基因Ⅳ型禽呼肠孤病毒σC蛋白单克隆抗体的制备及功能鉴定

为制备基因Ⅳ型(GCⅣ)禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)σC蛋白单克隆抗体,构建了重组原核表达质粒pCold-I-ARV-GCⅣ-σC,将重组质粒导入感受态细胞BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达;随后将纯化后的σC蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术制备杂交瘤细胞,利用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选获得阳性杂交瘤细胞;以间接免疫荧光(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)试验鉴定杂交瘤细胞后,将杂交瘤细胞株通过腹腔注射小鼠制备单克隆抗体腹水,以ELISA测定腹水效价。结果显示:成功筛选出一株分泌ARV GCⅣσC蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株(1H4);制备的单克隆抗体能与ARV GCⅣσC蛋白发生反应,同时与感染不同基因型ARV的鸡肝癌细胞(LMH)均有良好的反应性;该单克隆抗体识别重链为IgG1,其腹水ELISA效价为1:256000。结果表明,成功制备ARV GCⅣσC蛋白单克隆抗体,其效价高,反应性良好,为进一步研究σC蛋白功能、ARV致病机理以及建立临床诊断方法奠定了基础。

黑莓1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因RuACO 1a和RuACO 1b的克隆及功能鉴定

基于前期黑莓(Rubus spp.)品种‘Navaho’果实转录组测序结果,通过反转录PCR克隆获得2个1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)基因,命名为RuACO 1a和RuACO 1b。结果表明:RuACO 1a和RuACO 1b的开放阅读框(ORF)长度分别为939和918 bp,分别含有4和3个外显子。系统进化分析结果显示RuACO1a和RuACO1b与月季(Rosa chinensis Jacq.)、蕨麻〔Argentina anserina(Linn.)Rydb.〕和野草莓(Fragaria vesca Linn.)ACO1蛋白的亲缘关系均较近,且分别属于蔷薇科(Rosaceae)植物中2类ACO1蛋白。RuACO 1a在果实着色后28 d响应乙烯利诱导,其相对表达量急剧升高,而RuACO 1b在果实着色后21 d响应乙烯利诱导,早于RuACO 1a。脱落酸处理后,RuACO 1a和RuACO 1b的相对表达量在果实着色后14和28 d较高。RuACO 1a和RuACO 1b具有组织表达特异性,RuACO 1a在幼果、花蕾和花中的相对表达量较高,RuACO 1b在幼果和幼根中的相对表达量较高。与野生型相比,RuACO 1a和RuACO 1b过量表达转基因拟南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕植株均表现为叶片中叶绿素相对含量和氮含量升高、开花和角果成熟提前、ACO含量升高。综上所述,黑莓RuACO 1a和RuACO 1b基因均促进拟南芥角果提前成熟。

石蒜1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶基因LrACS的克隆及功能鉴定

为了解1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶(ACS)基因在石蒜〔Lycoris radiata(L'Hér.)Herb.〕乙烯合成中的作用,对石蒜ACS基因LrACS进行了克隆,并通过系统进化树和氨基酸序列比对分析明确LrACS与其他同源蛋白的进化关系。利用亚细胞定位分析LrACS在细胞中的定位,对LrACS重组蛋白进行体外活性检测,并利用实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)分析不同生长时期LrACS的组织特异性表达。结果显示:LrACS的开放阅读框长度为1473 bp,编码490个氨基酸。LrACS的理论相对分子质量为54954.97,理论等电点为pI 8.21。系统进化树分析结果表明LrACS与忽地笑〔Lycoris aurea(L'Hér.)Herb.〕LaACS的亲缘关系最近,均属于Ⅰ型ACS蛋白。亚细胞定位结果显示LrACS主要定位于细胞质基质。体外活性检测结果证实LrACS重组蛋白能够催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)生成1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)。qRT-PCR分析结果显示:LrACS在花期和叶期的石蒜各组织中均有表达,但其表达具有组织特异性,其中,花期花瓣中LrACS的相对表达量极显著(P<0.01)高于根、鳞茎、花茎,叶期根中LrACS的相对表达量极显著高于鳞茎和叶。综上所述,LrACS主要定位于细胞质基质并在石蒜不同生长时期行使催化SAM生成ACC的功能。

