卵巢癌细胞ERCC1基因VIII外显子剪接变异及功能研究

目的 确认卵巢癌细胞ERCC1基因VIII外显子剪接变异的存在 ,探讨该剪接变异对ERCC1基因表达的作用及其对卵巢癌细胞对铂类药物耐药性的影响。方法 采用Northern杂交及RNA酶保护分析确认人卵巢癌细胞内ERCC1基因调控区在RNA水平存在剪接变异。分别构建野生型及缺失VIII外显子的ERCC1表达载体 ,转染中国仓鼠卵巢 4 3 3B细胞 ,采用Westernblot检测ERCC1表达水平研究该剪接变异对ERCC1基因表达水平的影响 ,采用MTT和细胞克隆形成实验研究该剪接变异细胞对铂类药物耐药性的影响。结果 卵巢癌细胞ERCC1基因VIII外显子存在剪接变异。Westernblot结果显示该剪接变异不显著影响ERCC1表达水平 ,但CHO 4 3 3B细胞MTT及细胞克隆形成实验表明 ,该剪接变异显著影响细胞对顺铂的耐药性。结论 本研究首次证明人卵巢癌细胞、组织ERCC1基因VIII外显子存在剪接变异 ,该变异不显著影响ERCC1基因的绝对表达水平 。

一个新的TBR1基因剪接变异导致的智力障碍伴自闭症和语言障碍家系分析及产前诊断

目的探讨1个由TBR1基因剪接变异导致的智力障碍伴自闭症和语言发育迟缓家系的临床特征及基因特点。方法对1例有家族史的智力障碍孕妇进行全外显子组检测,对先证者及其他家系成员(共11人)进行分子遗传学检测,发现该家系的致病位点,对胎儿羊水进行基因检测,并通过minigene技术对该位点进行体外功能验证。结果通过全外显子组测序发现,先证者携带1个TBR1基因新的剪接变异(c.1129-1G>C),并呈现出家系共分离现象。胎儿羊水中未发现该变异,胎儿出生后随访至1岁,智力运动发育正常。Minigene结果显示第5外显子出现异常剪接。结论TBR1基因c.1129-1G>C变异可能是该家系的致病原因,及时的产前遗传诊断和咨询有助于阻断致病基因在家系中的传递。

COL4A5基因剪接变异致Alport综合征患者1例的遗传学分析及体外验证

目的探讨1例Alport综合征(AS)患者的遗传学特征并验证其存在的剪接变异。方法选取2021年1月8日因"体检发现尿蛋白3+、尿潜血3+"就诊于内蒙古医科大学附属医院肾脏内科的1例AS患者作为研究对象,收集患者临床资料。抽取患者及其父母的外周血样本,提取基因组DNA,利用全外显子组测序及Sanger测序确定基因变异位点,应用mRNA异常剪接体外验证实验研究变异对转录产物的影响。应用生物学软件分析变异位点的氨基酸保守性并模拟胶原蛋白Ⅳ模型,分析变异蛋白的三维结果。对患者肾组织进行免疫荧光与免疫组织化学检查,确认是否存在AS肾脏损伤。结果患者为21岁男性,门诊尿常规检查显示24 h尿蛋白3.53 g/24 h(大量蛋白尿),血尿酸491μmol/L(高尿酸血症)。基因测序结果显示患者COL4A5基因存在剪接变异c.835-9T>A,患者父母未见该变异。体外实验结果显示c.835-9T>A(p.279_297del)导致COL4A5基因mRNA的第15外显子缺失57 bp,造成第279~297位氨基酸残基缺失,影响COL4A5基因编码的α5链的二级结构的稳定性。受损的氨基酸在不同物种中高度进化保守。同源建模显示突变的α5链参与的Col-Ⅳ三聚化可以完成,但三维结构变形严重。免疫荧光结果诊断为AS肾脏损伤。根据美国医学遗传学与基因组学学会相关变异评级指南,c.835-9T>A评级为可能致病性变异(PVS1_Moderate+PS3_Moderate+PM2_Supporting+PS2+PP3+PP4)。结论COL4A5:c.835-9T>A考虑是AS患者致病的原因,体外实验证实为剪接变异。通过肾脏组织病理学检查为该变异的致病性提供了体内证据,并拓展了COL4A5基因的变异谱。

TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测变异剪接体

目的:建立应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术对基因mRNA的各个变异剪接体分别进行定量检测的技术。方法:以对ERCC1的变异剪接体进行检测为例。使用TRIzol裂解新鲜手术切除的卵巢癌组织后提取总RNA,逆转录为cDNA后,PCR扩增ERCC1基因以及beta-actin基因,琼脂糖电泳分离PCR产物,纯化后连接到pMD18-T载体,转化入感受态大肠杆菌,提取并纯化质粒,稀释成不同浓度作为标准品以便制作标准曲线。结果:成功构建了缺失第VⅡI外显子的ERCC1质粒以及beta-actin质粒,设计了两套针针对ERCC1的TaqMan探针和引物,建立了稳定的定量检测ERCC1mRNA变异剪接体表达水平的平台。结论:TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法可以成功地分别对基因的变异剪接定体进行定量检测。

一个COL11A1基因新剪接变异导致的先天性高度近视家系的遗传学分析

目的 对1个先天性高度近视家系进行基因变异分析,探讨其致病原因.方法 对先证者进行全外显子组测序,应用Sanger测序验证可疑致病变异,并进行家系共分离分析.结果 基因测序显示先证者COL11A1基因存在c.2556+1G>A剪接位点杂合变异,家系中另3例患者(先证者母亲和两个女儿)均存在c.2556+1G>A杂合变异,表型正常家系成员(先证者父亲、妹妹)均未发现该变异,表型与基因型在家系内共分离.经查阅OMIM、HGMD及Clinvar数据库,c.2556+1G>A变异为未报道过的新变异.根据ACMG遗传变异分类标准与指南,c.2556+1G>A变异符合PVS1+PM2,可以判定为可能致病性变异.结论 COL11A1基因c.2556+1G>A剪接变异可能是该家系患者的致病原因,致病性变异的检出为家系的遗传咨询和产前诊断提供了依据.

RNA剪接变异及致病机制——以单基因遗传疾病为例

RNA的正确剪接是基因正常表达的关键。近年来,随着第二代高通量测序技术的快速发展以及对变异解读的不断深入,发现相较于错义变异及无义变异,剪接变异的漏检率很高,并且越来越多的证据证实了剪接变异在遗传病发病机制中的重要性。本综述简要概述了剪接的基础,并以几种单基因遗传病为例阐述剪接变异的致病机制,包括常见剪切变异类型及引起的mRNA效应,强调了剪接变异是引起单基因遗传病的重要机制,以期引起大家对剪接变异的关注,提高遗传病的诊断率。

胰岛素受体变异性剪接与肿瘤和2型糖尿病

胰岛素受体基因第11号外显子因为变异性剪接而形成两种胰岛素受体,两者与配体胰岛素、胰岛素样生长因子的结合力以及分别诱导的信号传导通路、发挥的生物学效应存在显著差异。这种差异不仅可能是导致胰岛素抵抗、2型糖尿病的重要原因,也会影响肿瘤细胞的生长、增殖、抗凋亡。虽然具体的调节机制尚不明确,但高胰岛素血症及高血糖等代谢因素是影响胰岛素受体变异性剪接的重要原因,同时基因序列敲除试验证实,胰岛素受体基因水平的改变会影响胰岛素受体的变异性剪接。

猪hnRNPUL1基因克隆及变异剪接体鉴定

旨在克隆民猪hnRNPUL1基因全长编码区(complete coding sequence, CDS)序列并进行可变剪接分析,研究其组织表达和亚细胞定位情况。本研究以3头3月龄民猪为试验材料,利用RT-PCR技术克隆hnRNPUL1基因CDS及可变剪接体,应用qRT-PCR检测其在心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠、背肌、腿肌等组织中的表达情况,同时,在生物信息学预测的基础上,通过融合表达绿色荧光蛋白的方法鉴定核定位序列。研究结果表明,猪hnRNPUL1基因(GenBank accession No.:MN399154) CDS全长2 580 bp,预期编码的多肽链存在着hnRNPs家族的特征性结构域--SAP、SPRY和AAA;猪hnRNPUL1普遍表达于所检测的各组织中,其中在脾脏中表达量最高,在腿肌中表达量最低;核定位序列(NLS)位于多肽链的133~430 aa处,与生物学信息学预测的结果存在着偏差;同时获得了2个变异剪接体和11种可变剪接片段。本研究结果对进一步揭示猪hnRNPUL1基因功能及转录调控机制提供了基础。

