用宏基因组分析南方鲇(Silurus meridionalis)肠道菌群及抗性基因组成

为了解人工养殖南方鲇(Silurus meridionalis)肠道菌群结构以及抗性基因的组成,采用宏基因组测序技术和生物信息学方法分析人工养殖南方鲇肠道菌群,分离验证了6株不同的细菌。结果显示,肠道菌群共注释到47个门、1425个属、4171个种,其中类志贺邻单胞菌(Plesimonas shigelloides)为优势种,3个样本中相对丰度分别为23.3%、23.4%和26.4%。KEGG分析显示,南方鲇肠道菌群的基因主要参与糖类代谢和氨基酸代谢过程。GO分析显示,南方鲇肠道菌群的基因主要参与代谢过程、细胞成分和催化反应。CARD数据库注释,鉴定出5151个抗性基因,注释到31种抗生素类型,其中有7个抗性基因未注释到具体抗生素。成功分离、培养和纯化了类志贺邻单胞菌、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,)、维氏气单胞菌(A.veroni)、温和气单胞菌(A.sobria)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)6种细菌。本研究结果为南方鲇肠道菌群结构提供初步分析,并统计了抗性基因携带情况,以期为南方鲇人工养殖病害防治提供参考数据。

南方鲇幼鱼胃和肝脏的组织结构及其在饥饿过程中的变化

描述了南方鲇（Ｓｉｌｕｒｕｓｍｅｒｉｄｉｏｎａｌｉｓ）幼鱼的胃和肝脏的基本形态和组织结构及其在饥饿过程中的变化．发现随饥饿时间延长，胃粘膜皱褶高度、粘膜下层厚度、上皮细胞高度及胃腺厚度均有明显减少趋势．肌肉层厚度呈先降后升再下降的趋势．饥饿过程中还发现各层组织，特别是肌肉层有结缔组织增生和崩溃疏松的现象．饥饿鱼肝脏的肝细胞体积明显减小，细胞索紊乱，细胞间隙增大．

灭活菌苗免疫的南方鲇外周血液细胞免疫指标的变化

以嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)灭活菌苗为免疫原,以平均体重为86 20g人工饲养的健康南方(Silu rusmeridionalis)为实验对象,通过腹腔注射免疫原(浓度为1 0×108/mL)免疫,剂量为0 2mL/尾,并分别在免疫后的第1、2、4、7、14、21、28天对实验鱼尾静脉采血,进行血液生理指标和血液中吞噬细胞活性的测定。结果显示,嗜水气单胞菌灭活菌苗(FKC)可以增加南方外周血液白细胞数量并引起不同种类白细胞组成比例的变化,提高吞噬细胞的吞噬活性。在免疫后第1、2、4、7、14、21、28天,南方外周血中白细胞数量呈明显上升趋势,其中嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞变化趋势更为明显;而且吞噬细胞活性大为提高,吞噬百分比较对照组平均升高了17 66%,吞噬指数比对照组平均升高了1 16,在免疫后第4天吞噬百分比和吞噬指数均达到最高值,吞噬百分比为48 40%,吞噬指数为4 82;免疫后第21天,吞噬百分比和吞噬指数开始下降,但仍高于对照组。由此表明,使用疫苗后,鱼类非特异细胞免疫在初期(尤其是在第2～7天)明显增强,这是鱼用疫苗在免疫早期保护作用的主要机制之一。

南方鲇的营养学研究:Ⅲ.饲料脂肪对蛋白质的节约效应

于 1 997年 1 0月至 1 2月对南方鲇 (Silurusmeridionalis) (初始体重 :30— 44g)进行人工配合饲料的喂养实验。实验以白鱼粉和玉米油作蛋白质和脂肪源 ,共配制 6种不同蛋白质 /脂肪比的饲料 ,其蛋白质 (P)和脂肪 (L)的含量分别为 43%P/1 5%L ,47%P/1 5%L ,51 %P/1 6%L ,50 %P/8%L ,54%P/8%L ,58%P/8%L。实验每饲料水平设 4个重复 ,采用室内循环水养殖系统 ,在 2 7 5℃下以饱足日粮水平喂养 6周。实验结果表明 :供以高脂肪低蛋白质饲料组的鱼体的特殊生长率(SGR)和饲料转化率 (FCE)与低脂肪高蛋白饲料组的无显著差异 ;而前者喂养的实验鱼的蛋白质效率 (PER)显著大于后者。因此 ,南方鲇饲料脂肪对蛋白质有明显的节约效应。