蜻蜓凤梨AfFT3基因克隆及功能鉴定

【目的】克隆蜻蜓凤梨成花素基因AfFT3,并鉴定其生物学功能,为深入解析凤梨科植物开花分子机制提供理论依据。【方法】克隆AfFT3基因,利用生物信息学软件进行序列分析,并通过实时荧光定量PCR探究其在低温(18℃)、常温(25℃)和高温(35℃)及外源乙烯处理下的表达情况,采用农杆菌浸花法将AfFT3基因转入拟南芥,观察转基因植株表型,通过异源表达预测其生物学功能。通过酵母单杂交试验初步鉴定其启动子与AfEIN3蛋白的互作关系。【结果】从蜻蜓凤梨中克隆获得AfFT3基因全长570 bp,编码区(CDS)序列为465 bp,编码154个氨基酸残基,蛋白分子量为17.3 kD,为稳定的亲水性蛋白,无跨膜螺旋区,含有PKC、PKA、cdc2、INSR和GSK3等多个蛋白激酶磷酸化位点。同源序列比对发现,AfFT3蛋白中有2个氨基酸残基^(138)Trp和^(140)Gln突变为^(138)Met和^(140)Glu。系统发育分析结果显示,该蛋白属于PEBP家族的FT-like蛋白亚家族,与TFL-like亚家族的亲缘关系较近。与对照(大棚正常条件下栽培植株)相比,高温和低温处理下AfFT3基因在蜻蜓凤梨中的相对表达量显著(P<0.05,下同)或极显著(P<0.01,下同)升高。在高温、常温和低温条件下,使用外源乙烯处理后,AfFT3基因在蜻蜓凤梨中的相对表达量均较对照显著或极显著升高,在常温处理下其相对表达量最高。共获得6个转基因拟南芥株系(L_(1)~L_(6)),其中转基因株系L_(3)和L_(6)较转空载体拟南芥和野生型拟南芥延迟抽薹8 d。通过分段扩增获得AfFT3基因启动子3段序列(AfFT3-P1、AfFT3-P2和AfFT3-P3),长度分别为390、1077和552 bp,通过酵母单杂试验推测启动子序列AfFT3-P1和AfFT3-P3可与AfEIN3蛋白发生互作。【结论】高温、低温胁迫和乙烯均不同程度诱导AfFT3基因的高效表达,但在高温和低温条件下乙烯对AfFT3基因的表达诱导效果较常温有所降低,其转基因株系延迟抽薹,说明AfFT3基因参与调控蜻蜓凤梨开花过程,且响应温度和乙烯信号。

