单羧酸转运泵基因反义真核表达载体的构建

目的 构建单羧酸转运泵基因反义逆转录病毒真核表达载体。方法 应用RT PCR方法扩增带有双酶切位点的单羧酸转运泵目的基因片段 ,与带有相同酶切位点的pLXSN逆转录病毒真核表达载体粘末端进行反向基因插入连接 ,构建具有反义表达的逆转录病毒载体。结果 构建载体进行双酶切电泳分析及插入片段基因序列分析 ,证明反义载体构建成功。结论 应用RT PCR方法扩增插入DNA片段 ,简单、灵活、快捷。双酶切定向连接构建反义表达载体可实现构建一步到位 ,免去正反向筛选的麻烦。

人肺腺癌细胞单羧酸转运泵基因的克隆及基因序列分析

目的 克隆人肺腺癌细胞单羧酸转运泵基因编码序列并对此序列作同源性分析。方法 通过RT PCR方法克隆人肺腺癌A5 49细胞单羧酸转运泵基因cDNA编码序列 ,应用PCR、四色荧光、双脱氧终止法测序 ;通过Genebank数据库应用分析软件对克隆基因序列进行同源性分析。结果 应用RT PCR方法克隆出人肺癌细胞的单羧酸转运泵基因 ;肺癌细胞此基因编码序列与人心肌细胞单羧酸转运泵基因第一亚型的cDNA编码序列具有高度同源性。

人肺癌组织中单羧酸转运泵基因mRNA表达的变化

本文应用RT PCR方法扩增了人正常肺组织、肺癌组织中的MCT1、MCT2及 β actin基因mRNA ,以人 β actin基因RT PCR产物作为外参照 ,通过比较同一样本组中及样本组间MCT1、MCT2相对于 β actin的RT PCR产物的光密度比值 ,来分析判断MCT1、MCT2mRNA表达的高低。结果显示 ,MCT1在人正常肺组织、肺癌组织中的mRNA表达均高于MCT2 ;MCT1、MCT2基因mRNA在人肺癌组织中的表达明显高于癌旁正常肺组织。

甲状旁腺激素相关蛋白、单羧酸转运泵家族1信号通路对肺腺癌细胞衰老的调节作用及其机制

目的探讨调节甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)、单羧酸转运泵家族1(MCT1)信号通路对Lewis肺腺癌细胞株LLC细胞衰老的影响及其机制。方法将LLC细胞分为A、B、C、D组,每组10孔。分别加入PTHrP信号通路激活剂PTHrP(1~34)、PTHrP受体竞争抑制物PTHrP(7~34)、MCT1信号通路抑制剂AZD3965、PBS培养72 h后收集细胞。用β-半乳糖苷酶(βGal)染色法观察各组细胞衰老程度,结果以细胞中βGal阳性染色面积占细胞总面积的百分比表示。用实时荧光定量PCR方法检测各组细胞中PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表达。建立细胞pHi与细胞内BCECF荧光强度关系的标准曲线,细胞pHi结果以495 nm/440 nm延荧光强度比值表示。按照试剂盒说明书操作检测各组细胞外乳酸水平。结果 A、B、C、D组细胞中βGal阳性染色面积占总细胞面积百分比分别为8.47%±0.15%、12.56%±0.20%、16.66%±0.20%、9.52%±0.30%。B、C组细胞中βGal阳性染色面积占总细胞面积百分比与D组相比,P均<0.05。A、B、C、D组细胞中PTHrP mRNA表达量分别为11.49±0.42、7.68±0.10、8.56±0.13、9.35±0.13,MCT1 mRNA表达量分别为7.84±0.19、4.38±0.09、3.53±0.10、6.58±0.21。A组细胞中PTHrP mRNA表达量高于B、C、D组(P均<0.05);B组细胞中PTHrP mRNA表达量低于C、D组(P均<0.05);C组细胞中PTHrP mRNA表达量低于D组(P<0.05);A组细胞中MCT1 mRNA表达量高于B、C、D组(P均<0.05);B组细胞中MCT1 mRNA表达量高于C组(P<0.05),但低于D组(P<0.05);C组细胞中MCT1 mRNA表达量低于D组(P<0.05)。A、B、C、D组细胞pHi分别为3.39±0.12、6.05±0.12、7.08±0.09、4.66±0.08,细胞外乳酸水平分别为(8.34±0.12)、(5.13±0.15)、(3.39±0.10)、(7.33±0.11)U。A组细胞pHi低于B、C、D组(P均<0.05);B组细胞pHi低于C组(P<0.05),但是高于D组(P<0.05);C组细胞pHi高于D组(P<0.05);A组细胞外乳酸水平高于B、C、D组(P均<0.05);B组细胞外乳酸水平高于C组(P<0.05),但是低于D组(P<0.05);C组细胞外乳酸化水平低于D组(P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,各组细胞衰老程度与PTHrP mRNA表达量、MCT1 mRNA表达量、pHi、细胞外乳酸水平均相关,r分别为-0.613、-0.880、0.906、-0.961,P均<0.05。结论调节PTHrP、MCT1信号通路可以影响肺腺癌细胞衰老。其机制可能是由于PTHrP信号通路和MCT1信号通路相互影响,共同调节肺腺癌细胞的乳酸转运。

