猪微小RNA⁃15b前体突变对其生物学加工过程及前体脂肪细胞分化的影响

基于在猪微小RNA⁃15b(miR⁃15b)前体(pre⁃miR⁃15b)基因位点第58位碱基上发现了1个C>T突变(+58C>T),本试验旨在探究此突变对微小RNA(miRNA)生物学加工过程以及对猪前体脂肪细胞分化的影响。试验通过构建野生型(pmR⁃miR⁃15bW)和突变型(pmR⁃miR⁃15bM)miR⁃15b过表达载体,分别转染猪原代前体脂肪细胞进行miR⁃15b的过表达试验,然后利用实时荧光定量PCR对比2组细胞pre⁃miR⁃15b和miR⁃15b成熟体的表达量,在体外细胞水平明确+58C>T对miR⁃15b生物学加工过程的影响;随后,诱导转染了不同基因型miR⁃15b过表达载体(pmR⁃miR⁃15bW和pmR⁃miR⁃15bM)的猪前体脂肪细胞成脂分化,利用实时荧光定量PCR对比2组细胞miR⁃15b靶基因叉头框蛋白O1(FOXO1)(可抑制脂肪细胞分化)以及成脂分化相关基因的相对表达量,同时结合油红O染色,明确此突变对猪前体脂肪细胞分化的影响。结果表明:2组细胞miR⁃15b初级转录本(pri⁃miR⁃15b)的表达量没有显著差异(P>0.05),而突变组pre⁃miR⁃15b、miR⁃15b和微小RNA⁃16(miR⁃16)表达量极显著低于野生组(P<0.01);突变组分化前FOXO1相对表达量极显著高于野生组(P<0.01),分化后成脂分化相关基因固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP⁃1c)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)相对表达量极显著低于野生组(P<0.01),脂肪细胞蛋白2(aP2)相对表达量低于野生组(P>0.05);油红O染色结果表明突变组细胞脂滴含量明显低于野生组。综上可知,+58C>T阻碍了pri⁃miR⁃15b到pre⁃miR⁃15b的生物学加工过程,导致miR⁃15b成熟体表达量下降,其靶基因FOXO1相对表达量增高,从而抑制猪前体脂肪细胞分化。

绵羊前体脂肪细胞分化过程中关键基因时序表达特征研究

为分析绵羊前体脂肪细胞在成脂分化过程中关键基因的表达规律及特点,以3T3-L1细胞系为参照,选取出生20 d的呼伦贝尔羊母羔羊,利用组织块消化法从其尾部脂肪组织中分离前体脂肪细胞,建立原代细胞系。利用鸡尾酒法分别对3T3-L1细胞系和绵羊前体脂肪细胞系进行诱导分化,采用实时荧光定量PCR检测诱导分化过程中关键基因的时序表达。结果显示,绵羊前体脂肪细胞成脂分化用时更长,诱导分化16 d后依然有部分细胞具有分化能力。基因时序表达分析表明,DLK1、SREBP1、ACC1、FASN基因的时序表达趋势在2类细胞中基本一致;ZFP423、ADIPOQ、C/EBPα基因的表达时序在2类细胞系中高度相似;而PPARγ、FABP4、LPL、HSL基因在2类细胞系中的时序表达趋势差异较大。相比3T3-L1细胞系,绵羊前体脂肪细胞中ZFP423、ADIPOQ、C/EBPα、FABP4的相对表达量在诱导分化中、后期仍然处于较高水平,PPARγ、LPL、HSL的相对表达量呈现持续增长趋势,表明绵羊前体脂肪细胞的成脂分化具有自身特点。根据基因表达情况推测,绵羊前体脂肪细胞诱导分化16 d后通过外界环境摄取脂肪酸合成甘油三酯并沉积于细胞,这种较强的吸收外界环境脂肪酸的能力可能是本土绵羊皮下脂肪过度沉积的原因之一。综上所述,对绵羊脂肪代谢的相关研究以绵羊脂肪细胞为模型更加合理,为绵羊脂肪代谢研究提供了可靠的试验模型。

