单纯疱疹病毒胸苷激酶基因介导GCV治疗人膀胱癌的实验研究

探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶 (Herpes sim plex virous thym idine kinase,HSV- TK)基因介导的丙氧鸟苷(Ganciclovir,GCV )系统对人膀胱癌细胞 (T2 4 )生长的抑制作用。利用电穿孔技术将携有 HSV- TK基因的重组逆转录病毒载体 (p L XSN- TK)导入包装细胞 PA317,获得转染后的逆转录病毒包装细胞 PA317/ TK。将 BAL B/ c裸鼠 2 4只随机分为 4组 (每组 6只 ) ,建立人 T2 4裸鼠荷瘤模型。治疗 1,2组分别瘤内注射病毒悬液或 PA317/ TK细胞后再经 GCV处理。对照 1,2组则分别瘤内注射等量生理盐水或 PA317/ TK细胞后再经等量 GCV或生理盐水处理。观察各组肿瘤体积和瘤重的变化 ;采用原位杂交技术分析 HSV - TK基因在肿瘤组织中的表达 ;采用流式细胞仪技术 (Flow cytom etry,FCM )和末端脱氧核苷酸介导的 X- d U TP缺口末端标记技术 (Termininaldeoxynucleofidyl trasferase- mediated d U TP nick end labelling technigue,TUNEL )检测膀胱癌细胞凋亡。结果表明 :(1)逆转录病毒介导的 HSV- TK基因在体内能转染 T2 4细胞 ,联合运用 GCV后 ,肿瘤的生长速度明显减慢 ;(2 ) HSV - TK/ GCV治疗后膀胱癌细胞凋亡现象明显增强。以上结果提示 T2 4荷瘤裸鼠内 HSV - TK/ GCV系统对T2 4细胞的生长有明显的抑制作用 ,且可能?

全反式维甲酸与单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对胶质瘤的协同杀伤作用

背景与目的:细胞间缝隙连接通讯(gapjunctionalintercellularcommunication,GJIC)是介导单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpessimplixvirusthymidinekinase,HSV-tk)基因治疗中旁观者效应的重要机制。全反式维甲酸(all-trans-retinoticacid,ATRA)可能通过上调胶质瘤细胞GJIC和抑制肿瘤细胞生长的双重作用,促进HSV-tk基因治疗的疗效。本研究的目的在于证实HSV-tk和ATRA联合应用对胶质瘤细胞的协同杀伤作用。方法:分别以1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L3种浓度的ATRA作用于培养的大鼠C6胶质瘤细胞,并研究ATRA对C6胶质瘤细胞分化、增殖、GJIC及connexin43(Cx43)基因转录等方面的影响。将C6细胞与稳定表达HSV-tk基因的C6tk细胞按不同比例混合,分别在含GCV和不同浓度ATRA或仅含GCV的培养基中培养,并于药物作用7天后用MTT法检测旁观者效应。结果:经3种浓度的ATRA作用后,C6胶质瘤细胞均显示出细胞分化的形态学特征。C6细胞的增殖也明显受到ATRA的抑制,绝大多数的活细胞都静止于G1期,100μmol/LATRA对C6细胞增殖的抑制尤其明显,并诱导细胞凋亡。经3种浓度的ATRA分别作用后,C6细胞的GJIC也明显提高,而Cx43基因的转录未受明显影响。旁观者效应实验的结果显示,3种浓度的ATRA均可以明显增强旁观者效应。