葡萄转录因子VvERF2耐盐功能鉴定

【目的】对葡萄转录因子VvERF2进行蛋白质生物信息学分析,利用基因克隆、同源遗传转化技术,探索该转录因子在葡萄愈伤组织盐胁迫下的功能,为进一步研究AP2/ERF超家族对葡萄的作用机理提供参考。【方法】借助NCBI-Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)等在线数据库工具对VvERF2蛋白进行生物信息学分析;以‘无核白’葡萄(Vitis.viniferaL.)愈伤组织为材料,构建葡萄VvERF2同源遗传转化体系,结合生长量、总糖、总酸等理化指标鉴定转基因愈伤组织表型;设定不同盐浓度梯度,通过游离脯氨酸、抗氧化酶活性等生理指标鉴定转基因愈伤组织耐盐功能。【结果】对VvERF2及一致性最高的7个直系同源蛋白序列进行生物信息学分析,发现VvERF2编码240个氨基酸,与番茄、无花果氨基酸序列高度相似,蛋白同源性分别为78%和67%。8种不同物种的氨基酸残基数为240—348个,分子量为26.43—38.60 kDa,理论等电点在5.54—8.68,脂肪氨基酸指数均大于66%,均属于不稳定性蛋白;不同物种氨基酸序列理化性质存在差异较大。此外,VvERF2启动子存在多种与脱落酸等激素及MYB等转录因子相关的顺式作用元件。VvERF2具有组织表达特异性,在愈伤组织中表达水平最低,且受外源盐胁迫诱导显著上调(为对照组的3倍)。转基因结果表明,VvERF2在葡萄愈伤组织中过量表达后,生长量、总酸、总酚含量及DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼,1,1-Diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine)等抗氧化活性均显著升高,不同浓度外源NaCl处理后,转基因愈伤组织总蛋白、游离脯氨酸等含量均高于野生型愈伤组织。【结论】VvERF2过量表达促进葡萄愈伤组织生长量和次生代谢产物相关物如酚类物质的含量积累,从而提高葡萄耐盐性。

丹参SmJRB2基因的克隆与功能鉴定

【目的】丹参Salvia miltiorrhiza是治疗心脑血管疾病的常用中药材。解析丹参药效物质合成代谢的分子调控机制能为丹参优质新品种的选育提供科学依据。【方法】基于比较转录组挖掘获得响应甲基茉莉酸(MeJA)诱导的转录因子SmJRB2。采用同源克隆技术克隆获得该基因的编码序列,并进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析SmJRB2基因的组织表达和MeJA诱导表达特征;基于农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的丹参遗传转化技术对SmJRB2基因的功能进行鉴定。【结果】SmJRB2共编码501个氨基酸,属于bHLH转录因子家族的MYC类转录因子。SmJRB2基因在丹参叶片和主根中的表达量最高。SmJRB2基因强烈响应MeJA的诱导,诱导4.0 h时表达量最高。超表达SmJRB2促进丹参酮的积累,抑制表达SmJRB2基因则降低丹参酮的合成。【结论】SmJRB2是丹参酮代谢合成的正向调节因子。

割手密转录因子SsW RKY1提高甘蔗品种抗旱能力的功能鉴定

SsWRKY1是甘蔗属野生种割手密WRKY家族成员基因,开展SsWRKY1基因的功能分析,为研究SsWRKY1参与干旱调控的分子机制提供有价值的信息。本研究利用农杆菌介导转化技术获得SsWRKY1过表达株系和RNAi干扰株系,PEG干旱胁迫处理发现过表达株系受干旱胁迫伤害程度明显轻于非转基因植株,而干扰表达株系则表现严重的干旱胁迫伤害;过表达株系脯氨酸(Pro)含量显著增加,丙二醛(MDA)含量显著下降,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶活性出现不同程度的提高,且胁迫响应基因MAPK级联信号传递基因MAPK、ABA生物合成基因NCED、脯氨酸生物合成基因P5CS、以及ROS清除系统基因SOD、POD、CAT的表达水平明显升高,说明过表达SsWRKY1能够提高甘蔗应对干旱胁迫的能力。本研究表明,SsWRKY1基因通过激活抗氧化系统和调节胁迫响应基因的方式增强了甘蔗对干旱的抗性,可作为甘蔗抗性遗传改良的重要基因资源。

