大鼠原代脑微血管内皮细胞体外分离与培养的实验研究

目的探讨获取大鼠脑微血管内皮细胞（BMEC）的简单、有效方法,为构建体外血肿瘤屏障（BTB）模型提供材料。方法采集出生3~5 d的Wistar胎鼠大脑皮质,应用酶消化法及葡聚糖离心法获得脑微血管段后,接种于培养皿中进行原代培养,采用倒置显微镜对所培养的细胞进行形态学观察;以Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色法鉴定细胞;将BMEC与C6脑胶质瘤细胞共培养,构建体外BTB模型,并采用免疫组化法和免疫荧光法检测BMEC间紧密连接相关蛋白occludin的表达。结果体外培养2 h时脑微血管段贴壁,12-48 h见圆形生发中心形成,2-3 d单层内皮细胞自生发中心长出,4-5 d见较大单层内皮细胞团,5-7 d可见融合成片的内皮细胞单层,外观呈＂铺路石＂样;第Ⅷ因子免疫组化结果显示＂铺路石＂样细胞胞质呈棕黄色染色;紧密连接相关蛋白occludin的免疫组化和荧光结果证明共培养的BMEC间表达BTB的特性。结论本方法能成功地进行大鼠原代BMEC培养,构建大鼠体外BTB模型,进而应用于BTB的生理、生化及药理学研究。

ICR小鼠胚胎干细胞的分离与培养

为了研究不同条件对ICR小鼠ES细胞的影响，试验以12．5～13．5dICR小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）为饲养层，以3．5dICR小鼠胚胎为试验材料，探讨了血清、生长因子及传代方法对ICR小鼠Es细胞分离培养的影响。结果表明：采用含15％FBS的Es细胞培养液的囊胚贴壁率及ICM增殖率（79．3％，69．0％）均比含15％KSR、5％FBS＋10％KSR的细胞培养液高（42．9％，28．6％；75．0％，54．2％），Es细胞最高传至6代；培养液中添加10．g／m LLIF＋10ng／mLSCF的效果比单独添加1种因子的效果好，最高传至6代，高于单独添加1种因子的传代数（4代，2代）；用3种传代方法进行传代时，采用差异贴壁法传代效果最佳，最高传至8代，酶消化法传至4代，机械加酶消化法传至6代。

胸水乳腺肿瘤干细胞的分离与培养

肿瘤干细胞也称肿瘤起源细胞（cancer stemcells or tumorinitiating cells,TICs）,研究它是近几年发展迅速的新型细胞生物技术,对探寻根治肿瘤的新方法具有重要的意义,目前已分别分离出乳腺肿瘤干细胞、结肠癌干细胞、脑肿瘤干细胞等多种肿瘤干细胞。本文探讨用乳腺癌转移患者胸水进行乳腺癌干细胞的分离与培养。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养方法优化

目的建立一个分离、培养、纯化大鼠的骨髓间充质干细胞的方法。方法使用贴壁法分离大鼠的骨髓间充质干细胞,通过培养初期的频繁换液和传代过程中减少胰蛋白酶的暴露时间,达到骨髓间充质干细胞的纯化。流式细胞仪检测细胞表面标志物,MTT法检测细胞生长状况,暴露于不同的诱导培养基使细胞成骨、成脂,并向肝胆系分化。结果分离所得的细胞阳性表达CD29、CD44、CD90,而对于造血细胞标志物CD45呈阴性。在成骨、成脂培养基的诱导下,细胞ALP、茜素红、油红O染色均呈阳性,并发现传至10代的细胞仍保持分化功能。将骨髓间充质干细胞贯续暴露于不同的细胞因子和激素,得到了表达肝细胞、胆管上皮细胞特异标志的子代细胞。结论通过改良后的方法可以高效、简洁地分离出形态均一的大鼠骨髓间充质干细胞,并能够向多胚层的细胞分化。

人骨髓间充质干细胞分离培养方法的改进

背景:当前分离培养骨髓间充质干细胞方法的有多种,但在外科手术中进行获取的方法仍然较少,而外科分离所得细胞对于相应疾病的具有揭示原因和提供研究线索的价值。目的:在骨科手术中以直接贴壁差速贴壁分离培养纯化与鉴定骨髓间充质干细胞。方法:在骨科关节置换等大手术中吸取少量人骨髓血,采用直接贴壁法分离骨髓间充质干细胞,在贴壁后36～48h行洗盘处理,并通过长期体外培养,特定培养基自身的筛选作用对细胞进行筛选,当细胞生长达到足量时进行鉴定。结果与结论:采用直接贴壁法能够在长骨髓腔内混合血中分离培养骨髓间充质干细胞并形成集落,其形态学表现和表面分子经鉴定符合骨髓间充质干细胞特点,能够获得符合要求的人骨髓间充质干细胞,从而进行后续实验。

