分子杂交策略设计的喹诺酮类抗菌化合物进展

喹诺酮类化合物是一类广泛用于细菌感染临床治疗的药物,部分药物是特定感染的首选治疗药物。随着抗菌药物的长期使用,具有新型结构的化学合成抗菌药物的研究与开发很有必要。采用分子杂交策略将两种生物活性片段糅合,可得到对靶标活性更高或作用多个靶标的新化合物,提高体内药物对疾病的整体活性,实现“1+1>2”的效果。综述了喹诺酮类抗菌药的作用机制和构效关系,概述了分子杂交策略下得到的新型喹诺酮类抗菌化合物的进展以及对喹诺酮类化合物进行优化的研究进展。

原位分子杂交中脱片问题浅析

核酸分子杂交技术是当今分子生物学研究的重要手段.原位分子杂交技术是分子生物学和组织化学结合的成果,能准确定位组织细胞内的特定基因表达.但分子杂交实验操作步骤繁琐,实验周期长,条件要求高,涉及实验试剂多,常常因为很小的因素而导致实验失败.原位分子杂交实验中,所有的操作均是针对载玻片上的目的组织进行的,因此,实验中的脱片就是常常困扰实验者的一个问题[1～3].在此,笔者根据自己的实际操作经验和资料研究,对脱片问题进行简单分析,以求对实验有所帮助.

分子杂交技术用于喉乳头状瘤病因学的研究及其意义

核酸分子杂交（nucleic acid molecuiar hybridization，NAMH)是分子生物学正在迅速发展的新技术，用于病毒基因与肿瘤形成的某些机制的研究已取得重要进展，人乳头瘤病毒（HPV）是近年来颇受重视的一类致瘤病毒，研究表明，HPV在内皮细胞瘤和鳞状细胞瘤病因学上起到重要作用，与泌尿生殖系，

DNA修饰电极的研究(ⅠΧ)——DNA探针在金基底上的固定、表征及其表面分子杂交

采用巯基化合物自组装 /共价键合反应的逐层固定方法将双链 DNA固定到金表面得到 DNA修饰电极 ,并对该电极表面进行了电化学和 X射线光电子能谱表征 .研究了电极表面固定化 DNA的表面分子杂交 .

梨S基因芯片的试制及分子杂交条件的优化

为研究寡核苷酸芯片在确定梨品种S基因型中的应用价值,根据梨自交不亲和基因的结构特点设计了部分S基因的检测探针,并制成寡核苷酸芯片;采用引物Cy3荧光标记法标记检测样品的PCR产物并进行杂交,以检测不同样品的S基因型。结果表明:通过对不同杂交温度、杂交时间等的探索获得了较好的反应条件并用制备的芯片检测了已知S基因型的梨样品,检测结果与各品种的已知基因型相符。证明寡核苷酸芯片检测梨品种的S基因型是一种切实可行的检测方法,若对芯片进一步完善,则在今后梨自交不亲和性状的机理研究及梨自交不亲和性状的利用等方面将有着广阔的应用前景。

原位分子杂交检测上海真厉螨与柏氏禽刺螨体内肾综合征出血热病毒的研究

目的：提供革螨传播肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）的分子生物学证据。方法：用上海真厉螨与柏氏禽刺螨叮咬ＨＦＲＳＶ接种乳小鼠，取叮咬后ｄ１０及ｄ１００以上的上海真厉螨与柏氏禽刺螨冰冻切片，用地高辛标记ＨＦＲＳＶｃＤＮＡ核酸探针原位分子杂交检测其体内病毒ＲＮＡ。结果：叮咬野鼠型（７６－１１８株）接种乳小鼠后ｄ１０上海真厉螨检出病毒ＲＮＡ，在细胞浆、细胞核中及核膜上呈细密颗粒状或全浆阳性，见于生殖器官细胞、胃及支囊上皮细胞及脑皮质细胞；叮咬家鼠型（ＵＲ株）病毒接种乳小鼠后ｄ１２螨亦检出病毒ＲＮＡ，病毒的细胞组织分布与野鼠型相同；分别检测野鼠型螨３１只和家鼠型２３只，其中阳性分别为１７只和１０只；叮咬野鼠型病毒接种乳小鼠后ｄ１３２，家鼠型ｄ１０２螨仍能检出病毒ＲＮＡ。柏氏禽刺螨叮咬野鼠型病毒接种乳小鼠ｄ１０，检测螨２０只，其中阳性１２只，病毒ＲＮＡ主要分布于生殖器官细胞内。结论：上海真厉螨与柏氏禽刺螨均可经叮咬获得ＨＦＲＳＶ，上海真厉螨可分别感染野鼠型和家鼠型ＨＦＲＳＶ，野鼠型在螨群体内至少可维持１３２ｄ，家鼠型１０２ｄ，具有贮存两型病毒的作用，是ＨＦＲＳＶ的适宜媒介和贮存宿主，在动物宿主间交叉传播两型ＨＦＲＳＶ中?