山羊KLF8生物学特征及对肌内前体脂肪细胞增殖的影响

旨在克隆山羊KLF8基因序列,阐明组织表达特性,并初步揭示过表达KLF8后对山羊肌内前体脂肪细胞增殖的潜在影响.利用逆转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法克隆获得山羊KLF8基因启动子和CDS区序列(coding sequence,CDS),并运用生物信息学方法分析其序列特征;利用基因重组方法构建山羊pcDNA3.1-KLF8真核过表达载体,利用CCK-8、EdU检测方法和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)明确KLF8对山羊肌内前体脂肪细胞增殖的影响.结果显示,获得包含2个潜在的核心启动子、多个TATA-Box和GATA-Box的山羊KLF8基因启动子2 001bp和包含KLF家族典型的锌指结构域、发挥转录抑制/激活基序的CDS序列1 062 bp.KLF8高表达于山羊脾脏组织,极显著高于其他组织(P<0.01),中度表达于肾脏和肺脏组织,低表达于背最长肌和股二头肌.过表达KLF8抑制山羊肌内前体脂肪细胞增殖,并且这种作用可能是通过上调CCND1的表达来实现的.结果为明确山羊KLF8基因生物学特征及对山羊肌内前体脂肪细胞增殖的影响提供重要的数据支撑.

脂肪酸对延边牛前体脂肪细胞UCP1、UCP3的mRNA表达的影响

试验旨在探索前体脂肪细胞受到冷应激后的响应机制,并初步鉴定以单不饱和脂肪酸中的油酸(OA)、肉豆蔻油酸(MOA)对解偶联蛋白1(UCP1)、解偶联蛋白3(UCP3)基因表达的影响,探索以OA、MOA为代表的单不饱和脂肪酸与细胞冷应激之间是否存在关联。以OA、MOA以及延边牛前体脂肪细胞作为试验材料,分别用OA、MOA处理前体脂肪细胞96 h,通过油红O染色和三酰甘油含量的测定来评估前体脂肪细胞内脂肪生成情况,利用qPCR测定UCP1、UCP3基因的相对表达量。再分别对未经处理、OA处理96 h、MOA处理96 h的前体脂肪细胞进行4℃冷应激处理0、6、12、24 h后,分别检测其UCP1、UCP3基因的相对表达量。结果显示:OA组与MOA组均可显著降低UCP1和UCP3基因的表达水平(P<0.05);在冷处理6~24 h后UCP1基因表达量发生显著性上升(P<0.05),冷处理6~12 h的UCP3基因表达量发生显著性降低(P<0.05)。试验发现,OA、MOA处理前体脂肪细胞96 h后,再进行4℃冷应激处理24 h,会导致UCP1基因表达量上升,而UCP3的表达量随着冷应激处理时间的延长而降低,并且试验初步验证了OA及MOA对两种基因具有抑制作用。

非编码RNA对牛前体脂肪细胞分化的研究进展

肌内脂肪含量是评价牛肉等级和价值的重要指标,其取决于肌内前体脂肪细胞的增殖与分化。前体脂肪细胞分化是一个高度协调的过程,受到激素、转录因子、细胞因子及表观调控等多种因素调控。非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA)是一类不编码蛋白质的表观遗传学调节因子,在前体脂肪细胞分化过程中发挥重要作用,其鉴定、功能和调节机制研究已成为牛脂肪沉积的研究热点。该文在简单介绍ncRNA分类、作用机制的基础上,详细阐述了miRNA、lncRNA和circRNA等3种类型的ncRNAs在不同品种、不同性别牛脂肪组织中的表达规律及在前体脂肪细胞分化中的研究进展,以期为解析ncRNA调控牛脂肪细胞分化机制奠定理论基础,并为今后ncRNA在肉牛分子育种提高肌内脂肪含量方面的应用提供理论参考。

