合到一张连锁图谱中;对抗性基因簇以及簇内基因间的关系作了分析;并进一步对后基因组时代抗性基因克隆策略的变化及其对策进行了探讨。

水稻芽期耐冷性QTL的分子定位

以籼粳交密阳23号/吉冷1号的F2:3代200个家系作为作图群体,构建了一张含有97个微卫星(SSR)标记的分子连锁图谱。在5℃低温条件下,对F3家系进行芽期耐冷性鉴定,并利用SSR标记进行了芽期耐冷性数量性状位点(QTL)分析。研究结果表明,芽期耐冷性在F3家系群中呈单峰连续分布,表现为由多基因控制的数量性状;共检测到与芽期耐冷性有关的QTL3个,分别位于第2、4和7染色体上,对表型变异的贡献率范围为11.5%～20.5%。其中,位于第4染色体RM273～RM303的qCTBP4对表型变异的贡献率最大。

水稻加工品质数量性状基因座(QTLs)分子定位研究

检测了Lemont/特青RI群体 2 12个株系的糙米率 (BR)、精米率 (MR)和整精米率 (HR)等 3项加工品质性状 ,利用RFLP连锁图和线性模型的复合区间作图方法 (QTLMapperV1.0 )进行QTL定位研究。群体呈连续分布 ,双向超亲现象明显 ,HR较BR、MR变异范围更大并偏向低值方向 ;分别检测到 1个MR、4个HR主效QTL ,其中QHr6和QHr7等 2个基因座具有较大遗传效应 ;分别检测到 12对影响BR、5对影响MR、16对影响HR的上位性基因座 ,上位性效应的影响大于主效QTLs。

水稻抗白叶枯病基因Xa-25的分子定位

Xa 2 5是从体细胞突变体HX 3中鉴定出的水稻抗白叶枯病基因。通过花药培养构建了 0 2 4 2 8(粳稻 )和HX 3(籼稻 )的双单倍体 (DH)群体 ,该群体包含了 12 9个稳定株系 ,以我国长江流域水稻白叶枯病的代表菌株浙173对DH群体进行抗病性鉴定 ,抗病株系数和感病株系数分别为 6 2和 6 7。共选用覆盖水稻 12条染色体的 30 0对SSR引物对 0 2 4 2 8和HX 3进行多态性分析 ,有 74对引物在双亲之间表现差异。利用这些差异引物对DH群体进行连锁分析 ,从而将抗白叶枯病基因Xa 2 5定位到第 4染色体长臂末端的两个SSR标记RM6 74 8和RM 115 3之间 ,连锁距离分别为 9 3cM和 3 0cM。

水稻黄绿叶基因YGL4的遗传分析和分子定位

通过EMS诱变恢复系缙恢10号，获得了一个稳定遗传的全生育期黄绿化叶色突变体。其叶绿素总含量稳定在2.01~2.28 mg g-1之间，仅有对照的38.2%~50.5%。与对照相比，黄绿叶突变体的有效穗和株高显著下降，而主穗长、一次枝梗数、主穗实粒数、结实率、千粒重则无明显差异。遗传分析表明该性状受一对隐性核基因控制，命名为YGL4。利用微卫星标记将YGL4定位于第10染色体微卫星标记RM3123和RM590之间，分别距其7.6 cM和7.8 cM。在两标记间进一步设计SSR引物，将该黄绿叶基因定位于RM1162和RM7093之间，分别距其1.8 cM和4.0 cM。为该YGL4基因的分子标记辅助选择育种和图位克隆奠定了基础。

条浒苔蛋白核超微结构和Rubisco及其活化酶分子定位

研究了条浒苔蛋白核超微结构及其Rubisco和Rubisco活化酶金相免疫分子定位。超微结构显示,条浒苔细胞具有形态及组成相同的1～2个蛋白核,每个蛋白核被淀粉鞘所包围。蛋白核中央均有1条由1个类囊体构成的纵向孔道,并有时局部特别膨大。纵向孔道两端与叶绿体基质相连接。小球藻Rubisco抗体对条浒苔Rubisco的Western印迹图谱显示仅为1条带,其位置与SDS-PAGE电泳图谱上的主带相对应,分子量大约为55kD。金相免疫分子定位的结果显示,条浒苔Rubisco金标颗粒主要分布于叶绿体的蛋白核(71.86%)和淀粉鞘(27.94%)部位中,按面积密度计算二者总和占99.8%,极少分布在叶绿体类囊体和基质中(0.2%)。Rubisco活化酶分子定位也显示其主要分布于蛋白核和淀粉鞘中。这些结果均表明条浒苔蛋白核(及淀粉鞘)与单细胞绿藻的蛋白核相同,具有光合作用功能。条浒苔Rubisco初始活性和总活性的测定结果表明,其活化率较高,高达77.62%。