甘蓝型油菜酪氨酸代谢关键基因FAH的克隆、功能鉴定和表达分析

克隆甘蓝型油菜(Brassica napus L.)酪氨酸代谢关键基因FAH,对其进行功能验证和表达分析,为进一步解析FAH在甘蓝型油菜中的作用和功能提供理论依据。以甘蓝型油菜‘westar’为试材,克隆与拟南芥AtFAH同源性最高的甘蓝型油菜FAH基因BnaA06g38260D(BnaA06FAH)和BnaC05g49430D(BnaC05FAH),通过生物信息学分析其亲缘关系,构建过表达载体转化拟南芥突变体sscd1进行功能验证。克隆BnaA06FAH和BnaC05FAH启动子序列,利用PlantCare在线数据库分析启动子调控元件,构建启动子和GUS的融合载体,通过GUS组织化学染色分析其表达模式。结果显示,BnaA06FAH和BnaC05FAH与AtFAH的氨基酸序列相似性分别为93.11%和92.40%,2个基因过表达都可以完全抑制拟南芥突变体sscd1在短日照下模拟病斑的形成,暗示BnaA06FAH和BnaC05FAH都与AtFAH功能相似。BnaA06FAH和BnaC05FAH启动子除具有所必需的TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外,都含有多个与光诱导、激素响应和逆境胁迫响应元件以及多种与抗病相关的顺式作用元件,但与BnaA06FAH相比,BnaC05FAH与拟南芥AtFAH相同的顺式作用元件更多;GUS活性检测表明,BnaC05FAH启动子驱动的GUS基因的表达比BnaA06FAH强,并且两者驱动表达的组织部位不完全相同。因此,BnaA06FAH和BnaC05FAH启动子的作用部位和作用强度都存在明显差异。BnaA06FAH和BnaC05FAH都能够调控拟南芥sscd1模拟病斑的形成,但两者启动子驱动下游基因的强度和部位不同。

苹果MdZHD5响应盐胁迫反应的功能鉴定

土地盐渍化不仅影响果树的生长发育,对其产量和品质也具有重要影响。本研究利用基因登录号(HF21126)于苹果基因组中获取MdZHD5基因序列,以苹果‘金冠’叶片的cDNA为模板对其进行克隆。该基因编码区序列全长为1044 bp,氨基酸数量达347个,预测蛋白等电点为7.09。系统发育关系分析显示,苹果MdZHD5与拟南芥AtZHD5、AtZHD6、AtZHD7、AtZHD13以及苹果MdZHD2、MdZHD13的亲缘关系较近;氨基酸序列比对分析表明,苹果MdZHD5与MdZHD2、MdZHD3、MdZHD6等ZHD蛋白同源相似度较高,其中与MdZHD2同源相似度最高。MdZHD5蛋白定位在细胞核,具有一定的酵母自激活活性。此外,启动子元件预测分析显示该基因启动子序列中有多个与胁迫激素和非生物胁迫相关的顺式作用元件。MdZHD5响应非生物胁迫的表达分析表明在该基因转录水平上受低温、高盐胁迫显著诱导上调表达。MdZHD5过表达可通过降低相对电导率和丙二醛(MDA)水平以增强转基因苹果愈伤对盐胁迫的抗性。

人外周血巨噬细胞培养及功能鉴定

目的：从人外周血单个核细胞（PBMC）中分离单核细胞,诱导分化成巨噬细胞并鉴定其功能。方法：应用免疫磁珠法从人外周血单个核细胞中分选CD14^＋单核细胞,分离后的细胞用流式细胞仪检测其纯度,用含有10%人AB血清和10 ng/ml人M-CSF的IMDM培养基体外培养CD14^＋单核细胞,诱导分化成巨噬细胞,并进行形态特征和吞噬功能鉴定。结果：免疫磁珠法能从外周血中分离到高纯度的CD1^4＋单核细胞,分选前CD14阳性率为10%,分选后CD14阳性率为85.8%。诱导培养7天后巨噬细胞的直径最大可达40~45μm,大部分细胞呈煎蛋状,能有效地吞噬淋巴瘤Raji细胞。结论：从外周血中分离了高纯度的CD14^＋单核细胞,诱导形成的巨噬细胞具有吞噬淋巴瘤细胞的功能。