不同蛋白含量饲料对南方鲇胃蛋白酶和淀粉酶活性的影响

为探讨营养、饲料与鱼类消化酶之间的相互作用 ,采用蛋白含量分别为 4 4 8%、2 9 1%和 13 3%的饲料饲养南方鲇 (Silurusmeridionalis) ,并在第 0d、15d、2 5d和 5 0d对胰脏、胃黏膜、前肠黏膜和后肠黏膜的胃蛋白酶 (酸性蛋白酶 )和淀粉酶活性进行了动态分析。结果显示 :1)饲料中蛋白含量为 2 9 1%— 4 4 8%时南方鲇的生长速度显著快于低蛋白含量饲料 (13 3% ) ;2 )在实验后期 (2 5d后 ) ,中等蛋白含量饲料组南方鲇的生长速度比其他两组快 ,此阶段该组鱼胃黏膜的胃蛋白酶活性呈上升趋势 ,而另两组该酶活性则呈下降趋势 ;低蛋白饲料组前肠黏膜和后肠黏膜的淀粉酶活性在实验后期急剧下降 ,与该组鱼的生长最慢相关联 ;3)在实验的 5 0d内 ,不同蛋白含量饲料对胃蛋白酶和淀粉酶活性在各组织器官中的分布特征影响不大。实验期间 ,南方鲇消化器官中这两种消化酶活性的变化情况表明 ,在实验的不同阶段 ,饲料中的蛋白含量对南方鲇胃蛋白酶和淀粉酶的合成、分泌和活性大小的影响是不同的。

南方鲇继饥饿后的恢复生长

1996年1月至4月在27．5℃条件下，对南方鲇幼鱼（初始体重：73．65±9．82g）进行了不同时间的饥饿处理后再供食的恢复生长实验。实验鱼饥饿60d后，鱼体比能值、蛋白质含量及脂肪含量明显下降，灰分含量及含水量明显上升。分别将饥饿处理0（对照）、10、20、30、40、50和60d的南方鲇再恢复喂食，在饱足摄食水平下生长20d。各饥饿处理组的鱼体化学组成及比能值均接近，并恢复到对照生长组水平。饥饿处理50d组的干重及能量生长率，湿重、干重及能量摄食率显著高于对照组的相应值。通过讨论认为：（1）饥饿处理50d的南方鲇在恢复生长过程中产生了显著的补偿效应；（2）该补偿现象主要因摄食水平显著升高所致。

南方鲇生长激素完整cDNA的克隆及其DNA序列分析

采用RT-PCR法和3'、5'RACE(Rapid amplification of cDNA ends)法从南方鲇脑垂体RNA克隆出生长激素(Growth hormone,GH)cDNA。此cDNA全长1087nt(含 Poly(A)》,其5'端非编码区长52nt、阅读框(Open reading frame,ORF)长603nt、3'端非编码区长415nt。其推导的GH由200个氨基酸组成,其中前24个氨基酸为信号肽部分。氨基酸序列比较表明,南方鲇GH与Pangasianodongigas、Ictaluruspunctatus和Heteropneustes fossilis三种鲇类的同源性分别为97.5%和95.0%,与鲢、鳙、草、鲤和鲫鱼的GH同源性达76.0%以上,而与人的GH(Ⅰ、Ⅱ)同源性最低为31.0%和29.5%.