全反式维A酸对单纯疱疹病毒胸苷激酶基因结合更昔洛韦旁观者效应增强作用及其机制

目的 通过研究全反式维A酸 (ATRA )对单纯疱疹病毒胸苷激酶基因结合更昔洛韦 (HSV tk/GCV)旁观者效应的增强作用及与Cx4 3表达的关系 ,为提高TK自杀基因的疗效及探索增强作用机制提供实验基础。方法 应用Polybrene转染、荧光定量RT PCR等技术 ,观察ATRA对宫颈癌细胞ME180 ,ME180 /TK转化细胞旁观者效应及诱导Cx4 3mRNA表达的作用。结果 ME180 ,ME180 /TK不同比例的混合细胞随ATRA浓度的增加而存活率降低。ME180 +ME180 /TK混合细胞的存活率随ME180 /TK细胞比例的增加而降低。在 2mg·L- 1更昔洛韦 (GCV)作用下 ,以 10 - 8mol·L- 1ATRA与不加ATRA (0mol·L- 1)的作用相比较 ,在ME180与ME180 /TK不同比例混合的各组中 ,细胞的存活率明显降低 (P <0 .0 5 )。并观察到10 - 8及 10 - 10 mol·L- 1ATRA对GCV旁观者效应的增强作用。RT PCR结果表明 ,经ATRA处理的ME180细胞 ,其Cx4 3mRNA的相对拷贝数比值增高约 1.84倍及 2 .6 5倍。结论 宫颈癌ME180细胞中 ,ATRA在10 - 8～ 10 - 10 mol·L- 1范围内 ,具有明显增强HSV tk/GCV旁观者效应的作用。其主要机制是通过ATRA在转录水平诱导Cx4 3mRNA表达上调 ,导致旁观者效应的增强。

白细胞介素-2基因与单纯疱疹病毒胸苷激酶基因联合治疗小鼠头颈鳞状细胞癌的研究

目的 观察白细胞介素 2 (interleukin 2 ,IL 2 )基因与单纯疱疹病毒胸苷激酶 (herpessimplexvirusthymidinekinase ,HSV TK)基因联合治疗小鼠头颈鳞状细胞癌的疗效。方法 建立小鼠头颈鳞状细胞癌动物模型后在荷瘤部位分别注射表达小鼠IL 2基因的重组腺病毒(recombinantadenovirus,Ad)和表达HSV TK基因的重组腺病毒AdHSV TK及联合注射组 ,对照组分别注射不带目的基因的腺病毒或磷酸盐缓冲液 (phosphaticbufferedsolution ,PBS)。对注射有AdHSV TK基因组和联合治疗组每日腹腔注射抗病毒药物更西罗韦 (ganciclovir,GCV) 2 5mg/kg体重 ,每日 2次连续 7d。观察肿瘤大小变化并检测脾脏自然杀伤细胞和颈淋巴结细胞毒性T淋巴细胞的活性 ,探讨其抗肿瘤机制。结果 AdIL 2和AdHSV TK联合治疗组 ,肿瘤生长明显受抑制 ,疗效显著优于单独治疗组和对照组 (P <0 0 5 ) ,在注射有AdIL 2基因的治疗组中 ,IL 2蛋白水平明显升高 ,自然杀伤细胞活性和细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性增强 ,肿瘤组织中可见大片坏死 ,并含有大量的CD+ 4 、CD+ 8淋巴细胞浸润。结论 AdIL 2基因治疗可提高肿瘤局部和全身的抗肿瘤免疫应答 ,能加强自杀基因AdHSV TK的抗肿瘤效果 ,两者联合应用能显著抑制小鼠头颈鳞状细胞癌的生长。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因工程化细胞和更昔洛韦系统的急慢性毒性

目的：探讨单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因工程化细胞（ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ）和更昔洛韦（ＧＣＶ）系统的动物体内急、慢性毒性。方法：将ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ和（或）以β－半乳糖苷酶基因为报告基因的ＰＡ３１７细胞悬液注入小鼠、大鼠和灵长类动物体内，７ｄ后部分动物再全身应用ＧＣＶ。分批处死动物，观察ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ和ＧＣＶ系统在不同种属动物的体内急、慢性毒性。采用ＰＣＲ和原位杂交方法直接检测胸苷激酶基因在动物脑和全身各脏器内的整合及表达情况。结合原位杂交和Ｘ－ｇａｌ染色结果，判断注射细胞在动物脑内的存活时间。结果：ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ和ＧＣＶ系统对动物的心、肝、肺和肾有一定的急性损害作用。该细胞在大鼠和猴脑内的存活时间为３周。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因联合更昔洛韦治疗肿瘤的机制