雷公藤红素抑制前体脂肪细胞成脂分化的作用及机制研究

目的研究雷公藤红素(celastrol,Cela)对前体脂肪细胞(3T3-L1)成脂分化的抑制作用及其具体机制。方法采用CCK-8法确定雷公藤红素处理3T3-L1细胞的最佳浓度;油红O染色及免疫荧光法(脂肪细胞标志蛋白Perilipin1,Adiponectin)检测雷公藤红素对3T3-L1成脂分化不同时期的抑制作用;Western Blot(WB)检测不同浓度雷公藤红素处理后3T3-L1细胞中调控脂代谢以及分化相关蛋白的表达;对未分化(Con)、分化第1天(MDI)、分化第1天同时给药250 nmol·L^(-1)雷公藤红素(MCT)的3T3-L1细胞进行WB检测以及microRNA(miRNA)测序,qPCR验证筛选得到的miRNA,进行KEGG与GO富集分析;过表达mmu-miR-5121 mimics和inhibitor,WB检测相关蛋白的变化,油红O染色检测分化结果。结果Cela处理3T3-L1细胞的最佳浓度为250 nmol·L^(-1)和500 nmol·L^(-1);油红O染色及免疫荧光结果表明250 nmol·L^(-1)与500 nmol·L^(-1)Cela对3T3-L1成脂分化均有显著抑制作用,250 nmol·L^(-1)在3T3-L1成脂分化早期(第1天)便能显著抑制3T3-L1成脂分化;250 nmol·L^(-1)Cela处理3T3-L124 h后,能显著抑制3T3-L1中DFCP1、FAS、ACC、PPARγ等蛋白的表达;分化第1天FAS与ACC表达升高,采用250 nmol·L^(-1)Cela处理后,ACC、FAS蛋白表达显著降低;miRNA测序筛选后q PCR验证结果表明mmumiR-5121在分化第1天减少,但Cela处理后含量增加。转染5121 inhibitor提高了FAS与ACC的含量,5121 mimics则呈现相反作用。单独转染5121 inhibitor可使得3T3-L1分化成熟,而分化同时添加5121 mimics可以有效抑制分化。并且250nmol·L^(-1)Cela可以抑制5121 inhibitor引起的分化。结论250 nmol·L^(-1)雷公藤红素作用于3T3-L1成脂分化早期可显著抑制3T3-L1分化,其可能通过上调mmu-miR-5121的含量,抑制FAS与ACC的表达发挥作用。

过表达UCP3基因对萨湖羊前体脂肪细胞分化的影响

旨在阐明萨湖羊解偶联蛋白3(UCP3)基因的组织、细胞表达模式,阐明过表达UCP3对揭示对萨湖羊前体脂肪细胞分化的影响。本研究通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)技术检测UCP3基因在3只萨湖羊心脏、肝脏、脾脏等组织中的表达分布及在成脂诱导分化不同时期的表达水平;过表达UCP3后,采用qPCR验证过表达效率;利用油红O染色、脂质提取分析及脂肪细胞分化标志基因的检测,分别从细胞形态学和生物学角度明确过表达UCP3对萨湖羊脂肪细胞脂质生成的影响。结果表明:UCP3基因在萨湖羊各组织中广泛表达,在心脏和脾脏中相对表达量较高;时序表达谱显示,在萨湖羊前体脂肪细胞分化过程中UCP3基因表达量呈上升的趋势(P<0.05);过表达UCP3后,萨湖羊前体脂肪细胞的脂滴明显增多,极显著增加了脂质含量(P<0.01);脂肪细胞分化标志基因PPARγ、C/EBPα、LEP mRNA水平极显著上升(P<0.01),FAS、UCP1 mRNA水平显著上升(P<0.05)。本研究揭示了萨湖羊UCP3的表达模式,验证了过表达UCP3能够促进萨湖羊前体脂肪细胞的成脂分化,推测UCP3是萨湖羊前体脂肪细胞的正调控因子,可能是通过调控PPARγ、C/EBPα和FAS等分化关键基因的表达来实现的。

