北细辛精油对桔小实蝇杀虫活性及其机理研究

[目的]对北细辛精油对桔小实蝇的熏蒸和触杀的杀虫活性进行研究,并初步确定北细辛精油对桔小实蝇的杀虫机理,旨在寻找天然有效的植物源杀虫剂。[方法]采用密闭熏蒸法和微量点滴法测定北细辛精油对桔小实蝇的熏蒸及触杀活性,采用微板法测定北细辛精油对桔小实蝇体内乙酰胆碱酯酶(AchE)和羧酸酯酶(CarE)活力的影响。[结果]在杀虫活性试验中,随着北细辛精油浓度的增加,杀虫效果均逐渐增强,且随着时间的延长,毒性也均逐渐增强;在熏蒸试验中,当浓度为1mL/L且处理时间为12h时,校正死亡率达到最大为100%;在触杀试验中,当浓度为156.25μL/L且处理时间为12 h,校正死亡率达到最大为100%;对桔小实蝇进行熏蒸处理、触杀处理12h的LC_(50)分别为0.243 mL/L、30.884μL/L;用固定浓度为156.25μL/L的北细辛精油处理桔小实蝇不同时间后,其体内AchE和CarE整体均表现为抑制作用,用不同浓度的北细辛精油处理桔小实蝇8 h后,虫体内的AchE呈现低浓度诱导高浓度抑制的作用,北细辛精油对桔小实蝇体内CarE的抑制作用随着浓度的增大而不断增强。[结论]北细辛精油对桔小实蝇有较好的触杀和熏蒸活性,且触杀活性较强,北细辛精油对桔小实蝇体内的AchE和CarE均有抑制作用。该研究为天然植物源杀虫剂的研发提供理论依据。

气相色谱-质谱分析北细辛根和根茎中的挥发性成分

采用色谱 质谱联用技术对北细辛根和根茎的挥发性成分进行分离分析 ,鉴定出了 36种化学成分 ,主要成分为十五烷、甲基丁香酚、黄樟醚、3 ,5 二甲氧基甲苯等。对照北细辛根和根茎的分析结果可以发现 ,两者的挥发性成分基本相同 ,但含量有较大差异 ,这为北细辛的临床合理用药及质量控制标准的确定提供了实验依据。

三种不同方法提取北细辛挥发油的成分分析

目的:探讨三种不同方法提取的北细辛挥发油成分的异同。方法:将北细辛用水蒸气蒸馏法、超临界二氧化碳萃取法提取的挥发油,超临界二氧化碳萃取的挥发油再减压浓缩除去挥发性成分,这三种方法得到的三组挥发油用气质联用方法进行成分分析。结果:水蒸气蒸馏法和超临界二氧化碳萃取法提取北细辛的挥发油有36个成分,其中相同的成分有16个,含量各不相同,超临界二氧化碳萃取后再提取法主要得到的是挥发油中的非挥发性成分,共鉴定出11种化学物质,主要为油脂类。结论:实验通过比较研究不同提取方法所得的北细辛挥发油成分,得出了它们之间的共同成分及相对含量,首次通过对超临界二氧化碳萃取法提取的挥发油中的不挥发性成分进行分析,为中药材北细辛的药用成分和质量控制提供了一定依据。

北细辛种子萌发特性研究

北细辛（Asarum heterotrpoides Fr.var.mandshuricum （Maxim.）kitag.）是东北道地中药材,为多年生阴生植物,以种子繁殖.种子为胚形态后熟和生理后熟型种子,生产上,从播种到发芽约需10个月时间.本文通过对北细辛种子萌发特性进行研究,揭示光照、温度、种子干燥方式及激素对种子萌发能力的影响,对其生态适应性进行了讨论.结果表明：（1）北细辛种子对光照敏感,是需光种子.（2）恒温15℃下培养的种子,5周可达到最大萌发率,而其他温度条件下则需要8 ～12周,15℃是最适萌发温度.（3）在低于10℃或高于28℃下,种子不能萌发.（4）变温10℃/20℃,15 ℃/25℃,20℃/30℃条件下,种子萌发率分别为79.92％、94.52％和18.21％,差异显著（p＜0.05）,导致种子萌发率低的主要因素是高温.种子在6月末脱离母体是躲避高温、适应生态环境以延续生命的一种方式.（5）经赤霉素处理,可促进种子提前1周萌发,并提高种子的萌发速率,但不能提高种子萌发率.（6）赤霉素可以解除种子上胚轴休眠.经赤霉素处理的已萌发的种子,4周后可以发芽.依据本试验结果,可实现北细辛种子在2个月内生根发芽.