中药青蒿鲨烯合酶的大肠杆菌表达、纯化与功能鉴定

利用PCR方法,将经RACE方法克隆到的中药青蒿鲨烯合酶cDNA(AF302464)开放阅读框的3′末端截短99bp,插入到原核表达载体pET30a(+)的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间,构建N端和C端均携带有HIS6表达标签的鲨烯合酶重组表达载体pETSSA.将pETSSA转入大肠杆菌BL21(DE3),0.5mmol/LIPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactoside)28℃诱导重组鲨烯合酶的表达.表达产物经镍琼脂糖柱纯化.纯化蛋白加入酶促反应体系(含FPP和NADPH),GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物,结果显示重组鲨烯合酶可以催化FPP向鲨烯的转化.青蒿鲨烯合酶的功能鉴定为进一步利用反义或RNAi技术限制甾类生物合成,从而提高青蒿中的青蒿素含量提供了基础.

橡胶树水通道蛋白基因HbPIP1和HbPIP2的功能鉴定及其表达分析

利用非洲爪蟾卵母细胞对橡胶树水通道蛋白基因HbPIP1和HbPIP2进行功能鉴定,发现HbPIP1具有快速水分传输功能而HbPIP2不具该功能。推测HbPIP1基因表达可能与乙烯利刺激橡胶树增产机制有关。因此,选择对乙烯利较敏感的橡胶树PR107品种,利用RT-qPCR和Western blot技术检测HbPIP1在转录和翻译水平的表达变化,探讨其与乙烯利刺激后橡胶树排胶体积、排胶时间、干含和总固形物变化的关系。结果表明:HbPIP1在树皮、胶乳和次生木质部中具有较高的表达量;胶乳中HbPIP1的表达量随乙烯利刺激时间延长呈上升趋势,而树皮中HbPIP1的表达量则呈降低的趋势;乙烯利通过调节HbPIP1的基因表达促进水分向乳管细胞的运输,从而降低胶乳干含和总固形物,延迟排胶时间,增加排胶体积和产量。

东亚钳蝎氯毒素BmKCT的表达和功能鉴定(英文)

从中国东亚钳蝎ButhusmartensiiKarsch的毒腺cDNA文库中分离得到了一个编码毒素蛋白多肽 (命名为BmKCT)前体的全长cDNA序列 .该毒素多肽与已报道的氯毒素 (chlorotoxin)高度同源 ,其蛋白质一级序列有 6 8%的同源性 .为了鉴定BmKCT的生物学功能 ,通过pGEX系统成功地表达了BmKCT ,并用GST亲和层析和凝胶过滤的方法获得了纯化的重组BmKCT毒素蛋白 (rBmKCT) .通过膜片钳实验 ,记录了rBmKCT对人脑星型胶质瘤细胞 (gliomascell)表面的氯离子通道电流的作用 .结果显示 ,BmKCT可以显著抑制人脑星型胶质瘤细胞表面的氯离子通道电流 ,并且这种抑制作用在一定程度上是可逆的 .实验证明 ,在细胞水平上 ,BmKCT是一种新的短链氯离子通道抑制剂 .

具有维持造血干/祖细胞能力的新型豆类凝集素的分离、纯化及功能鉴定

一种分离自豆类的新型凝集素不仅具有凝集活性 ,还具有体外长期维持造血干 /祖细胞的能力 .由眉豆(Dolichoslablab)中分离得到了这种多亚基的凝集素———FRIL (Flt3receptor interactinglectin) ,并对它进行了核酸和蛋白质序列分析 .免疫细胞分析显示 ,它的受体是CD34+ 造血干 /祖细胞所特有的 .在培养基中添加这种凝集素可长期维持CD34+ 细胞存活和增殖能力 .以Flt3配基 (FL)作为对照 ,在 2 8天的培养时间内 ,相对于FL ,FRIL可维持细胞较高的G0 /G1期比例 (80 %以上G0 /G1期 )和长期培养中 (1 4天以上 ) 1 5倍以上的集落形成量 .可见FRIL通过滞留造血干 /祖细胞于G0 /G1期而维持它们的自我更新潜能 .