人前体脂肪细胞分化过程及肥胖人群脂肪组织中hsa_circ_0017650高表达

目的探讨hsa_circ_0017650在人前体脂肪细胞分化过程以及肥胖人群脂肪组织中的表达变化。方法RT-qPCR测定人前体脂肪细胞分化第0/1/3/5/7/9/12天hsa_circ_0017650的水平变化;油红O染色观察人前体脂肪细胞分化第0/6/12天脂滴形成;RT-qPCR测定人前体脂肪细胞中CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、脂肪酸结合蛋白4(FABP4/ap2)和脂蛋白脂酶(LPL)mRNA水平;根据体质指数(BMI)将125例患者分为肥胖组和对照组,比较2组腹膜后白色脂肪组织hsa_circ_0017650表达差异;Pearson相关性分析hsa_circ_0017650表达水平与肥胖组患者BMI、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)相关性。结果培养第12天时人前体脂肪细胞中C/EBPα、FABP4/ap2和LPL水平均高于第0天(P<0.001);Hsa_circ_0017650表达呈时间依赖性,其中第3天达到峰值(P<0.001)。与对照组相比,肥胖组白色脂肪组织中hsa_circ_0017650水平及BMI、腰臀比、TC、TG、LDL-C水平以及升高(P<0.001);Hsa_circ_0017650与BMI、TG、LDL-C呈正相关(r=0.554、0.569、0.618,P<0.001)。结论Hsa_circ_0017650在人前体脂肪细胞分化过程以及肥胖人群白色脂肪组织中高表达,与患者肥胖密切相关,为肥胖患者的治疗提供靶点。

CircECH1通过充当miR-365-5p海绵抑制猪前体脂肪细胞增殖

环状RNA(circRNA)是一种共价封闭RNA,在脂肪发育过程中具有重要作用。本研究旨在探讨猪环状RNA ECH1(circECH1)对前体脂肪细胞增殖的调控机制。本研究通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析、Sanger测序和RNase R酶消化法成功鉴定circECH1的稳定环状结构,其在马身猪各个组织中均有表达,并且其在脂肪组织中的表达量随日龄增加呈上升趋势。功能研究证明,干扰circECH1后,增殖相关基因PCNA、CDK1和MKi67极显著升高(P<0.01),增殖细胞数量极显著增加(P<0.01)。为进一步探究其分子机制,使用miRDB、miRWalk和RNAhybrid预测circECH1的下游靶基因。通过双荧光素酶报告基因分析和RNA结合蛋白免疫沉淀技术,验证circECH1能靶向结合miR-365-5p。在猪前体脂肪细胞中过表达miR-365-5p会增殖相关基因PCNA和CDK1的表达量极显著升高(P<0.01),增殖细胞数量极显著增加(P<0.01);干扰miR-365-5p后增殖相关基因PCNA、CDK1和MKi67的表达量极显著降低(P<0.01),增殖细胞数量极显著增加(P<0.01)。挽救实验结果显示,共转染si-circECH1和miR-365-5p inhibitor与单独转染miR-365-5p inhibitor相比,增殖相关基因PCNA、CDK1和MKi67的表达量显著升高(P<0.01),增殖细胞数量显著升高。本研究结果证明,circECH1存在于马身猪的脂肪组织中,并且通过海绵吸附miR-365-5p调控猪前体脂肪细胞增殖,为进一步了解调控猪前体脂肪细胞的分子机制提供理论依据。