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)与抗病毒药物更昔洛韦(GCV)组成的药物敏感基因疗法在肿瘤基因治疗领域中引人注目,它产生的旁观者效应在一定程度上弥补了基因载体转染率不高的问题,在肿瘤自杀基因疗法中发挥着重要的作用,现对HSV-TK/GCV治疗肿瘤机制及其应用趋势作一综述。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因转染联合药物对卵巢上皮癌细胞杀伤作用的研究

目的 :探讨逆转录病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV1 tk)基因转染 ,联合抗病毒药物羟甲基无环鸟苷 ( ganciclovir ,GCV)和无环鸟苷 (acyclovir ,ACV )对人卵巢上皮癌 (OEC)细胞系TYK的杀伤作用。方法 :用lipofectionreagent介导法将PLNTK5质粒转移入包装细胞PA317中 ,用滴度最高的PA317病毒上清液转染TYK细胞 ,运用MTT法及光镜、电镜检测GCV、ACV对目的细胞的体外杀伤效应。结果 :将PLNTK 5质粒转入PA317细胞后 ,得到了稳定的产病毒细胞株。TYK细胞可被病毒上清液转染 ,转导HSV1 tk基因可显著增强ACV、GCV对TYK细胞的杀伤作用。结论 :逆转录病毒可介导HSV1 tk基因转染TYK细胞并获稳定表达 ,ACV、GCV对携有HSV1 tk基因的卵巢癌细胞有明显的体外杀伤作用。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因在骨肉瘤细胞中的表达和作用

目的 :观察单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSV TK)及其底物丙氧鸟苷 (GCV)的基因治疗系统对骨肉瘤细胞株SAOS 2的杀伤作用。方法 :用DOTAP将含有HSV TK基因的真核表达质粒tgCMV HyTK导入骨肉瘤细胞株SAOS 2 ;提取阳性转染细胞 (SAOS 2TK)的总RNA ,用斑点杂交的方法检测HSV TK基因的表达 ;用MTT比色法测定SAOS 2TK细胞对GCV的敏感性及“旁观者效应”。结果 :SAOS 2TK细胞能产生稳定的TK基因的转录产物 ;SAOS 2TK细胞在GCV的作用下呈现明显的生长抑制效应 ,且观察到强效的“旁观者效应”。结论 :HSV

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对肺腺癌细胞杀伤作用探讨

目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因转染联合抗病毒药物更昔洛韦(GCV)对人肺腺癌细胞系的杀伤作用。方法应用基因工程技术构建了携带单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因的逆转录病毒重组体pLXSN-tk,通过脂质体法转染PA317细胞,G418筛选出产重组病毒颗粒的生产细胞PA317-tk细胞。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测HSV-tk/GCV系统对人肺腺癌细胞系GLC-82的生长抑制率。结果 重组逆转录病毒载体能有效地将HSV-tk(基因导入GLC-82细胞系内并使其获得对GCV的敏感性。结论肺腺癌细胞转染HSV-tk基因后,能有效地被GCV杀死。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗结肠癌的研究

目的:观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)/丙氧鸟苷(GCV)自杀基因治疗系统在体内外对结肠癌的杀伤效应。方法:构建携带 HSV-tk基因的逆转录病毒载体,将该重组逆转录病毒感染结肠癌细胞株 SW480,筛选稳定表达 tk 的细胞克隆 SW4801tk,测定 SW480/tk 细胞在体外对GCV 的敏感性;SW480/tk 细胞在裸鼠皮下成瘤,用 GCV 治疗并观察疗效。结果:HSV-tk 基因整合入 SW480细胞并在 SW480/tk 细胞中稳定表达;GCV 在体外对 SW480/tk 细胞有明显的杀伤作用。其作用呈现剂量和时间依赖性特点和旁杀伤效应,对未转染细胞则无明显毒性。裸鼠 ex vivo实验得到相应结果,治疗组肿瘤受到明显抑制。结论在 in vitra 和 ex vivo 水平,表达 HSV-tk 基因的肿瘤细胞均可被 GCV 有效杀伤,逆转录病毒介导 HSV-tk/GCV 自杀基因治疗系统有可能成为结肠癌的有效治疗方法。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对人胶质母细胞瘤细胞的杀伤效应研究