胎肝细胞的分离培养及其功能的研究

目的 探讨人胎肝细胞分离、培养的简单方法并证实其具有近似正常肝细胞的功能。方法 取水囊引产中期（4～6月龄）妊娠死胎，用两步灌注法分离胎肝细胞，观察细胞形态及存活情况，并以正常成人肝组织作正常对照，检测胎肝细胞五种基因的表达，进行光密度分析。结果 经台盼蓝染色、FDA荧光染色观察，细胞培养后11天内均存活良好，最长可存活18天；新鲜分离、培养3、5、7、10天组胎肝细胞均可表达GAPDH（Glyceraldehyde Phosphate Dehydrogenase磷酸甘）由醛脱氢酶）、ALB（Albumin白蛋白）、GS（Glutamine Synthetase谷氨酰胺合成酶）、CK（Cytokeratin细胞角蛋白），经光密度分析证实，上述四种基因在培养肝细胞和正常成人肝细胞中的表达无明显统计学差异；AFP（Alpha Fetoprotein甲胎蛋白）基因表达明显强于正常肝细胞，并且于培养5天后呈显著的减弱。结论经分离、培养的人胎肝细胞存活良好，具有和正常成人肝细胞类似的基因表达。

1株感染洛氏鱥呼肠孤病毒的分离与培养

利用细胞培养技术从养殖发病洛氏鲅中分离出1株病毒，经人工感染试验、电镜观察、核酸基因组SDS-PAGE电泳、RT—PCR检测确认为呼肠孤病毒。人工感染发病的症状与自然发病症状相同；病毒感染可使鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）产生典型细胞病变效应，收集细胞上清，负染后电镜下可观察到大小均一，直径约70nm，近球形，无囊膜结构的病毒粒子，初步判断为呼肠孤病毒；病毒基因组SDS-PAGE结果表明，病毒基因组由11个分段的RNA核酸片段组成，为典型的水生呼肠孤病毒核酸带型。病毒基因纽$10节段RT-PCR结果表明，有特异性条带，其与GenBank中登录的呼肠孤病毒S10节段（JN206665．1）序列同源性为91％，该分离株应为呼肠孤病毒，本研究首次在洛氏缄鱼内分离到呼肠孤病毒。

单细胞分选技术在微生物分离与培养中的应用与展望

自然界相当多的微生物是未培养的,对这些“微生物界暗物质”进行研究,对于研究微生物的进化过程,充分利用微生物资源具有重要意义。对未培养微生物的分离与培养已成为当前国际研究热点,本文对显微操作、荧光活化分选、微流控分选、光镊技术、激光诱导向前转移等可用于微生物分离与培养的技术原理、发展历程进行简单介绍,对比分析了每种分选技术的优点与不足,重点阐述了激光诱导向前转移技术应用于微生物分离的技术优势,并进一步对未来应用于未培养微生物的研究进行了初步展望。

小鼠胃Cajal间质细胞分离与培养实验方法探讨

目的:尝试优化体外培养Balb/c小鼠胃Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)的实验方法,为深入探索该细胞的生理病理作用机制提供基础。方法:无菌条件下取出小鼠胃组织,使用酶解法消化分离细胞,将细胞悬液接种于含有SCF(干细胞因子)的M199培养基中培养,并进行传代。倒置显微镜下观察不同时间段细胞生长状态,采用ICC特异性标志物c-Kit(酪氨酸激酶受体)进行免疫荧光鉴定。结果:细胞培养24 h后基本已贴壁,呈梭形或三角形,有短突起;72 h后细胞胞体变大,突起伸长;5 d后,细胞之间通过突起彼此相互连接,开始形成网状结构;传代后细胞依然保持其固有特征。免疫荧光鉴定可见细胞c-Kit抗体荧光染色阳性。结论:使用酶解法成功分离细胞,细胞数量较多但不增殖,传代后可见细胞纯度较好,稳定培养3周以上后细胞形态逐渐发生变化并开始凋亡。