绵羊IGF-Ⅰ基因Ⅱ类变异剪接体生物信息学及组织表达分析

为明确绵羊IGF-Ⅰ基因变异剪接体的生物学特性及其在生长发育过程中的功能,本研究成功获得了IGF-Ⅰ基因Ⅱ类的2种变异剪接体(Ea和Eb型),利用生物信息学方法预测分析2种变异剪接体的结构特性,并探讨其在不同组织中的表达规律。结果表明:Ea和Eb型由同一基因通过选择性剪切形成,均是绵羊中新发现的类型,预测其分别编码138 aa和172 aa,2种变异剪接体的信号肽剪切位点、进化同源性、亚细胞定位、蛋白质空间结构预测结果类似,但二者包含不同的共价修饰位点。组织表达分析表明,2种变异剪接体在肝组织中表达量均最高,其次为脂肪、胃、睾丸、肌肉和皮肤组织,心、脾、肺、肾、肠、膀胱组织的表达水平较低;在胃中,羔羊期2种变异剪接体表达水平均极显著高于成羊期(P<0.01),在睾丸中,羔羊期IGF-Ⅰ基因Ⅱ类Ea型表达水平显著高于成羊期(P<0.05)。总体上来看,在各种组织中IGF-Ⅰ基因Ⅱ类Ea型的表达水平高于Eb型,为优势转录本类型。

受胆固醇调节的变异剪接体及其意义

目的:检测人肝癌细胞中LDLR的变异剪接体LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12,HMGCS1的变异剪接体HMGCS1-?Exon2和HMGCR的变异剪接体HMGCR-Exon?13是否受胆固醇的调节。方法:建立高胆固醇模型组、低胆固醇模型组及正常组,提取不同模型组的RNA并进行反转录,采用Realtime PCR(RT-PCR)技术检测LDLR-?Exon4,LDLR-?Exon12,HMGCS1-?Exon2和HMGCR-Exon?13的mRNA的表达。结果:在高胆固醇模型组中,与正常组相比,LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCS1-?Exon2及HMGCR-Exon?13的mRNA的表达量与各基因全长相比均明显升高(P<0.05);而在低胆固醇模型组中,与正常组相比,上述的变异剪接体mRNA的表达量与各基因全长相比均明显下降(P<0.05)。结论:LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCS1-?Exon2及HMGCR-Exon?13等变异剪接体受胆固醇的调节,并可能参与并调控胆固醇的代谢。

一个罕见智力发育障碍家系的临床特征及基因变异分析

目的:分析一个罕见智力发育障碍家系的临床特征和致病基因变异。方法:收集某智力发育障碍家系中4个成员的临床资料,提取各成员的外周血DNA和RNA,采用全外显子组测序和Sanger测序进行基因变异的筛查和验证。结果:该家系先证者表现为重度智力发育障碍、语言运动发育迟缓、大头畸形、高额头和小下颌等,检测到TRIO基因c.4084T>C(p.Y1362H)新发变异;该变异可使高度保守的1362位上的氨基酸由酪氨酸变成组氨酸,导致蛋白质鸟嘌呤核苷酸交换因子1结构域的破坏。先证者姐姐表现为轻度智力发育障碍、小头畸形、眼距宽等,检测到TRIO基因c.2046+1G>T新发变异;该变异可导致剪接位点的破坏,使mRNA第11号外显子多出5个碱基,预测会产生一个含有724个氨基酸的截短蛋白。其父母表型正常,TRIO基因均为野生型。结论:TRIO基因c.4084T>C和c.2046+1G>T可能是该家系的潜在致病变异。

CD44剪接体作为大肠癌分子标记的研究现状

在细胞生长和分化过程中 ,变异性剪接是许多基因表达过程的一部分。CD44是一广泛分布的跨膜糖蛋白 ,其基因至少由 2 0个外显子组成 ,通过多达 12个外显子的变异性剪接 ,形成包括众多剪接变异体的 CD44家族。研究发现某些 CD44的表达与人类大肠癌侵袭和转移等生物学行为及病人的预后关系密切 。