矮泰引-3中半矮秆基因的分子定位

矮泰引 3的矮生性状受两对独立遗传的半矮秆基因控制 ,利用SSR标记将这两个矮秆基因分别定位到第1和第 4染色体上。等位性测交的结果表明 ,位于第 1染色体上的矮秆基因与sd1是等位的 ,所以仍然称其为sd1 ;而位于第 4染色体上的矮秆基因是一个新基因 ,暂命名为sdt 2。利用SSR标记将sd1定位于RM 2 97、RM 30 2和RM 2 1 2的同一侧 ,而与OSR3共分离 ,它们之间的位置关系可能是RM2 97 RM 30 2 RM2 1 2 OSR3 sd1 ,遗传距离分别为 4 7cM、0cM、0 8cM和 0cM ,这与sd1在第 1染色体长臂上的确切位置是基本一致的。利用已有的SSR标记和拓展的SSR标记将sdt2定位于SSR332、RM1 30 5和RM 5 6 33、RM30 7、RM 4 0 1之间 ,它们的排列位置可能是SSR332 RM 1 30 5 sdt2 RM 5 6 33 RM 30 7 RM4 0 1 ,它们之间的遗传距离分别为 1 1 6cM、3 8cM、0 4cM、0cM和 0 .4cM。

水稻卷叶基因RL13的遗传分析和分子定位

叶片形态是理想株型的重要指标之一,叶片适度卷曲有利于理想株型的建成,是水稻超高产育种的重要材料。在EMS诱变籼稻缙恢10号群体中发现一个卷叶突变体,表现叶片筒状卷曲,经过多代连续自交,性状稳定,命名为rl13(rolledleaf13)。rl13的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均显著高于野生型对照缙恢10号,类胡萝卜素含量在苗期、孕穗期与野生型相比有显著提高,而抽穗期和成熟期则差异不显著。rl13的三片功能叶的卷曲度与野生型相比均达到极显著差异,但rl13的三片功能叶之间差异不显著。通过石蜡切片分析,突变体叶肉细胞层数变薄,野生型含有的一个较大泡状细胞转变为卷叶突变体的2个大小相近的泡状细胞,导致了叶片弯曲。以该突变体为父本,西农1A为母本配制杂交组合构建F2遗传群体,结果表明,该卷叶性状由一对隐性核基因控制。选用F2代分离群体中的1215个隐性单株作为定位群体,将RL13定位在第6染色体短臂上分子标记RM276和SWU6-1之间,遗传距离分别为1.1cM和0.2cM。

单分子定位超分辨显微成像技术研究进展及展望(特邀综述)

随着新型荧光探针、先进激光、高灵敏光电探测器等相关领域的不断发展,突破衍射极限的超分辨光学显微技术为现代生物医学研究提供了新的有力工具,其中的单分子定位技术利用荧光分子的光开关效应,实现了亚细胞结构的纳米精度超分辨成像.本文介绍了单分子定位超分辨显微技术的基本原理与实现,例举了其在细胞生物学、组织生物学以及神经科学等方面的应用,讨论了该技术目前的发展趋势及可能的改进方向,为相关领域科学研究提供参考.超分辨光学显微技术的不断创新将推动生命科学的新发展.

水稻光温敏雄性核不育系广占63S不育基因PTGMS2-1的遗传分析与分子定位

水稻光温敏雄性核不育系广占63S的不育基因来源于光敏核不育系农垦58S,其育性转换表现为温敏型,是迄今两系杂交水稻中应用最广泛的籼型光温敏核不育系之一。对广占63S/旱1587组合的F2分离群体进行不育基因的遗传分析,结果表明广占63S的不育性受1对隐性不育基因控制。利用SSR和InDel分子标记技术,结合BSA法,以广占63S与旱1587组合的F2分离群体为材料,将不育基因(暂命名为PTGMS2-1)定位于第2染色体标记S2-4与S2-27之间物理距离390kb的区间内,与两标记间的遗传距离分别为0.5和1.1cM,与标记S2-24共分离。

水稻多分蘖突变体ht1的遗传分析和分子定位

在水稻品种新稻18中发现了一个多分蘖植株,经过多代自交获得了稳定的多分蘖突变株,突变体ht1在整个生育期最显著的特点就是分蘖数目多,是其野生型新稻18的3倍以上。遗传分析表明该基因受1对显性核基因控制,命名为HT1。利用微卫星标记将HT1初步定位于第10号染色体RM25435和RM25552之间,进一步利用极端个体定位法把HT1精细定位于标记RM25523和RM25532之间,HT1基因距它们的遗传距离均为0.05cM,这两标记间的物理距离约为130kb。

抗条锈病基因YrCH5026的遗传分析及分子定位

CH5026是携带中间偃麦草抗病基因的渗入系。为了更好地利用CH5026,拓宽小麦抗性育种资源,对其抗条锈性来源和遗传模式进行了分析,对抗性基因进行了染色体定位并构建了遗传连锁图谱。在苗期和成株期对CH5026及其亲本分别接种条锈菌流行小种CYR31、CYR32和CYR33。结果表明,CH5026在苗期和成株期对这3个条锈菌小种均表现出免疫或近免疫,且与其抗性供体TAI7045及其野生亲本中间偃麦草抗病侵染型相似。对其与感病品种(系)的杂交后代F1、F2、F2:3和BC1群体接种CYR32进行成株期抗性遗传机制分析,证实CH5026对CYR32的抗性由1对显性核基因控制。基因组原位杂交未检测到外源DNA杂交信号。用569对SSR引物对CH5026/台长29的192个F2群体进行分析,发现3个与抗性基因连锁的SSR标记:Xgwm210、Xwmc382和Xgpw7101,抗性基因位点与两翼邻近连锁标记Xwmc382和Xgpw7101的遗传距离分别为6.0,4.7 c M。利用中国春缺四体、双端体材料将该基因及其连锁标记定位在染色体2AS上。通过基因来源及连锁分子标记多态性比较,这个抗条锈病基因与已知定位于染色体2AS上的抗性基因不同,很可能是一个新的抗条锈病新基因,暂将其命名为Yr CH5026。