人脐带血内皮祖细胞与血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共培养及其增殖和迁移能力

背景:目前组织工程心脏瓣膜再内皮化种子细胞主要来源于成熟内皮细胞,内皮祖细胞作为内皮细胞的前体细胞越来越受到人们的关注。目的:分离和扩增人脐带血内皮祖细胞,观测其体外生物学特性。方法:密度梯度离心法分离新鲜的脐血中单个核细胞,在含血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的培养液中培养扩增,通过形态学、免疫荧光和流式细胞仪等对贴壁细胞进行鉴定;并与脐静脉内皮细胞进行增殖和迁移能力比较。结果与结论:随着培养和诱导时间延长,贴壁细胞形态发生明显的改变,从小圆形变成梭形,逐渐分化成典型成熟内皮细胞的鹅卵石样形态,并可形成特征性的克隆;体外诱导7d后90%以上贴壁细胞呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双阳性;贴壁细胞流式细胞仪分析显示:培养7d的细胞VEGFR-2、CD34和CD133表达分别占(77.4±4.9)%、(52.4±6.6)%和(19.4±2.1)%,培养28d的细胞VEGFR-2和CD34表达分别占(81.1±7.4)%和(7.6±3.1)%,而未检测到CD133表达;人内皮祖细胞增殖和迁移能力明显高于人脐静脉内皮细胞(P<0.05),并且细胞数量可扩增达109L-1。结果显示用密度梯度离心法和贴壁筛选法,可从人脐带血分离、纯化内皮祖细胞;内皮祖细胞可诱导分化为内皮细胞,增殖和迁移能力都很强。

泌尿生殖道支原体固体培养基的研制及临床应用

研制一种适合临床检测泌尿生殖道支原体的固体培养基,进行初步的临床应用。本文参考相关支原体固体培养基配方,改良营养成份和抑菌剂,并与生物梅里埃IST2肉汤和A7固体培养基进行比较。结果显示自制支原体固体与液体培养基在16 h和20 h时间段的阳性检出率均优于相应对照培养基,自制液体培养基与IST2抑菌效果基本一致,自制固体培养基与A7培养基有较好的一致性且差异无统计学意义,表明自制支原体固体培养基培养具有简便、快速、准确等优点,适合基层单位使用。

鸡自然杀伤细胞的分离与免疫表型分析

为研究鸡自然杀伤(NK)细胞,本实验采用冷胰酶消化法消化14日胚龄鸡胚脾脏组织,分离收获鸡胚脾脏淋巴细胞,在含有重组鸡白介素-2和条件培养基的IMDM培养液中培养48 h,收获悬浮细胞,暂时命名为TCR0细胞(即鸡NK细胞)。流式前向角和侧向角分析显示培养的TCR0细胞中85.1%的细胞大小均一,颗粒度一致;瑞氏吉姆萨染料染色结果表明TCR0细胞内一侧含有嗜酸性大颗粒,符合鸡NK细胞的形态特征;流式细胞术单克隆抗体染色结果显示,TCR0细胞中,97.4%高表达MHCⅠ类分子,30.8%低表达CD8a,不表达T细胞表面标记CD3和B细胞表面标记CD4和Bu-1,符合鸡NK细胞表面标记特点。本实验是国内成功分离并纯化鸡NK细胞的首次报道。

仔猪大肠杆菌的分离鉴定试验

从新乡、辉县等地采集20例有腹泻症状,疑似大肠杆菌病病猪的粪便,病料采集后经麦康凯、伊红美蓝分离培养,再经肉汤纯培养,后采用生化试验进行分离鉴定.试验结果表明,分离出10株细菌,其特征为:在麦康凯平板上有光滑圆形隆起的粉红色菌落生长,在伊红美兰平板上有黑色带金属光泽的圆形菌落生长,普通琼脂和血琼脂上为光滑、圆形、湿润无色菌落,镜检为革兰氏阴性短小杆菌.对这10株大肠杆菌进行血清型鉴定,结果表明有1个血清型O138.该试验为临床上预防,治疗大肠杆菌病提供了理论依据.

硫酸盐还原菌的驯化及脱硫性能研究

对内蒙古某地工业污泥分离出的硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)-DYB2菌种进行SO24-离子、电厂脱硫尾液的环境适应驯化并分别进行SO24-脱除试验。首先采用3000～9000mg/L的SO42-驯化DYB2,在38℃、pH值为7.2、菌株接种量为10%及厌氧条件下,72h后,溶液中SO24-的去除率为69.5%～76.9%,净去除量为2307～6255mg/L;改变菌株接种量,在38℃、pH值为7.2,处理含SO24-1000～4000mg/L的脱硫尾液。当接种量为20%时,SO24-1000mg/L去除率最高,达到83.3%,净去除量最高达到2140mg/L。结果表明,接种量相同,脱硫尾液中2SO4-浓度增加,净去除量增加,但去除率降低;同浓度SO42-脱硫尾液,接种量愈高,去除率与净去除量愈多。