黏附分子CD_(44)变异剪接体6在甲状腺肿瘤中的表达及其临床意义

目的 探讨CD44变异剪接体 6(CD44V6 )在甲状腺肿瘤组织的表达情况及其与肿瘤发生、发展、浸润和转移的关系。方法 采用免疫组织化学S P法检测 2 0例癌旁甲状腺组织 ,2 4例甲状腺腺瘤和 64例甲状腺癌的石蜡标本CD44V6 表达水平。结果 CD44V6 在甲状腺腺癌的表达率 ( 92 19%)显著高于甲状腺腺瘤者 ( 5 8 3 3 %,P <0 0 1) ,癌旁甲状腺组织未见表达。甲状腺中不同组织来源的滤泡细胞癌和髓样癌的CD44V6 表达差异具有显著性 ,总阳性率分别为 96 5 5 %及 5 0 0 %(P <0 0 1)。但CD44V6 表达水平在乳头状腺癌和滤泡型腺癌间差别无显著性 (P >0 0 5 )。同时发现 2例未分化癌CD44V6 表达均呈强阳性。CD44V6 的表达水平与甲状腺癌的包膜浸润和淋巴结转移有关 ,CD44V6 表达水平在包膜浸润组和未浸润组之间 ,在淋巴结转移组和非转移组之间差别有显著性 (P <0 0 1)。CD44V6 表达与患者年龄、性别、肿瘤的大小无关 (P >0 0 5 )。结论 CD44V6 的表达与甲状腺肿瘤的分化和浸润、转移显著相关 ,检测CD44V6 有助于甲状腺癌的诊断、判断预后并可能为甲状腺癌的手术和术后综合治疗决策提供新的分子生物学指标。

人类首次定量检测完整的人类蛋白质组

据Kusebauch U 2016年7月28日[Cell,2016,166（3）：766-778.]报道,瑞士苏黎世联邦理工学院（ETH Zurich）和美国系统生物学研究所等科研人员开发出人类SRMAtlas（Human SRMAtlas）,即靶向识别和可重复地定量预测的人类蛋白质组中所有蛋白质的高度特异性质谱检测方法汇编目录,包括许多剪接变异体、非同义突变和翻译后修饰。利用一种被称作选择性反应监控（SRM）的技术,研究人员利用166 174种已被充分了解的化学合成蛋白质特征性肽（proteotypic peptide）开发出这些检测方法。

变异剪接体的结构、功能及其在疾病治疗中的应用

变异剪接(alternative splicing)是高等真核生物在发育和应激反应中调控基因表达的一种主要机制,能够调控蛋白表达,或产生编码具有不同功能蛋白的pre-mRNAs。剪接体(spliceosome)由五种snRNP(U1、U2、U4、U5和U6)和许多非snRNP蛋白质构成,参与整个剪接过程。变异剪接与诸多疾病有着密切联系,异常的变异剪接会导致疾病的发生,增加疾病的易感性与病变程度,甚至引起癌变。现就剪接体的生物学特征、剪接体与疾病的关系及其在疾病治疗方面的内容进行综述。

一个FBN2基因新剪接位点变异致先天性挛缩蜘蛛指畸形的遗传学分析

目的对1例疑似先天性挛缩蜘蛛指畸形患者进行变异筛查,探讨其可能的分子遗传学发病机制,为临床诊断提供依据。方法应用全外显子测序技术筛查基因变异。候选致病基因剪接位点变异经Sanger测序验证后,经RT-PCR、TA克隆测序确定新转录本序列。结果患者FBN2基因存在c.533-1G>C杂合变异,未见报道。mRNA测序显示该变异导致FBN2基因原剪接受位消失的同时,激活c.533-71处潜在剪接受位位点,由此产生的新转录本中插入了70bp序列。推测新转录本编码多肽在氨基酸179位由缬氨酸(Val)变成丝氨酸(Ser),并移码26位后终止(p.Val179Serfs26*)。根据美国医学遗传学与基因组学学会指南,FBN2基因c.533-1G>C变异判定为致病性变异(PVS1+PM2+PP3)。结论FBN2基因c.533-1G>C变异引起新转录本发生功能丧失性变异,可导致先天性挛缩蜘蛛指畸形。

黏附分子CD44变异剪接体6在甲状腺肿瘤中的表达及其临床意义探究

探究黏附分子CD44变异剪接体6(CD44v6)在甲状腺肿瘤中表达情况及临床价值。方法: 84例甲状腺肿瘤患者,均接受CD44v6检验,分析不同甲状腺肿瘤中CD44v6阳性检出率。结果: 良性甲状腺肿瘤共检出CDD44v6阳性9例,阳性检出率为14.29%;不同年龄、性别、肿瘤类型、肿瘤直径中CD44v6阳性检出率无显著差异(P>0.05);恶性甲状腺肿瘤共检出CD44v6阳性19例,阳性检出率为90.48%;恶性甲状腺肿瘤阳性检出率:恶性>良性>癌旁组织,乳头状癌>滤泡状癌;临床分期:Ⅲ~Ⅳ>Ⅰ~Ⅱ;肿瘤直径:4cm及以上>4cm以下(P<0.05);阳性检出率:乳头状癌>滤泡状癌>良性甲状腺肿瘤>癌旁组织(P<0.05)。结论: 甲状腺肿瘤中,不同肿瘤特征均存在CD44v6表达差异,可用于肿瘤性质、恶性肿瘤进展评估。