北细辛挥发油对5种镰刀菌的抑菌活性及其成分分析

以水蒸气蒸馏法提取北细辛挥发油,通过菌丝生长速率法和孢子萌发法,研究其对5种马铃薯干腐病致病菌镰刀菌的抑菌效果,优化提取方法,并采用气质联用法分析挥发油的化学成分。结果表明北细辛挥发油对5种供试镰刀菌抑制作用显著,且抑菌活性与挥发油浓度呈剂量依赖性。不同方法提取的4组挥发油共鉴定出51种成分,其中18种组分相同,均以甲基丁香酚和黄樟醚为主,两者总含量达50%以上。地下部分挥发油含量明显高于地上部分,且超声辅助浸提法提取率更高。因此,北细辛挥发油可进一步开发为植物源农药,具有很好的开发前景。

北细辛种子贮藏过程中生活力及种胚形态后熟研究

通过对北细辛（Asarum heterotropoides Fr.Var.mandshuricum（Maxim）kitag.）种子种胚萌发能力的验证、贮藏过程中种子活力测定以及种胚形态石蜡切片观察。结果表明,离体胚在25℃恒温、3 500-4 000 lx光照条件或暗条件下培养均枯死,北细辛种子采收后种胚不具有萌发能力。种子在3 500-4 000 lx光照条件下培养,5周后开始萌发,而在暗培养条件下,5周后则不萌发。室温条件下沙藏,北细辛种子活力保持不变,活力指数为88.3%-88.7%。种胚形态解剖结构观察发现,北细辛种胚发育过程为经过球形胚、心形胚、鱼雷型胚、具有完整子叶胚等阶段,其胚轴伸长、胚根伸长直至发芽。

北细辛种子萌发过程中内源激素含量的变化

目的:通过对北细辛种子萌发过程中的内源激素含量和变化规律进行测定和分析,阐明4种内源激素在促进种胚发育和种子萌发过程中的作用机制,为北细辛种子保存、加速种子萌发进程等提供理论基础。方法:采用酶联免疫法(ELISA)对北细辛种子萌发过程中的赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、玉米素核苷(ZR)和脱落酸(ABA)进行测定。结果:从新鲜种子到沙藏14 d,种子中的ABA含量呈逐渐增加趋势,从第21天开始,ABA含量呈逐渐下降。从新鲜种子到沙藏35 d,GA3、ZR含量逐渐增加而后逐渐降低,呈"抛物线"变化趋势。IAA含量变化曲线呈"波浪型",新鲜种子中的IAA含量最高,沙藏70 d后,含量降到最小值。结论:种胚发育过程伴随着赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、玉米素核苷(ZR)和脱落酸(ABA)含量的消长,激素含量的变化影响着种胚形态发育和种子萌发。

北细辛全草和根中马兜铃酸A的含量测定及小鼠急性毒性实验研究

目的：测定北细辛全草及根中马兜铃酸A的含量及其急性毒性。方法：马兜铃酸A的含量测定采用反相高效液相色谱法，色谱柱为phenomenex C18（4．6mm×250mm），流动相为甲醇-水-醋酸（63：36：1）。检测波长为390nm，流速1．0mL／min，柱温35℃；急性毒性试验采用小鼠灌胃给药最大给药量法。结果：HPLC法测定细辛中马兜铃酸A含量，线性范围为20．2—121．2ng，北细辛全苹及细辛根的平均回收率分剐为97．2％和98．1％；北细辛全草及根中马兜铃酸A的平均含量分刺为61．40μg／g和45．80μg/g；北细辛全草及根1g／mL水提取物给小鼠灌胃给药，LD50不能测出，耐受量大于40g／kg。结论：马兜铃酸A的含量测定法准确、可靠。重现性好，精密度高；北细辛全草中马兜铃酸A的含量高于细辛根中马兜铃酸A的含量；小鼠对北细辛全草和细辛根的水提取物具有较高的耐受性，耐受倍数相当于药典规定的临床剂量的800倍，比较安全。