绵羊原代Cajal间质细胞的分离培养与鉴定

采集美利奴绵羊的十二指肠,在解剖显微镜下剥去黏膜层及黏膜下层,剪碎后采用Ⅱ型胶原酶和胰酶消化并分离获得绵羊十二指肠原代Cajal间质细胞(ICC);传代培养后,通过倒置显微镜观察不同时间的细胞形态,使用反转录PCR和免疫荧光染色检测ICC特异性标记物c-Kit。结果显示,成功分离了ICC,且细胞在培养24 h后贴壁,呈现出其固有的形态。RT-PCR检测c-kit基因为阳性,免疫荧光染色鉴定ICC表达c-Kit蛋白。本试验成功分离ICC且传代后细胞稳定增殖生长,为后期开展病原微生物导致ICC改变造成胃肠道炎性病变提供材料。

牛羊肉中肠出血性大肠杆菌O_(157):H_7的检测

[目的]为青海省部分地区市售的羊肉、牛肉进行了大肠杆菌O157:H7的检测。[方法]样品先用mEC肉汤增菌,然后在选择性培养基TC-SMAC培养,再根据GenBank上已发表的大肠杆菌O157:H7rfbE、fliC和eacA抗原基因的保守序列设计3对引物,进行多重PCR鉴定,将可疑菌接种于MUG-LST,进行微量生化试验鉴定。[结果]在各1株牛、羊肉分离菌中多重PCR同时扩增出了大小为678、560和368 bp的3条特异性条带,分离菌的生化反应特性符合大肠杆菌的特征。[结论]在羊、牛肉各1份样品中检出了E.coli O157:H7。

天津某规模化猪场一例仔猪水肿病的诊断分析

2015年9月于天津某规模化猪场发现疑似仔猪水肿病病例,经无菌采集病变明显的组织器官,通过细菌分离与培养、镜检、生化鉴定、病毒培养等实验室检测方法进行综合诊断,同时结合病猪的流行病学调查、临床症状和病理剖检变化,最终确诊为仔猪水肿病。药敏试验结果表明,该分离株大肠杆菌对头孢唑啉、多西环素等药物高度敏感。该结果为仔猪水肿病的临床快速诊断和用药提供了借鉴。

增骨Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号对体外破骨细胞的影响

为阐明增骨Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号序贯疗法治疗骨质疏松症的机理。从新生1天内的兔长骨骨干分离出破骨细胞,与骨磨片、盖玻片及添加增骨Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号后共同培养,用相差显微镜及光镜观察骨吸收陷窝形态与破骨细胞形态变化,并进行骨陷窝计数。结果显示增骨Ⅰ号明显增加吸收陷窝数目(P<0.01),破骨细胞形态小、数多、核少;增骨Ⅱ号明显抑制吸收陷窝数目(P<0.01),破骨细胞形态大、数少、核多;增骨Ⅲ号对破骨细胞无影响(P>0.05)。表明增骨Ⅰ号能激活破骨细胞活性,增骨Ⅱ号能抑制骨吸收,增骨Ⅲ号对破骨细胞无作用。

绵羊类胚胎干细胞的分离与克隆

从胚胎发育阶段、饲养层和培养体系等方面对影响绵羊类ES细胞分离、克隆效率的因素进行探讨。结果显示:致密桑葚胚和囊胚的ICM增殖率高于囊胚和孵化囊胚。绵羊类ES细胞在同源绵羊胎儿成纤维细胞(SEF)上生长比较缓慢,最终传代次数也低于小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)组。培养液中同时添加胎牛血清(FBS)和Knock-out血清替代品(KSR),绵羊类ES传至7代,添加了碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)后,最高可传至8代,而单纯添加KSR或FBS,分别传至4代和5代。对类ES细胞进行AKP染色、核型分析、体外分化试验,证实分离的类ES细胞符合ES细胞的主要特征,而且表达多潜能性细胞因子Nanog。由此认为,致密桑葚胚和囊胚更适合绵羊类ES细胞的体外分离和培养,而且MEF更适合于绵羊类ES细胞的分离传代,培养液中添加5%FBS和15%KSR,比较适合类ES细胞的分离传代,bFGF对绵羊类ES细胞的增殖具有促进作用。

致仔猪腹泻大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

为了查明本单位猪场仔猪腹泻的病原,试验采集5例有腹泻症状、疑似大肠杆菌病病猪的内脏,经LB培养基培养后接种到麦康凯平板分离培养,再经LB培养基纯培养,后采用生化试验进行分离鉴定。再进行药敏试验找出敏感药物,并针对性地选择有效药物,以期减少因盲目投药而引起药物的超量残留、耐药菌株的增多或交叉耐药,从而有效避免人为导致食品安全、环境污染的问题,最后提出防治措施。试验表明,此次分离到的4株大肠杆菌对抗生素的耐药性相当高,庆大霉素、林可霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、磺胺嘧啶钠、青霉素钾、红霉素、四环素对大肠杆菌的抑制和杀灭作用微乎其微。仅对链霉素、头孢拉定、阿米卡星敏感性强。