目的 研究单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV1 TK)基因转染并联合抗病毒药更昔洛韦 (Ganciclovir ,GCV)对人胶质母细胞瘤细胞的杀伤效应。方法 采用基因工程技术构建带HSV1-TK基因的逆转录病毒重组体pLX SN TK ,采用脂质体介导入PA317包装细胞 ,建立重组逆转录病毒载体分泌细胞株PA317 TK ;用该细胞上清液转导人胶质母细胞瘤细胞 ,用不同浓度GCV作用人胶质母细胞瘤细胞SW0 38 C2 TK和野生型SW0 38 C2 ,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测 72h后细胞存活率 ,并求出半杀伤浓度。结果 重组逆转录病毒载体pLXSN TK能有效地将TK基因导入SW0 38-C2细胞内 ,并使其获得对GCV的敏感性 ;体外细胞毒实验 :在 2 0 μmol LGCV存在的情况下 ,野生型细胞无明显改变 ,而实验组细胞明显死亡 ,半杀伤浓度IC50 为 0 8μmol L ,与SW0 38 C2相比 ,对GCV的敏感性提高了 6 0 0倍 ,旁杀效果也较明显。结论 SW0 38 C2转染TK基因后 ,能有效地被GCV杀灭。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/Ganciclovir系统对脑胶质瘤动物模型的治疗

目的 探讨单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因 (HSV1 tk)结合Ganciclovir(GCV)治疗方案 ,在脑胶质瘤动物模型中基因治疗的疗效以及杀伤肿瘤细胞的机制。 方法 采用Southern杂交法 ,证实逆转录病毒载体生产细胞系pN2 A tk VPC(VPC)带有tk基因并稳定整合到基因组DNA上 ;再将VPC与人脑多形性胶质母细胞瘤细胞系DBTRG 0 5MG(0 5MG)分别以 1∶1、1∶4比例混合接种于BALB c裸鼠皮下 (以只接种 0 5MG细胞作为对照 ) ,建立裸鼠皮下胶质瘤动物模型 ,然后腹腔注射GCV治疗 [30mg (kg·d) ],连续 14d ,治疗后 1周 ,取出瘤块作病理组织学分析。 结果 1∶1组瘤块较 1∶4组和对照组明显减小 (P <0 0 1) ,且有 30 %的瘤块完全消失 ,提示HSV1 tk GCV对肿瘤细胞有显著杀伤效应。光镜观察可见 ,1∶1组细胞核固缩、溶解甚至破裂等坏死特征 ,说明HSV1 tk GCV在invivo水平杀伤肿瘤细胞是细胞毒杀伤效应。 结论 HSV1 tk GCV系统能有效杀伤肿瘤细胞 。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因真核表达载体的构建及其在食管癌细胞中的表达

目的 :构建含单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV -tk)基因的真核表达载体 (pcDNA3-tk) ,并观察能否在食管癌细胞株中表达。方法 :将HSV -tk的cDNA亚克隆于真核表达载体pcDNA3上 ,构建pcDNA3-tk。后者经脂质体介导转染食管癌细胞株Eca - 1 0 9,通过高剂量的G4 1 8选择培养 ,筛选出抗性克隆。经RT -PCR检测确定HSV -tk基因是否能在转染细胞内转录。结果 :成功地构建了真核表达载体pcDNA3-tk ,并且在pcDNA3-tk转染的食管癌细胞内发现tk基因的mRNA。结论 :含HSV

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因转导在供者淋巴细胞输注中的应用

供者淋巴细胞输注(DLI)作为治疗BMT后白血病复发的重要手段已被广泛应用,但GVHD是DLI的主要并发症。将单纯疱疹病毒胸苷激酶基因转导至供者外周血淋巴细胞,输给去T细胞的alloBMT术后复发患者,这样不仅建立了移植物抗白血病作用,而且如有严重的GVHD发生方可用丙氧鸟苷选择性去除体内供者淋巴细胞。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因表达对人肝癌细胞的生长抑制