核酸分子杂交技术鉴别和检测家蚕微孢子虫的研究

为了将家蚕微孢子虫 (N .b .)从蚕业生产中流行的 10多种病原性微孢子虫中鉴定出来 ,并对其发病程度进行检测 ,用PCR技术合成了一段 317bp的DNA片段 ,将其克隆到大肠杆菌E .coliDH5α中 ,并大量制备该片段 ,用地高辛 (DIG)标记成探针 ,经点杂交和Southern杂交检测 ,发现该片段为N .b .所特有。该探针为N .b的特异性检测探针 ,灵敏度可达 1ngDNA水平。对蚕业生产上的带毒蚕蛾和蚕卵的模拟检测证明 ,该DIG探针可将N .b发病初期的带毒蚕蛾和蚕卵检出 。

应用电镜原位分子杂交技术对腺病毒DNA在宿主细胞内进行定位

以Biotin标记的dATP(Bio-7-dATP)通过缺刻翻译(Nick Translation)制备腺病毒的基因组探针,建立了电镜原位杂交技术,并研究腺病毒感染的HeLa细胞内病毒DNA的分布。结果表明,免疫胶体金颗粒特异地标记在腺病毒感染的细胞核内,并且在核内呈区域性分布。整装抽提后的细胞原位杂交结果显示出,胶体金颗粒呈族状马串珠状结合在核骨架上,从而在形态学上证实了腺病毒DNA与核骨架的紧密结合关系。

应用核酸原位分子杂交法检测弓形虫SAG1抗原基因在免疫小鼠体内的表达

PCR扩增RH株弓形虫抗原基因SAG1编码序列 ,构建pcDNA3 -SAG1重组表达质粒。DNA免疫接种小鼠 ,3周后处死动物 ,取注射部位肌肉作冰冻切片 ,用原位分子杂交方法检测弓形虫 pcDNA3 -SAG1重组质粒在免疫小鼠肌肉内的表达。结果PCR扩增出SAG1编码区目的基因 ,片段大小为 10 2 0bp。测序、酶切分析表明构建的 pcDNA3 -SAG1重组表达质粒含有扩增的基因。利用原位分子杂交在免疫接种 pcDNA3-SAG1的小鼠骨骼肌中检测到紫蓝色的阳性杂交信号 ,提示局部肌肉有目的基因mRNA转录的发生。

ERIC-PCR分子杂交技术分析大熊猫肠道菌群结构

目的 了解大熊猫肠道微生物区系结构的相似性和稳定性,并找出大熊猫肠道微生物群落结构的变化与健康状况的关系。方法 对上海动物园及上海野生动物园所饲养的3只大熊猫2次采集的粪便样品进行微生物群落总DNA的抽提,并以此为模板获得反映肠道微生物群落结构特征的ERIC- PCR和Southern杂交指纹图谱,比较各DNA样品指纹图谱的相似性指数。结果 除国庆(大熊猫)的第1次采集的样品(当时处于腹泻状态) ,其他各DNA样品的ERIC- PCR及Southern杂交指纹图谱的相似性都达到85 %～10 0 % ;佳斯及川川(大熊猫) 2个个体2次采集的样品之间ERIC指纹图谱的相似性分别为93%和87% ,而国庆腹泻时的样品与健康时的样品之间则为71%。结论 大熊猫不同个体之间肠道微生物群落结构比较相似,而且同一个体在不同时期表现出比较高的稳定性,但当个体的健康出现问题时肠道优势菌菌群结构有一定波动。所采用的DNA提取方法、ERIC- PCR和Southern杂交指纹图谱的高度重复性证明了之一分子生态学技术在大熊猫肠道微生物区系动态监测中的可行性。