北细辛不同生长期甲基丁香酚和黄樟醚的气相色谱法定量分析

对北细辛不同生长期所含甲基丁香酚（ｍｅｔｈｙｌｅｕｇｅｎｏｌ）和黄樟醚（ｓａｆｒｏｌｅ）用气相色谱法进行了定量分析。结果表明：地下部分甲基丁香酚以萌动期和果后期含量为最高；黄樟醚以萌动期、花期和果后期为最高。地上部分二者均以花期为最高，以后各时期依次减少。

北细辛内生真菌的分离鉴定及代谢产物的生物活性

采用表面消毒法分别从3种北细辛中分离获得10株形态特征不同的优势内生真菌,经形态学和18S rDNA ITS分子分类学分析鉴定为小丛壳属(Glomerella sp.)、叶点霉属(Phyllosticta sp.)、柄孢壳菌属(Po-dospora sp.)、刺盘孢属(Colletotrichum sp.)和镰孢属(Fusarium sp.)。对北细辛优势内生真菌的发酵产物进行体外抗肿瘤和抗菌活性检测,结果表明:除菌株E3、E4和E10外,其余菌株均有不同程度的抗肿瘤和抗菌活性;镰孢属(Fusarium sp.)菌株E9对A549、MDA-MB-231和PANC-1肿瘤细胞抑制率达75%以上;小丛壳属(Glomerella sp.)菌株E1和叶点霉属(Phyllosticta sp.)菌株E2靶向FabI的抗菌活性较强,抑制率达59%。

北细辛悬浮培养体系的建立及优化

以北细辛(Asarum heterotropoides)幼嫩叶柄诱导的愈伤组织为材料,初步建立悬浮培养体系,同时探讨接种量、光照、培养液量、转速、蔗糖浓度、激素配比等因素对细胞生物量的影响。结果表明,100mL的1/2MS液体培养基中,2g愈伤组织是最适接种量,蔗糖浓度为30g·L^(-1),摇床转速150r·min^(-1),0.6mg·L^(-1) 6-BA+0.3mg·L^(-1) NAA,全天光照培养时细胞生长量最大。北细辛悬浮细胞生长曲线大致为"S"型,悬浮细胞的最佳收获周期为15d。经悬浮培养后可快速获得细胞团及多种形态的单细胞,可为北细辛悬浮细胞的大规模生产提供依据,并进一步提升北细辛的应用价值。

北细辛再生植株形态结构及其挥发油成分GC-MS分析

目的研究北细辛再生植株形态结构,并通过GC-MS法分析其挥发油成分。方法常规石蜡切片法观察再生植株解剖结构。微波辅助萃取法提取挥发油后,GC-MS法对其进行分离鉴定。结果北细辛再生植株无地上茎,具有多数不定根,2枚真叶基生;根为三原型,由表皮、皮层、中柱3部分组成;叶柄维管束由基部到上部具有3-5-3的规律。再生植株与原植株根中挥发油成分相同,均以甲基丁香酚和黄樟醚为主;两者叶中挥发油成分不相同,其中前者相对含有量较高的为黄樟醚和甲基丁香酚;后者黄樟醚相对含有量极低,并且未检测出甲基丁香酚。结论北细辛再生植株未发生明显表型变异,其挥发油主要成分为黄樟醚和甲基丁香酚。

北细辛(Asarum heterotropoides)营养器官的形态结构及其挥发油的组织化学定位

以东北地区道地中草药北细辛为材料,利用石蜡切片技术研究了营养器官的形态结构,同时以苏丹Ⅲ溶液对其药用成分挥发油进行组织化学定位。结果表明,北细辛无地上茎,单叶丛生,叶柄较长。地下根茎呈簇状,近直立生长。根为二、三和四原型,由表皮、皮层和中柱3部分组成;根茎有板状增厚的厚角组织,维管形成层不明显,次生结构不发达;叶片的组织分化清晰,叶柄维管束数目由近轴端到远轴端具有3-5-3的规律。挥发油主要分布在根茎的皮层、髓及根的皮层中。

北细辛提取物对二斑叶螨的毒性

分别采用玻片浸渍法和叶片残毒法测定了北细辛不同溶剂提取物对二斑叶螨雌成螨和卵的触杀活性,采用生化方法测定了高活性提取物作用下雌成螨谷胱甘肽巯基转移酶(GSTs)和Na+,K+-ATP酶的活性。结果表明:北细辛甲醇提取物杀螨作用最强,经1 mg/ml提取物处理24 h后,雌成螨与卵的校正死亡率分别为66.5%与45.7%,致死中浓度(LC50)分别为0.57 mg/ml和0.88 mg/ml;1/2 LC50浓度的甲醇提取物可使雌成螨GSTs活性升高,同时抑制雌成螨Na+,K+-ATP酶的活性。说明:北细辛甲醇提取物对二斑叶螨雌成螨和卵具有触杀活性,作用机制可能与抑制Na+,K+-ATP酶的活性有关。