使用转导有单纯疱疹Ⅰ型病毒胸苷激酶（ＨＳＶ１－ＴＫ）基因的人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细胞株建立了裸鼠移植瘤模型，并进行了在体和体外试验性无环鸟苷（ＡＣＶ）治疗。结果发现基因转导后的肝癌细胞表现出对ＡＣＶ的敏感性，肝癌细胞生长抑制与ＡＣＶ的剂量有关；用药组裸鼠除平均瘤重明显低于对照组外，还可见细胞核分裂指数降低，伴有细胞变性和坏死。结果表明：ＨＳＶ１－ＴＫ基因经逆转录病毒转导后，用ＡＣＶ诱导表达明显抑制了人肝癌细胞的生长。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)治疗大鼠9L胶质肉瘤的疗效

<正>为了评价HSV-tk基因转染加GCV治疗方案的效果,本研究采用Fischer 344大鼠9L胶质肉瘤模型,所使用的物品和实验的条件尽量同NIH研究组相同,包装细胞为G1TkSvNa 53,立体定向脑内接种4×10~4肿瘤细胞,第5天同样接种包装细胞1.5～6×10,第10～24天,腹腔注射GCV,15mg/kg。另外本研究还观察了体外转染tk基因后用GCV治疗的效果。结果:HSV-tk+GCV组的生存期是23.90±0.90天,HSV-tk+生理盐水组是24.0±0.4天,βgal+GCV组是24.7±1.8天,各组之间的存活期无显著差异,增加包装细胞的浓度也不能延长存活期。而体外转染tk基因(肿瘤细胞100％转染)接种于脑内后用GCV治疗可以治愈约1/4的大鼠,而同样皮下接种脑瘤模型却有约2/3的大鼠得到治愈。本研究还对“旁观者效应”(bystander effect)和GCV治疗浓度的问题进行了研究和探讨。

全反式维甲酸增强超声微泡包裹的单纯疱疹病毒胸苷激酶自杀基因治疗荷肝癌裸鼠的效果

目的探讨全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)能否提高微泡包裹的单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)自杀基因对肝癌的体内治疗作用。方法用人肝癌SMMC-7721细胞建立皮下裸鼠移植瘤模型,先检测不同剂量ATRA的抗肿瘤效应;再用ATRA联合基因治疗,实验分4组:磷酸盐缓冲液组、ATRA组、HSV-TK组、联合治疗组,各组测量肿瘤体积,计算抑瘤率,Western blot检测输注的目的基因质粒的表达,HE染色行病理学观察,免疫组化法检测连接蛋白Cx32的表达。结果 ATRA在1 mg/kg下无抗肝癌作用,但≥4 mg/kg即具有明显抗肝癌效应;抑瘤率在磷酸盐缓冲液组、ATRA组、HSV-TK组、联合治疗组分别为0、(7.46±7.25)%、(37.65±3.87)%、(59.04±3.08)%,联合治疗组分别与磷酸盐缓冲液组、ATRA组、HSV-TK组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。HE结果显示:采用ATRA联合基因治疗后,肿瘤坏死细胞明显较对照组多,免疫组化结果显示:ATRA处理过的组织中,Cx32蛋白表达增加,且以胞膜表达为主。结论 ATRA具有抗肝癌作用;ATRA能增强超声微泡包裹的HSV-TK自杀基因杀伤肝癌的效果,其可能机制与ATRA促进了Cx32蛋白的正常表达有关。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因在前列腺癌免疫治疗中的研究

肿瘤的发生发展与肿瘤逃逸密切相关，而在肿瘤逃逸的因素中，肿瘤细胞自身分泌的免疫抑制因子具有重要作用。我们用携带显性负相的转化生长因子（TGF）βⅡ型受体基因的慢病毒感染人CTL，使其对TGF-β失敏感，为晚期前列腺癌的治疗探索一条新的治疗途径。但是，大量CTL输入会导致免疫治疗的不良反应；我们在CTL体外扩增过程中，