水稻光温敏雄性核不育系45S不育基因的分子定位

水稻光温敏雄性核不育系45S的育性转换受光长和温度的互补作用调控。对45S(Oryza sativa L.ssp.indica)/YC169组合的F2、BC1F1和F2和BC2F2进行不育基因的遗传分析,结果表明45S的育性是由1对隐性不育基因控制。利用SSR分子标记技术,结合BSA和RCA法,以45S与YC169的杂交F2和BC2F2作为分离群体,对不育基因进行定位,结果发现不育基因(暂命名为GTMS)位于RM6378和RM12847之间,遗传距离分别为8.5cM和8.2cM。

水稻苗期耐冷性相关QTL qCTS3-1的鉴定和分子定位

低温会影响水稻正常的生长和发育,增强耐冷性已成为水稻育种的主要目标之一.为了鉴定和定位水稻耐冷性相关位点,本研究以广陆矮4号（受体）与日本晴（供体）杂交获得的染色体片段代换系群体中的1个低温敏感株系C32022为材料,测定低温处理后植株存活率,采用代换作图法在水稻第3染色体上定位一个控制水稻苗期耐冷性的QTL,命名为qCTS3-1.利用C32022和广陆矮4号衍生的F2分离群体进行遗传分析,结果显示,该群体中叶片表现正常绿色与叶片表现出黄色、萎蔫单株比例符合1∶3分离比,表明耐冷性受单个主效QTL控制.来自日本晴的等位基因能够增加植株对低温的敏感性.利用该群体中86个隐性单株将qCTS3-1初步定位在分子标记WZD-S3-7～WZD-S3-11,物理距离约为550 kb.

莱茵藻胞外碳酸酐酶分子定位与活性诱导

胞外碳酸酐酶是藻类CCM机制和光合作用的一个重要组分 ,藻类从高CO2 转入低CO2 浓度培养时可诱导出胞外碳酸酐酶。应用金标免疫分子定位和pH调节对胞外碳酸酐酶分子定位和CO2 诱导机制进行研究 ,结果表明 :胞外碳酸酐酶主要分布于胞壁空间 (细胞质膜与细胞壁之间 ) ,且细胞壁上也有较多分布 ,细胞壁外分布较少。说明胞外碳酸酐酶能从胞壁空间穿过细胞壁。通过CO2 诱导和pH调节(升高 ) ,均可提高碳酸酐酶活性 ,且pH提高幅度越大 ,胞外碳酸酐酶活性也越大 ,说明胞外碳酸酐酶的CO2

小麦新抗源CH5383抗条锈病基因的遗传分析及分子定位

CH5383是新育成的源于中间偃麦草的渗入系,对小麦条锈病和白粉病均表现免疫。为明确其抗性来源、遗传方式和抗病基因在染色体上的位置,将CH5383的系谱材料及其与高感条锈病品种(系)杂交的F1、F2和F2:3家系群体进行条锈病抗性鉴定。结果表明,CH5383对条锈病的抗性源于中间偃麦草,对条锈病生理小种CYR32的抗性由一对显性核基因控制,将此基因暂时命名为YrCH5383。从476对SSR引物中筛选到3对引物Xgwm108、Xbarc206和Xbarc77与抗病基因连锁,遗传距离分别是8.2 cM、10.7 cM和13.6 cM。根据这两对标记在染色体上的位置,将抗病基因定位到3B染色体的长臂上。3B染色体的长臂还未见有正式命名的抗条锈病基因的报道,推测YrCH5383可能是一个源于中间偃麦草的新抗条锈病基因。

水稻光温敏雄性核不育系扬稻6号S不育基因的遗传分析与分子定位

扬稻6号是目前两系杂交籼稻生产中应用面积最大的恢复系，通过“实践八号”育种专用卫星搭载扬稻6号进行航天诱变，筛选出一个光温敏雄性核不育系扬稻6号S。以扬稻6号S与井冈旱稻1号杂交并回交的F2及BC2F2为定位群体进行不育基因的遗传分析。结果表明：扬稻6号S不育性受1对隐性不育基因（暂命名为ptgms2—2）调控，该不育基因被定位于第2染色体标记InDel2-4085和1nDel 2-5846之间，物理距离为200kb。对候选基因进行测序分析，发现在开放阅读框内起始密码子下游70～71bp处存在差异，扬稻6号为GC，扬稻6号S为TA，2个碱基突变导致密码子由GCG变为终止密码子TAG。