过表达DGAT2基因对延边牛前体脂肪细胞分化的影响

【目的】探究二酰基甘油酰基转移酶2(DGAT2)对牛前体脂肪细胞分化的影响及其对脂质代谢相关信号通路的调控作用。【方法】利用ADV1穿梭质粒构建包含目的基因的重组穿梭质粒,将重组穿梭质粒与骨架质粒pGP-Ad-Pac载体共转染293A细胞,制得过表达腺病毒载体Ad-DGAT2,用Ad-DGAT2与Ad-NC(阴性对照组)感染牛前体脂肪细胞;用油酸诱导分化96 h后,利用油红O染色观察脂滴生成情况,并检测甘油三酯(TAG)和脂联素(ADP)含量;通过实时荧光定量PCR检测脂肪生成相关基因表达情况;最后对其进行转录组测序,筛选差异表达基因并进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。【结果】过表达DGAT 2基因可显著增加脂滴数量及TAG、ADP含量(P<0.05),可显著上调磷酸甘油途径DGAT1、甘油磷酸酰基转移酶4(GPAT4)、酰甘油磷酸酯酰基转移酶4(AGPAT4)以及脂质代谢途径中过氧化物酶体增殖活化受体γ(PPARγ)、脂肪分化相关蛋白(PLIN2)、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)和硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)的mRNA表达水平(P<0.05)。转录组测序结果显示,与Ad-NC组相比,Ad-DGAT2感染的前体脂肪细胞中共筛选出110个差异表达基因,其中64个基因上调,46个基因下调。KEGG通路富集分析显示,差异表达基因主要富集在PPAR信号通路、甘油磷脂代谢、脂肪酸生物合成和AMPK信号通路中。【结论】过表达DGAT 2基因可以促进延边牛脂肪细胞中脂滴形成、TAG积累和相关成脂基因的表达,转录组测序筛选出了与脂肪代谢相关的差异表达基因。本研究结果表明DGAT 2基因在前体脂肪细胞分化过程中发挥了重要调控作用,为延边牛的分子育种提供了重要的理论依据。

PSMD9对山羊前体脂肪细胞脂质沉积的调控作用研究

旨在克隆山羊PSMD 9基因序列并对其进行生物信息学分析,检测PSMD 9在山羊各组织中的表达情况和肌内前体脂肪细胞不同分化时期的表达水平,并进一步揭示过表达和干扰PSMD 9基因对山羊肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响。本研究以1周岁健康简州大耳羊公羊(n=12)为试验对象,采用T-A克隆技术获得山羊PSMD 9基因序列,进行生物信息学分析,并通过双酶切方法构建PSMD9过表达载体。利用脂质体转染在山羊肌内脂肪细胞中过表达PSMD 9,小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰PSMD 9表达。通过油红O染色法观察PSMD 9对脂滴形成的影响,GPO-Trinder酶学反应检测甘油三酯含量;同时利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测PSMD 9在山羊不同组织中的表达水平和肌内前体脂肪细胞不同分化时期的表达水平。结果,获得山羊PSMD 9基因核苷酸序列763 bp,其中5′UTR 67 bp,CDS区564 bp,3′UTR 132 bp,编码187个氨基酸残基;山羊PSMD 9基因在肝脏中的表达量最高,在脾脏中表达量最低,在诱导分化前4 d其表达水平随着山羊前体脂肪细胞分化而逐渐降低,随后上升,并在第8天表达量最高;过表达PSMD 9基因,肌内前体脂肪细胞的脂滴明显增加,甘油三酯含量显著提高,同时可显著上调DGAT2、FASN和ACC的相对表达量,DGAT1、PPARγ和SCD 1表达量无显著变化;干扰PSMD 9基因肌内前体脂肪细胞脂滴减少,甘油三酯含量降低,同时可显著下调DGAT1、PPARγ、FASN和ACC表达量,DGAT 2和SCD 1无显著变化。本试验成功获得山羊PSMD 9基因CDS区序列,其在肝脏组织中表达量最高,山羊PSMD 9基因的表达随着肌内前体脂肪细胞的分化而逐渐降低,在第4天表达量最低,之后表达量逐渐升高,PSMD 9的表达能够显著促进山羊肌内前体脂肪细胞脂质沉积,这些结果为进一步阐明PSMD 9基因对调控山羊肌内脂肪形成的作用机制提供了重要数据支撑。