饥饿对南方鲇幼鱼游泳能力个体变异和重复性的影响

为考察肉食性鱼类有氧和无氧运动能力的种内个体变异、重复性及其对饥饿的响应,研究以南方鲇(Silurus meridionalis Chen)幼鱼为实验对象,在(25±0.5)℃条件下测定对照组(n=28)和饥饿组(n=29)的临界游泳速度(Critical swimming speed,Ucrit)、暴发游泳速度(Constant acceleration speed,Ucat)和固定流速耐受时间(Endurance),分析游泳能力的个体变异、稳定性及饥饿的影响。结果显示:(1)饥饿组的体重、体长和肥满度均分别显著下降了(15.10±0.86)%、(2.57±0.40)%和(7.94±1.59)%(P<0.05),而对照组无明显变化;(2)对照组的Ucat和耐受时间无明显变化(P>0.05),但Ucrit下降(6.63±2.25)%(P=0.031),而除耐受时间外饥饿组其Ucrit和Ucat分别显著下降了(26.00±2.76)%和(13.68±1.86)%(P<0.001),并饥饿组Ucrit的下降比例显著大于其Ucat(P<0.001);(3)并且对照组三个指标的变异系数(Coefficient of variation,CV)变化方向和程度不尽相同,饥饿组的Ucrit、Ucat和耐受时间的CV全部增加;(4)南方鲇幼鱼Ucrit和Ucat呈正相关且2周的饥饿并未改变此正相关。饥饿明显降低南方鲇幼鱼两种游泳能力并导致游泳能力的个体变异变大,但没有改变该种鱼的有氧运动能力和无氧运动能力之间的内在正相关关系。研究表明无氧运动能力在环境改变后显得更为保守,种内个体变异的变动可能有利于在相同自然选择压力下种内个体采取不同的捕食和避敌对策。

南方鲇的营养学研究:饲料的最适蛋白质含量

设计了 6个不同蛋白质水平 (39.9% ,43.7% ,46.8% ,51 .6% ,55.7% ,59.1 % )的等能饲料 ,采用室内循环水养殖系统 ,在水温为 2 7.5± 0 .2℃的条件下对南方鲇幼鱼进行了 43d的生长实验。结果显示 :随饲料蛋白质含量的升高 ,特殊体重生长率 (SGR)、饲料干物质转化率 (FCEdm)、蛋白质转化率 (FCEp)、能量转化率 (FCEe)和蛋白质效率 (PER)均产生了显著的差异 (P <0 .0 5) ;干物质摄食率 (RLdm)与饲料蛋白质含量负相关 (r=- 0 .62 ,P <0 .0 1 ) ;蛋白质摄食率 (RLp)与饲料蛋白质含量正相关 (r=0 .96,P <0 .0 1 ) ;能量摄食率 (RLe)不受饲料蛋白质含量的影响 (P >0 .0 5)。通过讨论提出南方鲇饲料的最适蛋白质含量为 47%～ 51 %。

南方鲇Vasa基因两种亚型cDNA的克隆及其表达

采用RT-PCR和RACE相结合的方法,从南方鲇分离到Vasa基因的两个亚型scVasa和scVasa-s。它们是同一基因在5′端经选择性剪接的产物,其cDNA全长分别为2525bp和2438bp,编码662和641个氨基酸。两者均具有DEAD-box家族成员特有的8个保守基序和Vasa的典型特征。南方鲇Vasa与银鲫相似性最高(73.3%)。两个亚型均特异地表达于雌雄性腺中。原位杂交结果表明:scVasa主要在卵巢Ⅰ、Ⅱ时相的卵母细胞和精巢的精原细胞和初级精母细胞中表达。半定量PCR结果显示,在生殖周期中,两种亚型在以Ⅱ时相卵母细胞为主体的卵巢恢复期表达均高于以Ⅲ-Ⅳ时相卵母细胞为主体的卵黄生成期。