原位分子杂交法检测恙螨体内肾综合征出血热病毒核酸的研究

为探讨肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）在恙螨体内的分布和定位，采用原位分子杂交技术检测恙螨体内ＨＦＲＳＶＲＮＡ。结果发现：原位分子杂交技术的检出阳性率较ＩＦＡＴ高；ＨＦＲＳＶ阳性信号颗粒呈弥散分布，多见于恙螨幼虫和若虫的腹部组织细胞内，该部位是恙螨的卵巢细胞、中肠及支囊上皮细胞。前体组织细胞内少见；个别幼虫和若虫的前足和中足细胞内亦可见到ＨＦＲＳＶＲＮＡ阳性信号。在原位分子杂交中，若虫组织细胞内的ＨＦＲＳＶＲＮＡ阳性信号较幼虫密集而且量多。

原位分子杂交图象中银粒的分割方法研究

图象分割是图象处理的一个基本技术。运用一种改进的快速Ｏｔｓｕ阈值分割法，并结合其它处理方法对原位分子杂交图象中的银粒进行分割。实验结果表明，该方法在精度和速度方面有其优势，适合于对原位分子杂交图象中银粒的自动分割。

原位分子杂交研究肾综合征出血热尸检组织中汉坦病毒M和SRNA的分布

本文以核酸原位分子杂交法研究了国内不同地区ＨＦＲＳ尸检病例组织中病毒ＲＮＡ的分布和定位。结果在１９例病例组织中均可检测到病毒ＲＮＡ。陕西及沈阳地区病例，阳性部位主要是各脏器上皮及实质细胞。江西地区病例，病毒ＲＮＡ主要出现于各脏器组织内血管壁及毛细血管内皮细胞。广州一例，病毒ＲＮＡ主要分布于肝脏灶性溶解性坏死区域，肺泡壁和肾间质血管等部位。病毒ＲＮＡ主要定位于细胞胞浆，呈颗粒状或全浆阳性，也出现干部分组织少数细胞胞核中。此外，病毒ＲＮＡ还出现于细胞外液和红细胞表面。结果说明，ＨＦＲＳ病毒具有泛嗜性感染及上皮性组织或血管内皮细胞易感的特点，后者可能取决于不同地区ＨＦＲＳ病例所感染的病毒的血清型或毒株不同，从而引起不同类型ＨＦＲＳ及其病理和发病机理的差异。

NT-3 mRNA分子杂交在胚胎脊髓修复成鼠受损脊髓过程中的变化

为了从神经营养因子角度探讨移植修复机理，将大鼠１４ｄ胚胎脊髓（ＥＳＣ）植入急性损伤成鼠脊髓后１、３、５、７、１０、１５和３０ｄ，用原位杂交和斑点杂交技术对ＥＳＣ和宿主脊髓（ＨＳＣ）内ＮＴ－３ｍＲＮＡ的变化进行定性和定量观察。定性观察显示，在正常脊髓内，ＮＴ－３ｍＲＮＡ以前角运动神经元和少量胶质细胞分布为主；脊髓损伤以后，杂交产物扩大到中小型神经元，同时更多的胶质细胞参与了反应；ＥＳＣ植入后，除移植物本身继续表达外，宿主脊髓阳性反应神经元和胶质细胞数量进一步增加。定量结果表明，损伤组原位杂交和斑点杂交的反应强度明显高于正常组；而移植组的分子杂交反应又在很多时相点上显著高于损伤组。除此而外，分子杂交反应在损伤组和移植组内持续的时间也不相同，前者的最强反应期为术后７ｄ，后者为术后１０～１５ｄ．我们认为，移植的ＥＳＣ除为自身和ＨＳＣ提供神经营养外，也诱发了ＨＳＣ在发生过程中曾经拥有的合成机制，以增强ＮＦ表达的方式为自身再生提供营养，同时也为移植物的发育分化提供合适的营养环境。