山羊FATP2基因的克隆及对前体脂肪细胞脂质沉积的影响

旨在对山羊脂肪酸转运蛋白2(fatty acid transport protein 2,FATP2)基因进行克隆及生物信息学分析,检测FATP 2基因在山羊不同组织中的表达差异,并进一步揭示干扰FATP 2基因对山羊肌内前体脂肪细胞脂质代谢的影响。本试验以10月龄健康简州大耳羊(n=12)为试验动物。采用RT-PCR法扩增并克隆山羊FATP 2基因,进行序列对比、系统发育树构建及生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测FATP 2基因在山羊不同组织中及在山羊肌内前体脂肪细胞不同分化时期的相对表达水平,合成SI-RNA干扰序列并转染至山羊肌内前体脂肪细胞;使用RT-qPCR检测FATP 2干扰效率及脂质代谢相关基因的表达情况;通过Bodipy染色法观察干扰FATP 2对脂滴形成的影响,利用GPO-Trinder酶学反应检测甘油三酯含量。结果显示,获得山羊FATP 2基因序列全长2335 bp,CDS区1863 bp,5′UTR 188 bp,3′UTR 284 bp;共编码621个氨基酸,山羊FATP 2基因在肝脏表达量最高;RT-qPCR检测结果显示,FATP 2表达在细胞中被显著干扰;Bodipy染色结果显示,干扰FATP 2基因后脂滴显著减少;甘油三酯测定结果显示,干扰FATP2基因山羊肌内前体脂肪细胞甘油三酯含量显著降低。本研究成功获得山羊FATP 2基因CDS区序列,干扰FATP 2后山羊肌内前体脂肪细胞脂质沉积显著减少并显著影响脂代谢相关基因的表达,这些结果为进一步阐明FATP 2对调控山羊肌内脂肪形成的作用机制提供了重要数据。

新西兰兔肌内和皮下前体脂肪细胞原代培养与诱导分化的研究

为建立新西兰兔前体脂肪细胞的体外培养模型,比较新西兰兔肌内和皮下前体脂肪细胞分化过程中相关基因的差异表达,实验采集 1 日龄新西兰兔背最长肌和皮下脂肪组织,采用胶原酶消化方法,分别从 2 种组织中分离前体脂肪细胞,进行细胞原代培养,绘制细胞生长曲线,并对肌内和皮下前体脂肪细胞诱导分化,利用 RT-PCR 检测相关基因的表达变化。结果表明:细胞在分离后 2 h 已经贴壁,24 h 时呈现出短梭形的细胞形态,第 2 天细胞变成长梭形,第 3 天进入对数生长期。肌内和皮下前体脂肪细胞在诱导分化后均被油红O 染色,皮下前体脂肪细胞的脂质积累在诱导分化的第 2 天显著高于肌内前体脂肪细胞(P<0.05);荧光定量结果表明,肌内和皮下前体脂肪细胞 CCAAT 增强子结合蛋白(C/EBPα)基因的表达趋势在诱导分化过程中相同,肌内前体脂肪细胞过氧化物酶体增殖激活受体(PPARγ)第 4 天的表达量显著高于第 6 天,而皮下前体脂肪细胞 PPARγ表达量差异不显著;肌内前体脂肪细胞脂蛋白脂肪酶(LPL)表达量在第 0天和第 2天差异不显著,而皮下前体脂肪细胞第 2 天显著高于第 0 天(P<0.05);肌内前体脂肪细胞脂肪酸合酶(FAS)基因第 0、2、4 天的表达量差异不显著,而皮下前体脂肪细胞第 2、4 天显著高于第 0 天(P<0.05)。本研究成功构建了新西兰兔肌内和皮下前体脂肪细胞的体外培养和诱导分化模型,并发现皮下前体脂肪细胞分化早于肌内前体脂肪细胞,为进一步研究新西兰兔前体脂肪细胞的分化机制和脂肪沉积奠定基础。