外周血造血干细胞体外定向诱导树突状细胞及功能鉴定

目的 :以实体瘤患者外周造血干细胞 (PBSC)为来源 ,建立体外诱导扩增树突状细胞 (DC)的方法 ,并进行表型鉴定及功能检测 .方法 :以血细胞分离机分离经动员的外周造血干细胞 ,加入rhGM CSF ,rhIL 4和nrhTNF α培养 7～ 9d成为树突状细胞 ,进行细胞形态学、表型及刺激T细胞增殖能力分析 .结果 :PBSC经诱导培养后 ,倒置显微镜和电镜显示典型的树突状细胞形态和超微结构 ;流式细胞术分析显示细胞表面抗原高表达 ,其中CD1a 38.2 8% ,CD11c 6 6 .77% ,共刺激分子CD80和CD86分别为 5 1.0 5 % ,6 7.5 8% ,MHCⅡ类分子HLA DR为 72 .0 9% ,为典型的DC表型特征 ,同种混合淋巴细胞反应结果显示DC具有高效的刺激T淋巴细胞活化增殖的能力 .结论

Lactobacillus diolivorans二醇脱水酶激活因子基因的克隆、测序与功能鉴定

根据二醇脱水酶与甘油脱水酶的激活因子基因序列同源性分析,设计简并引物从L.diolivorans基因组DNA中扩增出了假定的二醇脱水酶激活因子基因(gldG、gldH)全序列,补全了GenBank中该基因序列的未知部分,构建了表达质粒pSE-gldGH,以E.coliBL21为宿主,进行诱导表达.表达产物的变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明:gldGH表达产生68ku、13ku两个蛋白质,它们经金属螯合亲和层析与凝胶过滤得到共纯化,纯化产物即假定的激活因子为分子质量约325ku的蛋白质聚合体,由这两个蛋白质以等摩尔量组成,因此假定的激活因子可能为α4β4亚基结构.以L.diolivorans二醇脱水酶为对象,进行激活实验,结果证实gldGH表达产物具备二醇脱水酶激活因子的功能.

重组融合蛋白MBP-BSH在大肠杆菌中的表达及其纯化、功能鉴定

选择IF2融合标签,另选择含SUMO、GST、NusA和MBP融合标签的质粒构建表达载体。SDS-PAGE电泳结果显示,重组菌Escherichia Rosetta(DE3)(pLS932-BSH)的诱导表达细胞提取液上清出现了明显的融合蛋白MBP-BSH条带,经诱导表达条件优化后,MBP-BSH可溶性大幅度提高。用Ni-NTA Resin和Amylose Resin分别进行目标蛋白纯化,结果显示前者效果更好,并且C端融合His-Tag更有利于其与Ni离子结合,MBP-BSH蛋白纯化量更大,杂带更少。茚三酮显色反应测定酶活力,结果显示纯化后的MBP-BSH的酶比活力为2.4282U/mg。