饲料碳水化合物水平对南方鲇幼鱼餐后糖酵解酶活性及血糖浓度的影响

配制含0%、15%和30%糊化玉米淀粉的等能饲料分别作为对照、中水平和高水平碳水化合物(CHO)饲料,以体重为50.5±0.6g的南方鲇幼鱼为实验对象,在水温27.5±0.5℃的条件下以对照饲料驯化15d后,分别测定了以三种饲料投喂的南方鲇在餐后3、61、2、24和48h的己糖激酶(HK)、葡萄糖激酶(GK)和磷酸果糖激酶(PFK-1)的活性和血糖水平。结果发现,中、高水平CHO组HK活性在餐后24h时显著高于对照组(P<0.05),其余时间点各组间无显著差异;GK活性随CHO水平增加而增加,但其活性的绝对值远低于HK;PFK-1活性在各组间及同组内各时间点均无显著差异。通过分析认为,南方鲇体内葡萄糖磷酸化主要由HK催化,但其活性受饲料CHO水平的影响不明显;GK活性受饲料CHO的诱导而增高,使葡萄糖磷酸化加速,但最大增幅不超过30%;此外,催化果糖-6-磷酸进一步转化为果糖-1,6-二磷酸的PFK-1活性不受饲料CHO水平的影响,因此糖酵解过程的这两个代谢环节均不能在鱼体吸收高糖营养后有效地加速,这应当是该肉食性鱼类在高水平CHO营养条件下产生高血糖积累的重要原因。实验结果表明,血糖变化呈现先升高后降低的趋势,中水平和高水平CHO组的血糖峰值均出现在餐后12h,这作为在该类研究中设定血液取样时间的实验依据。

南方鲇幼鱼的胃排空特征及其数学模型

为考察摄食后专性肉食性鱼类南方鲇幼鱼胃内容物重量的变化特征并确定其最优数学模型,研究以南方鲇幼鱼为实验对象,在25℃条件下以6%(5.8%±0.2%)鱼体重的新鲜泥鳅肉块[(3.33±0.09)g]为实验饵料,分别在摄食后0、2、4、8、16、24、36、48 h测定南方鲇幼鱼[(58.45±1.66)g,(19.4±0.2)cm,n=48]胃内容物的湿重和干重。研究结果表明,随摄食后时间的延长,胃内容物的湿重和干重均显著下降(P<0.01),二者的摄食量百分比也具类似的变化特征(P<0.01);三种数学模型均能较好地拟合胃内容物重量的变化过程,但三者之间在以相关系数(R2)、残差平方和(RSS)及残差的标准差(SDR)为标准仍存在明显差异。用平方根模型对南方鲇幼鱼胃内容物湿重和干重数据的拟合结果最优,其方程分别为Y0.5=1.889-0.051×t(R2=0.87,P<0.001)和Y0.5=0.870-0.024×t(R2=0.86,P<0.001);南方鲇幼鱼在25℃下的胃排空率为0.051 g/h,其99%胃排空时间为36.7 h,该种鱼近99%胃排空时间的实测值为餐后36 h,这与最优数学模型的计算结果较为接近;南方鲇与鲇具有类似的胃排空特征和相同的最优数学排空模型。

南方鲇两种生长激素受体的结构分析及其组织分布和激素调节

采用生物信息学方法,从东方(Fugurubripes)基因组中分离出两种不同基因编码的GHR1(fGHR1)和GHR2(fGHR2)。随后设计引物,采用RT-PCR和SmartTMRace相结合的方法从南方鲇(Silurusmeridionalis)肝脏中克隆出两种不同基因编码的生长激素受体,即GHR1(scGHR1)和GHR2(scGHR2)cD-NA,其全长分别为1985bp(编码602个氨基酸)和2300bp(编码553个氨基酸)。这两种受体都含有生长激素受体典型的标志性基序FGDFS,以及细胞内属于细胞因子受体家族共有的Box1和Box2序列框。同时两者又存在差异,表现在胞外半胱氨酸残基和胞内酪氨酸残基数目的不同。采用半定量RT-PCR方法研究了scGHR1和scGHR2在南方鲇各组织中表达量的差异,结果表明:scGHR1和scGHR2有广泛的组织分布,在肝脏中两者的表达量最高。用17β-雌二醇(E2)、17α-甲基睾酮(MT)和可的松(cortisol)对南方鲇进行药物处理,结果表明E2能够下调肝脏scGHR1和scGHR2mRNA水平,而MT上调scGHR1和scGHR2mRNA水平。同时,经cortisol处理后scGHR1mRNA表达水平上升,而scGHR2mRNA表达水平不变。