山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中内参基因的表达稳定性分析

旨在通过比较9个内参基因在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化不同时期的表达水平进而最终确定适合山羊肌内前体脂肪细胞分化调控研究最佳的内参基因。本研究利用胶原酶消化法获得山羊肌内前体脂肪细胞,并以分别诱导0、1、2、3、5和6d的细胞为研究对象,利用荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)技术和geNorm、NormFinder和BestKeeper程序来检测和分析9个候选内参基因(GAPDH、PPIA、18S rRNA、PPIB、UXT、RPLP0、ACTB、EIF3K和TBP)表达的稳定性,并以KLF3和KLF12的实际表达水平进行校正分析。geNorm和NormFinder程序分析表明,UXT稳定性相对最好;而BestKeeper程序分析发现,PPIB表达相对最平稳;3种软件分析结果均表明,同时使用UXT和PPIB可以准确校正在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化不同时期目标基因的表达;通过对KLF3和KLF12表达量的分析发现,选用筛选结果中最稳定(UXT和PPIB、UXT)和最不稳定(EIF3K和18S rRNA)的内参基因进行归一化分析结果有差异。在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中,UXT基因是适合于山羊肌内前体脂肪细胞的成脂诱导分化研究最稳定有效的内参基因,同时使用UXT和PPIB作为内参基因能够获得更加精确的目标基因表达结果,这为后续山羊前体脂肪细胞分化调控相关基因的功能研究奠定了基础。

白藜芦醇对猪原代前体脂肪细胞的增殖与分化及Sirt1基因转录表达时序的影响

分别以0μmol／L（对照组）、10μmol／L（低剂量组），20μmol／L（中等剂量组），513μmol／L，100μmol／L（高剂量组）的白藜芦醇（Resveratrol，RES）处理体外培养1～3日龄健康仔猪前体脂肪细胞，采用MTT比色法检测细胞活性及增殖状况：油红O染色化学比色法定量分析细胞内脂肪生成及细胞分化程度；RT-PCR法分析Sirt1（sirtuin1）mRNA表达情况，探讨Sirt1对猪前体脂肪细胞增殖分化的影响及其分子机制。结果表明，脂肪细胞经RES处理后，各组MTT和油红O染色测得的光密度值（OD值）均低于对照组，50μmol／L，100／μmol／L组在96～120h作用极显著（P〈0．01），与中低剂量组差异显著（P〈0．05）；以20μmol／L，100μmol／LRES处理细胞后，Sirt1 mRNA表达量随细胞分化的进行而逐渐升高，100／μmol／L组均显著高于对照组和20μmol／L组（P〈0．05）。RES对猪前体脂肪细胞增殖分化均有一定抑制作用，高剂量RES（513μmol／L和100μmol／L）可显著减少细胞内脂肪的合成、抑制脂肪细胞增殖与分化，Sirt1 mRNA表达量显著升高可能是RES抑制细胞分化的重要原因之一。

绒山羊肌内前体脂肪细胞的基因表达分析

本研究建立了山羊肌内前体脂肪细胞的体外培养模式,以期深入研究山羊肌内脂肪组织发育和脂肪沉积过程中标志基因的表达情况。试验采集1日龄羔羊背最长肌,Ⅱ型胶原酶消化1.5h后依次通过80目、400目筛网过滤,离心,通过差速贴壁法得到增殖旺盛肌内前体脂肪细胞,观察其形态学变化,油红O染色检测细胞内脂肪含量。实时定量PCR法检测LPL、PPAR、FTO、LIPIN基因的表达量。结果表明:原代培养的细胞成分均一,贴壁生长呈短梭状或棱形,具有肌内前体脂肪细胞的形态特征。通过定量分析,FTO mRNA在早期就有较高表达,在分化5~7d达到最高水平,之后维持较高水平,11d表达量显著下降(P<0.05)。LIPIN mRNA在加入诱导剂后出现波动现象。PPARmRNA在整个细胞分化和增殖过程中维持一个较稳定的水平。LPLmRNA在分化早期高表达,随着分化程度的增加表达量逐渐降低。本研究成功建立了山羊肌内前体脂肪细胞原代培养方法,并在体外重现了增殖和分化的过程。基因表达量为FTO>LPL>PPAR>LIPIN,这可为进一步研究脂肪沉积机制及优化山羊肉品品质奠定基础。