MCT1、CD147在非小细胞肺癌中的表达及其相关性研究

目的探讨单羧酸转运泵家族1(MCT1)、CD147(EMMPRIN)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达规律及其在NSCLC发生、发展、预后中的意义。方法取经病理确诊的56例NSCLC患者癌组织、癌旁组织(距肿瘤边缘>5 cm)和20例肺良性病变组织,并将癌旁组和肺良性病变组划为对照组与肺癌组比较,采用免疫组化法和实时荧光定量PCR法检测MCT1、CD147蛋白及mRNA表达,进行定性和定量分析。结果①在NSCLC组织中MCT1、CD147表达均明显高于癌旁组织及肺良性肿瘤差异具有统计学意义(P<0.05);②MCT1在肺癌细胞膜中表达、CD147表达呈正相关(P<0.05);③MCT1、CD147表达与NSCLC患者的肿瘤组织类型、淋巴转移均有关(P<0.05),另外MCT1(细胞膜)蛋白表达还与肿瘤分化程度及吸烟史有关(P<0.05),MCT1mRNA表达还与肿瘤分化程度有关(P<0.05)。结论在NSCLC患者组织中MCT1、CD147的表达具有显著相关性。

人肺癌细胞MCT2基因的克隆及其mRNA表达分析

目的 克隆人肺癌细胞单羧酸转运蛋白第二亚型基因 (MonocarboxylateTransporter 2 ,MCT2 )的编码序列 ,并对其在肿瘤组织细胞mRNA表达作半定量分析。方法 (1)通过RT PCR方法克隆人肺腺癌A5 4 9细胞中的MCT2基因片段。应用四色荧光、双脱氧终止法测序 ;通过Genebank数据库应用分析软件对克隆基因序列进行同源性分析。 (2 )采用半定量RT PCR方法比较人肺癌组织、癌旁正常肺组织及人肺癌细胞株中MCT2mRNA的表达水平。结果 (1)应用RT PCR方法克隆出人肺癌细胞的MCT2基因片段 ;肺癌细胞此基因编码序列与人肝细胞MCT2基因的cDNA编码序列具有高度同源性。 (2 )人肺癌组织及人肺癌细胞株中MCT2mRNA的表达非常显著地高于癌旁正常肺组织 (P <0 .0 0 1)。结论 MCT2基因为一序列保守的基因 。

PTHrP、MCT1信号通路对非小细胞肺癌细胞衰老的调节机制研究

目的研究探讨甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)、单羧酸转运泵家族1(MCT1)信号通路对非小细胞肺癌衰老的调节机制。方法将2014年5月-2018年5月在该医院培养的80孔非小细胞肺癌A549细胞分为A、B、C、D共4组,每组20孔。其中A组细胞中加入PTHrP信号通路抑制剂、B组细胞加入MCT1信号通路抑制剂、C组细胞加入PTHrP信号通路激活剂、D组细胞加入等量的PBS培养液,4组细胞经联系72 h培养。采用β-半乳糖苷酶染色法(β-Gal)观察4组细胞的衰老程度。对4组细胞进行PCR扩增,以实时荧光定量PCR方法检测PTHrP mRNA、MCT1mRNA的表达量。并对各组细胞中pHi染色小体的和细胞外乳酸水平进行检测比较。并采用Pearson检验对各指标间进行相关性分析。结果①4组细胞间β-Gal染色阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05),其中A组、B组阳性率(13.98±2.53)%、(14.23±3.21)%均高于D组(10.09±2.98)%,C组阳性率(8.29±2.10)%则低于D组,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。②4组细胞的PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表达量比较差异有统计学意义(P<0.05),其中A组、B组PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表达量[(7.09±1.53)、(5.29±1.22);(7.26±1.61)、(4.98±1.17)]低于D组[(9.13±1.98)、(7.19±1.68)],而C组表达率[(12.32±2.09)、(9.57±1.98)]则高于D组,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。③4组细胞的p Hi染色小体的和细胞外乳酸水平比较有统计学差异,A组、B组pHi染色小体水平高于D组,C组则低于D组,A组、B组细胞外乳酸水平低于D组,C组则高于D组,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。④Pearson相关性检验显示,各组细胞的β-Gal染色阳性率(即衰老程度)与PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表达量呈负相关性,与pHi染色小体水平呈正相关性,与细胞外乳酸水平呈负相关性(P<0.05)。结论 PTHrP、MCT1信号通路状态可以对非小细胞肺癌细胞的衰老起到调节作用,PTHrP、MCT1间相互影响,共同调节肺癌细胞的乳酸转运过程。

Effect of antisense transfecting of monocarboxylate transporter gene on biological characteristics of lung adenocarcinoma A549 cells

Objective: To study the influence of transfecting antisense expression vector of the first subtype of the monocarboxylate transporter (MCT1) gene into lung cancer cells on pHi regulation, lactate transportation and cell growth. Methods: MCT1 antisense gene recombinant vector was introduced into human lung cancer cell line A549 by electroporation. The transfected A549 cells resistant to G418 were selected. Positive clones were examined by using PCR. The changes of intracellular pH and lactate were examined with spec-trophotometric method. Cell growth was studied with cell growth curve. Results: Intracellular pH and lactate were remarkably decreased in the cells transfected pLXSN-MCT1 in comparison with A549 cells without transfection (P<0. 001). The growth of A549 cells transfected pLXSN-MCTl was also inhibited remarkably. Conclusion: MCT1 gene may play an important role in pHi regulation, lactate transportation and cell growth in tumor cells.