一个Ⅲ型家族性噬血细胞组织细胞增生症家系的临床及基因变异分析

目的探讨一例Ⅲ型家族性噬血细胞综合征(familial hemophagocytic lymphohistiocytosis typeⅢ,FHL-3)家系的致病变异及临床特点。方法对1例确诊为FHL-3的患儿及其家系成员进行回顾性分析,通过家系全外显子及相邻内含子测序对先证者进行筛查,并对候选变异进行Sanger测序验证。以健康对照和患者的基因组DNA为模板,构建包含UNC13D基因第23外显子、第23内含子和第24外显子的野生型和变异型minigene真核表达质粒。采用脂质体法用携带minigene的质粒转染HEK293T细胞,通过实时定量PCR检测minigene的剪接情况。结果家系分析和临床诊断提示先证者患有常染色体隐性遗传的FHL-3。测序发现其UNC13D基因存在c.118-308(IVS1)C>T和c.2298+1(IVS23)G>A变异,经Sanger测序验证分别来自父亲和母亲,构成复合杂合变异,判断为致病性。Minigene实验证实UNC13D基因c.2298+1(IVS23)G>A变异可导致第23外显子跳跃(-207nt),产生截短蛋白。结论UNC13D基因c.118-308(IVS1)C>T和c.2298+1(IVS23)G>A可能是该FHL-3家系的致病变异,可导致UNC13D mRNA低表达和pre-mRNA的异常剪接。

两个Bietti结晶样角膜视网膜营养不良家系的表型及CYP4V2基因变异分析

目的对两例Bietti结晶样角膜视网膜营养不良患者的CYP4V2基因进行分析,明确其致病原因,为临床诊断提供依据。方法应用高通量测序法筛查、Sanger测序法验证基因变异位点。利用相关数据库和PubMed文献检索,结合患者临床表现和辅助检查,依据美国医学遗传学与基因组学学会标准与指南判断该基因变异的致病性。结果家系1先证者CYP4V2基因存在c.(802-8)_810delTCATACAGGTCATCGCTinsGC纯合变异,父母未检测;家系2先证者CYP4V2基因存在c.(802-8)_810delTCATACAGGTCATCGCTinsGC和c.958C>T(p.R320X)的复合杂合变异,父母均为变异携带者;两家系的CYP4V2基因的Sanger测序结果与高通量测序一致。CYP4V2基因c.(802-8)_810delTCATACAGGTCATCGCTinsGC变异为剪接变异,剪接变异和无义变异均可产生截短的无功能蛋白产物。依据美国医学遗传学与基因组学学会指南标准此剪接变异及无义变异均为致病性变异(PVS1+PS1+PM2+PM3)。结论CYP4V2基因c.(802-8)_810delTCATACAGGTCATCGCTinsGC纯合变异及c.(802-8)_810delTCATACAGGTCATCGCTinsGC和c.958C>T(p.Arg320X)复合杂合变异分别为这2个家系先证者的致病原因。

Snijders Blok-Campeau综合征患儿1例的临床特征及基因变异分析

目的探讨Snijders Blok-Campeau综合征(SBCS)患儿的临床表型和基因变异特点。方法选取2017年6月于河南省儿童医院被确诊为SBCS的1例患儿为研究对象。收集患儿的临床病例资料,采集患儿及其父母的外周血样提取基因组DNA,进行家系全外显子组测序(trio-WES)及基因组拷贝数变异(CNV)检测,针对可疑致病变异位点,应用Sanger测序进行家系验证。结果患儿主要临床表现为语言障碍、智力障碍和运动发育迟缓,伴特殊面容(前额宽、面部呈倒三角状、眉毛稀疏、眼距宽、眼裂小、鼻梁宽、面中部凹陷、上唇薄、尖下颌、耳位低且耳壳后旋)。trio-WES和Sanger测序结果提示患儿存在CHD3基因c.4073-2A>G杂合剪接变异,其父母均为野生型,CNV检测未发现致病性CNV。结论该SBCS患儿临床特征为语言和智力障碍、运动发育迟缓,伴特殊面容。CHD3基因剪接变异可能为导致该患儿罹患SBCS的遗传学病因。