分子杂交法快速鉴定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的初步评价

目的评价结核分枝杆菌鉴定试剂盒（分子杂交法）进行分枝杆菌菌种初筛的准确性,并探讨如何快速准确地鉴定结核分枝杆菌复合群（MTC）和非结核分枝杆菌（NTM）混合感染标本.方法采用分子杂交法对200株结核分枝杆菌临床分离株进行菌种鉴定.人工制备结核分枝杆菌和胞内分枝杆菌、结核分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、结核分枝杆菌和偶发分枝杆菌的混合感染模型,评价基因测序法、芯片法和Haintest在检测分枝杆菌混合感染中的准确性.结果以对硝基苯甲酸（PNB）分离鉴定结果为参照,分子杂交法的敏感性和特异性分别为65.12%（65/86）和98.25%（112/114）.对于人工制备的13种不同比例混合的H37Rv和NTM,芯片法和Haintest均可以准确鉴定出混合感染标本中的混合菌种,而基因测序结果表明,H37Rv：偶发分枝杆菌的比例在10% ～90%范围内才能区分出混合感染的类型.结论分子杂交法对于结核分枝杆菌诊断有较高的特异性,一旦经该法鉴定为NTM,则具有很高的诊断意义.明确标本中存在混合感染后可以采用芯片法或Haintest对临床上高致病的分枝杆菌进行菌种水平的鉴定.

HBV感染者胃十二指肠粘膜HBV DNA地高辛原位分子杂交研究

目的 :探讨 HBV在胃十二指肠粘膜的分布、复制、表达及其意义。方法 :应用地高辛原位分子杂交法检测 6 2例 HBV感染者胃十二指肠粘膜 HBV DNA的分布状态 ,并与血清 HBVM、胃十二指肠粘膜 HBs Ag、 HBc Ag、肝炎病情程度进行相关分析。结果 :6 2例 HBV感染者 ,2 7例 (4 3.5 5 % )胃肠粘膜检出 HBV DNA,检出率与肝炎病情程度、血清 HBs Ag、HBe Ag无明显相关 ,与血清 HBV DNA、胃肠粘膜 HBs Ag、HBc Ag密切相关 ;胃肠粘膜 HBV DNA的表达表现为 4种模式。结论 :HBV DNA可在胃肠组织原位复制 ,其不同的表达模式反映了病毒复制或整合的状态。

丁型病毒性肝炎的原位分子杂交及免疫组化研究

利用原位分子杂交和免疫组化方法对１４２例乙型肝炎活检肝组织进行丁型肝炎病毒ＲＮＡ及其抗原的定位研究。２８／１４２例丁型肝炎病毒标记阳性。其中慢性重症型６例；慢性活动性１７例；慢性持续性５例。慢性活动性乙肝重叠丁型肝炎病毒感染组发生早期肝硬变的比例明显高于无重叠感染组（Ｐ＜０．０５）。２８例丁型肝炎病毒感染肝组织１９例ＨＢｃＡｇ阳性，并以核浆型为主，提示活动性ＨＢＶ复制与ＨＤＶ感染的正相关性，两者相加作用导致肝损害加重并加速发展为肝纤维化。ＨＤＶＲＮＡ在肝细胞内大量蓄积，ＨＤＡｇ在碎屑状坏死边缘肝细胞或气球样变肝细胞内呈浆膜型分布，提示ＨＤＶ直接细胞毒在丁型肝炎发病学中的作用。

高粱DNA甲基化变异的分子杂交验证

以2个高粱(Sorghum bicolor L.)亲本纯系及其F1杂交种为材料,利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)方法,对DNA甲基化水平和模式的遗传和变异进行了研究。结果表明:亲本纯系的大部分胞嘧啶甲基化位点稳定遗传给其F1杂交种,但3.94%的位点表现出了变异,即未从亲本遗传给杂交种,并通过Southern杂交方法进一步验证了杂交种和纯系亲本间的DNA甲基化模式的遗传和变异。

土壤微生物PCR及分子杂交检测

ＰＣＲ技术在环境微生物的检测方面已得到越来越广泛的应用，Ｓｔｅｆａｎ等［１］利用ＰＣＲ技术检测土壤中的转基因细菌，后来用于检测土壤中不可培养的微生物［２］，跟踪环境中的特定细菌或ＤＮＡ［３］，揭示土壤生态系统的基因多样性［４］等。利用ＰＣＲ技术来检测...