北细辛超临界萃取物挥发性成分的GC-MS分析

采用超临界流体萃取法(SFE)和水蒸气蒸馏法分别对北细辛根及根茎进行提取分离,分别得5.5%SFE萃取物和2.8%挥发油。应用GC-MS分析,从北细辛SFE萃取物中鉴定出7种化学成分,占萃取物总量的72.70%,其中甲基丁香酚为44.62%;从细辛挥发油中鉴定出19种化学成分,占挥发油总量的88.53%,其中甲基丁香酚为43.02%。两种方法有6种成分完全相同,其中致癌物质黄樟油素SFE法比蒸馏法低2.8倍。北细辛根及根茎超临界萃取物与水蒸汽蒸馏挥发油主要成分相同,但其化学组成存在较大差异,提示药效亦不相同。超临界流体萃取法是剂型改革的有效方法之一。

北细辛挥发油与营养元素的相关性研究

测定了吉林省通化产六年生北细辛不同生育时期挥发油与营养元素的积累量,并通过SAS软件进行相关性分析。结果表明:北细辛挥发油含量与氮、磷、钾含量间呈显著的正相关,且与磷的相关系数最大,达0.893 5,呈极显著正相关,与氮相关系数为0.580 4,与钾的相关系数为0.508 5。在与其他微量元素的相关性比较中发现,硫与挥发油的相关系数较大,为0.629 5,超过与氮和钾的相关系数,但其显著性概率较低仅为0.069 3。经回归分析,挥发油与营养元素间的函数方程为挥发油=-0.886 4+0.000 8 N+0.568 6 P-0.012 2 K-16.620 2 B-5.326 1 Zn。

北细辛挥发油对二斑叶螨的毒性及其酶的影响

采用气相/质谱分析了北细辛挥发油的化学成分,并研究了北细辛挥发油对二斑叶螨的薰蒸毒性,以及对谷胱甘肽巯基转移酶(GSTs)与Na+,K+-ATP酶活性的影响。结果表明:有9种含量大于1%的化学成分占北细辛挥发油总量的86.1%,其中甲基丁香酚含量最高(22.9%),其次为黄樟醚(19.8%);北细辛挥发油在8μg/mL时对二斑叶螨的熏蒸毒性最强,其24和48 h的螨死亡率分别为72.6%和100%;以4μg/mL北细辛挥发油薰蒸,在24 h内螨Na+,K+-ATP酶活性下降、GSTs活性升高。本研究结果提示北细辛挥发油有开发为农业用杀螨剂的潜在价值。

北细辛种子萌发过程中蛋白质、多糖及酶活性的变化

以北细辛种子为材料,通过测定种子不同萌发时期可溶性蛋白质、可溶性糖含量、超氧化物歧化酶(SOD)及过氧化物酶(POD)活性的变化情况,研究了北细辛种子在不同温度处理下,种子发育过程中物质的积累模式及相关酶活性的变化,以了解温度对种子组分的调节机理。结果表明:温度对种子萌发进程起到重要的影响。北细辛种子萌发过程中可溶性糖含量从第3周起迅速升高,之后缓慢下降;可溶性蛋白质含量总体呈上升趋势;超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性整体都表现出上升趋势。

北细辛种子检验及质量分级标准初步研究

参照《国家农作物种子检验规程》研究北细辛种子检验方法,并对不同来源的82份种子样品千粒重、含水量、净度、生活力、发芽率等质量指标进行测定,利用正态分布曲线法、平均值±标准差法制定北细辛种子质量分级标准。结果表明：2种分级方法种子质量分级指标相近,利用正态分布曲线法初步建立了北细辛种子质量分级标准：绝对千粒重不小于4.49 g、净度不小于99%、生活力不小于97%为Ⅰ级种,绝对千粒重不小于3.79 g、净度不小于93%、生活力不小于90%定为Ⅱ级种,绝对千粒重不小于3.33 g、净度不小于89%、生活力不小于85%定为Ⅲ级种,各级种子含水量均在52%~67%之间。