双向急性变温对南方鲇幼鱼静止耗氧率和临界游泳速度的影响

为了考查鱼类对温度变化的功能适应和生理反应特征,以不同驯化温度(10、20和30℃,驯化两周)为对照,进行双向急性变温处理(20℃→10℃和20℃→30℃),分别在不同时间(0.5、1、2、4、8和24h)对南方鲇(Silurus meridionalis Chen)幼鱼静止耗氧率(Resting oxygen consumption rate,VO2)进行测定并在处理后及时测定实验鱼的临界游泳速度(Critical swimming speed,Ucrit)。研究发现:不同驯化温度下实验鱼的Ucrit随驯化温度升高呈显著增加的变化趋势,相对临界游泳速度(Relative critical swimming speed,Ur)分别为1.83、2.87和3.37 BL/s(Body length per second)(P<0.05);双向急性变温两组的Ur分别与驯化组均无显著差异(P>0.05);Ur与温度的关系表达为:Ur=0.8114T+1.0976(n=37,R2=0.973,P<0.05)。VO2也随驯化温度升高呈显著增加的变化特征,分别为14.91、28.34和44.98 mg O2/kg·h(P<0.05)。双向急性变温对VO2的影响十分显著。急性升温组的静止耗氧率呈现先上升后下降并趋稳定的变化规律,其静止耗氧率的Q10值的峰值(3.1)出现在升温后的0.5h,是对照组的1.96倍;而急性降温组的静止耗氧率则急剧连续下降至相对稳定水平,其Q10值的峰值(4.8)出现在降温后的1.0h,是对照组的2.5倍。研究表明:在相同的变温幅度下,双向急性变温对南方鲇幼鱼均存在明显的生理胁迫;不同温度变化方向的代谢反应特征却不尽相同,急性降温对南方鲇幼鱼造成的生理胁迫可能大于急性升温;当环境温度发生骤然变化时,实验鱼的运动生理功能具有较好的温度适应能力。研究提示,迅速降温后水流刺激可能会终止鱼类的"冷休克",引起整体的代谢水平的重新调节,以满足运动的能量需求并提高生存适合度。

南方鲇幼鱼和成鱼血液指标的比较

测定了南方鲇(Silurus meridionalis)幼鱼和成鱼部分血液生理及生化指标,结果表明,南方鲇幼鱼和成鱼血液中红细胞数量(RBC)、白细胞数量(WBC)、白细胞分类计数(DLC)、血红蛋白(Hb)、血糖(GLU)、总蛋白(TP)、胆固醇(CHOL)及甘油三酯(TG)二者差异不显著,在对幼鱼与成鱼做血液诊断时这些指标可以用同一个标准。成鱼血液中谷草转氨酶(GOT)活性显著高于幼鱼,而幼鱼血液中谷丙转氨酶(GPT)、碱性磷酸酶(AKP)活性显著高于成鱼,幼鱼血液中氯离子(Cl-)浓度极显著高于成鱼,在对南方鲇幼鱼和成鱼做血液学诊断时需要设定不同标准。

南方鲇幼鱼运动代谢的个体变异和重复性及其饥饿响应

为考察温水性鱼类运动代谢的种内个体变异和重复性及其对饥饿的反应,本研究以南方鲇幼鱼为实验对象,在(25±0.5)℃条件下,在饥饿前(测定Ⅰ)后(测定Ⅱ)分别测定饥饿组[(12.15±0.14)g,n=29,饥饿2周]和对照组[(12.00±0.23)g,n=28,每隔一天投喂一次4%~5%体质量黄鳝肉块]的静止代谢率(MO2rest)、临界游泳速度和活跃代谢率(MO2active),并计算有氧代谢空间(AMS=MO2active-M O2rest)、单位距离耗能(COT)和最适游泳速度(Uopt)。结果显示:(1)饥饿之后,饥饿组的MO2rest,MO2active和AMS分别下降了8.6%,36.3%和44.1%,而对照组的M O2rest较其两周前的上升25.9%,其MO2active的无显著变化导致AMS下降了12.6%,但该降幅明显小于饥饿组。(2)饥饿组MO2rest的变异系数(CV)变小,其MO2active和AMS的CV却变大,而对照组相应指标的CV呈反向的变化趋势。饥饿组MO2rest,MO2active和AMS的重复比例均相应低于对照组。(3)饥饿组在两次测定中运动耗氧率与游泳速度的线性方程的斜率保持不变,但其截距明显下降,对照组的斜率和截距均无明显变化;饥饿导致南方鲇运动耗氧率的重复性下降。(4)饥饿组的最小COT(COTm in)和Uopt分别下降25%和11.3%,对照组的COTm in和Uopt也分别降低8%和4.8%,但均明显小于饥饿组。研究表明:在环境食物资源匮乏情况下,南方鲇表现出较高的运动代谢重复性,其降低最适游泳速度并提高游泳效率的策略是对饥饿环境的一种生态适应,可能有助于提高该种鱼的存活率。