猪肌源性前体脂肪细胞的分离培养和成脂诱导分化研究

本研究旨在建立猪肌源性前体脂肪细胞的体外培养体系,并探究成脂诱导分化过程中相关基因的表达,为进一步研究调控猪肌内脂肪沉积的分子机制提供试验材料。采集15日龄仔猪的背最长肌组织,使用Ⅱ型胶原酶进行消化,分离获得前体脂肪细胞,进行原代、传代培养以及成脂诱导,观察细胞形态、测定生长曲线、油红O染色鉴定以及检测成脂关键基因PPARγ、FABP4、C/EBPα、C/EBPβ、ZFP423、SREBP1、PRDM16和HSL在诱导分化过程中的表达量。结果表明,分离的猪肌源性前体脂肪细胞在6～7 h,发现少量细胞开始贴壁,贴壁的细胞呈似圆型、小梭型以及其它不规则形状,经传代后细胞形态均一,呈典型的成纤维细胞样,细胞的生长曲线呈S型。添加分化培养基进行诱导后,所有基因在细胞分化的早期均有表达,FABP4、C/EBPα、SREBP1与PPARγ基因在分化早期表达量极显著升高(P <0. 01),在后期表达量极显著下降(P <0. 01),C/EBPβ、ZFP423和PRMD16基因的表达量在分化过程中未见显著变化,HSL的表达量随着分化进行极显著降低(P <0. 01)。在诱导分化12 d左右,油红O染色呈现红色。综上表明,本研究成功建立了猪肌源性前体脂肪细胞的分离与培养体系,进行成脂诱导分化,揭示分化过程中关键基因的表达规律,为进一步研究猪肌内脂肪沉积的分子机制和改善肉质品质奠定基础。

绵羊前体脂肪细胞的原代培养及分化

本试验旨在建立绵羊前体脂肪细胞的原代培养方法,探讨反刍动物脂肪沉积机理。以1日龄羔羊的肾周脂肪组织为试验材料,采用组织块法和酶消化法分离培养前体脂肪细胞,观察形态学变化,测定生长曲线,油红O染色检测细胞内脂肪含量,并用实时定量PCR法检测脂蛋白脂酶、过氧化物体增殖剂活化受体γ、脂肪酸合酶的表达量。结果表明:原代培养的细胞成分均一、增殖旺盛、分化率高,具有前体脂肪细胞的形态特征和基因表达特性,为绵羊前体脂肪细胞。本试验成功建立了绵羊前体脂肪细胞原代培养方法,并在体外重现了增殖和分化的过程。

胰岛素对原代培养大鼠前体脂肪细胞增殖分化的影响

对分离自20日龄雄性SD大鼠附睾和肾周白色脂肪组织的前体脂肪细胞进行原代培养，并采用MTT比色法、油红O染色提取法分析了100～400nmol／L胰岛素对其增殖、分化的影响，同时利用半定量RT-PCR分析了该浓度胰岛素对分化标志基因——脂肪酸合酶（FAS）、乙酰CoA羧化酶α（ACC1）基因mRNA表达的影响。结果显示，胰岛素能有效地促进前体脂肪细胞的增殖和分化（P〈0．05），在400nmol／L以下具有剂量依赖性；胰岛素处理72h能显著提高脂肪细胞FAS和ACC1基因mRNA的表达水平（P〈0．05）。证实胰岛素对原代培养大鼠前体脂肪细胞增殖分化有明显促进作用。