苹果异三聚体G蛋白α亚基基因MdGPA1的克隆及功能鉴定

【目的】异三聚体G蛋白(Heterotrimeric G protein)作为植物生物体内重要的信号转导分子,在感受外界环境刺激、参与植物抗逆反应和跨膜信号转导等方面发挥着重要作用。克隆异三聚体G蛋白α亚基基因MdGPA1,并在烟草中过量表达MdGPA1,对其进行生物学功能鉴定和生理指标分析,为多年生木本植物响应环境因子信号转导过程中的分子机理研究提供参考。【方法】本研究以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica‘Royal Gala’)为研究试材,利用同源序列比对和PCR技术,克隆获得MdGPA1。使用MEGA5.0构建GPA1物种间系统进化树;利用qRT-PCR方法检测该基因在苹果受非生物胁迫诱导表达及组织特异性表达情况。构建MdGPA1植物过表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草叶片,比较干旱胁迫条件下野生型和转基因株系的表型与生理指标,验证MdGPA1在植物干旱胁迫条件下的生物学功能。【结果】克隆得到苹果异三聚体G蛋白α亚基基因MdGPA1(基因序列号:MDP0000881842),该基因长为1 173 bp,编码390个氨基酸。进化树分析表明MdGPA1与白梨Pb GPA1亲缘关系最近,同源性最高。基因表达分析显示MdGPA1主要在叶片中表达,在根系中的表达量次之,在茎和果实中的表达量较低。定量分析表明,该基因参与干旱、低温和盐等非生物逆境胁迫响应,在150 mmol·L^(-1)Na Cl、150 mmol·L^(-1)甘露醇、10%PEG和4℃胁迫条件下表达量明显下调,在5%H_2O_2胁迫处理下表达量明显上调。在烟草中过量表达MdGPA1,发现MdGPA1转基因烟草表现出对干旱敏感的表型特征,其叶片鲜重、叶绿素含量以及脯氨酸含量明显低于野生型烟草。在地下部,MdGPA1转基因烟草同样表现出对干旱敏感的表型特征;其根系形态相比于野生型较小,干重也明显低于野生型。【结论】MdGPA1参与了植物感受外界环境刺激的过程,对干旱、低温和盐等非生物逆境胁迫都存在着不同程度的响应。在烟草中异源表达MdGPA1后,提高了烟草对干旱的敏感性,转基因烟草表现出不耐干旱的表型,受干旱胁迫比野生型烟草更为严重,说明MdGPA1在响应植物抗旱胁迫中起着负调控作用。

耐放射异常球菌海藻糖合成酶基因的克隆及功能鉴定

利用生物信息学手段 ,在GenBank中进行氨基酸序列的同源性比较分析 ,检索到来自于耐放射异常球菌(Deinococcusradiodurans)基因组序列中一功能未确定的开放阅读框 (ORF) ,其氨基酸序列和已报道的海藻糖合成酶的氨基酸序列有约 6 0 %的同源性 .将这段ORF克隆到大肠杆菌进行表达 ,并进行功能鉴定 .实验表明这段ORF序列所编码的是一种海藻糖合成酶 ,它能将麦芽糖分子转化成海藻糖分子 ,以 30 %的麦芽糖为底物时能将约 6 5 %的麦芽糖转化成海藻糖 .重组酶性质初步研究表明 ,在 pH 7 0 ,最佳温度 30℃转化麦芽糖效率 最高 .

高山被孢霉GDP-L-岩藻糖合成途径中GDP-甘露糖-4,6-脱水酶的克隆、表达和功能鉴定

GDP-L-岩藻糖是糖复合物生物合成和糖类代谢的重要中间产物,作为岩藻糖转移酶的供体参与岩藻糖基化反应,具有重要的生理功能。高山被孢霉是重要的产油真菌,是唯一在分子水平上证明可合成GDP-L-岩藻糖的真菌。GDP-L-岩藻糖从头合成途径中的GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(GMD)能催化GDP-D-甘露糖合成GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖。对高山被孢霉中的GMD基因进行克隆、表达和功能鉴定,可进一步阐明GDP-L-岩藻糖体内代谢的分子生物机制。首先对GMD序列进行分析,并以p ET28a+质粒为骨架构建了GMD的表达载体,然后转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。进一步利用Ni金属螯合层析纯化目的蛋白,采用液相色谱-质谱法分析酶反应产物,表明纯化蛋白具有GMD活性。最后对高山被孢霉进行发酵培养,发现GDP-L-岩藻糖产量在氮源耗尽后较高,可达0.10 mg/g。同时GMD的转录水平在氮源耗尽后发生了明显的上调,表明GMD在氮源耗尽后对高山被孢霉体内GDP-L-岩藻糖的合成具有重要作用。这为进一步利用高山被孢霉发酵生产GDP-L-岩藻糖和酶法转化生产GDP-L-岩藻糖奠定了理论基础。