南方鲇的繁殖生物学研究：繁殖时间、产卵条件和产卵行为

南方鲇的雌鱼３－４龄性达成熟，雄鱼２—３龄性达成熟；在此期间，同龄组中已成熟个体的体长、体重、肥满度和成熟系数的平均值均大于未成熟个体。繁殖期为３月中旬至５月中旬，其间，嘉陵江平均水温为１５—２４℃。雌鱼的性腺在６－８月由Ⅵ期退化至Ⅱ期，９至１１月经Ⅲ期发育至Ⅵ期，１２月至来年２月以Ⅳ期性腺状况越冬。雌、雄鱼成熟系数周年曲线均为单峰型，该种鱼为单批产卵类型。产卵场为流水卵石浅滩，水深０．４－１．５ｍ，流速每秒０．７ｍ左右。产卵前雌雄亲鱼有相互激烈追逐、咬斗的发情行为．

南方鲇脑垂体发育的研究

对不同发育阶段南方鲇脑垂体的显微和超微结构进行了研究。结果表明 :南方鲇脑垂体由两个不同部位的胚胎细胞形成。源自胚胎原始口腔顶壁的上皮细胞团构成垂体的前、中腺垂体和部分后腺垂体 ;从间脑腹面漏斗体分离出来的细胞构成神经垂体和部分后腺垂体。受精后 32h ,原始口腔上皮细胞增生 ,口腔顶壁细胞群内凹 ,开始向内迁移 ;受精后 38h ,上皮细胞与口腔顶壁分离 ,形成实心细胞团 ,并沿着前脑腹面向间脑方向迁移 ;受精后4 5h ,细胞团迁移到间脑底部下方 ;初孵仔鱼原始口腔顶壁上皮细胞团位于间脑底部 ,与漏斗体接触 ;出膜后 36h ,上皮细胞团与漏斗体分离出来的细胞结合 ;出膜后 4 8h ,腺垂体和神经垂体清晰可辨 ;出膜后 4d ,腺垂体可区分前、后两部分 ;出膜后 6d ,GH细胞开始分化 ;出膜后 10d ,前、中、后腺垂体分化形成 ;出膜后 4 8d ,除GTH细胞外 ,其他分泌细胞均已分化 ;6月龄 ,分泌细胞分化完成。 1冬龄和 2冬龄幼鱼脑垂体仅前、中、后腺垂体体积及分泌细胞比例和部分细胞的超微结构与成鱼不同。

南方鲇头肾的组织学和超微结构

采用解剖学、组织学、组织化学方法 ,通过电镜观察 ,研究了南方鲇 (SilurusmeridionalisChen)头肾的形态和超微结构。南方鲇左右头肾不相连 ,与肾明显分离。头肾组织包括血管系统、淋巴细胞聚集区、粒细胞聚集区、内分泌组织区。血管系统由头肾动脉、头肾静脉、后主静脉及其分枝所组成。淋巴区细胞染色深 ,紧密聚集成网状结构 ,主要包括大、小淋巴细胞等细胞类型。粒细胞区域狭窄 ,染色浅 ,主要为粒细胞聚集。内分泌组织区域细胞大型 ,常规染色极浅 ,包括肾间组织细胞、肾上组织细胞。肾间组织细胞有丰富的线粒体、内质网及分泌颗粒。肾上组织细胞主要分布于后主静脉及其分枝的周围、静脉壁中 ,细胞中有密集的分泌颗粒。肾上组织细胞和肾间组织细胞集中于头肾 ,内分泌功能增强 ,是与其运动能力强、快速捕食相适应的特征。