中华鳖卵黄蛋白原基因克隆与表达及外源E2的影响

为探究中华鳖(Pelodiscus sinensis)卵黄蛋白原Vtg基因的生物学信息与表达及其作为生理与毒理研究标志物的可行性,本实验克隆获得VtgAB1、VtgAB2、VtgAB3(GenBank登录号OK287927、OK287929、OK287928)基因序列,其cDNA长分别为5055、5537、5306 bp,分别编码了1684、1760、1725个氨基酸。三种亚型Vtg蛋白均由脂蛋白N-末端(Vitellogenin_N)、1943DUF、1944DUF、PV、D型血管血友病因子(VWD)5个保守结构域构成,为完整型Vtg。同源性分析发现皆与龟鳖目具有更近的亲缘关系,同时在3种亚型中VtgAB2与VtgAB3更相似。荧光定量PCR显示,3种亚型Vtg只在雌性肝脏中强烈表达。在60日龄、2龄、4龄雌性个体肝脏中,Vtg表达量随年龄呈上升趋势,VtgAB1、VtgAB2为主要表达亚型。原位杂交结果显示,3种亚型Vtg在卵原细胞内未发现杂交信号;在生长期卵母细胞胞质和滤泡细胞中发现杂交信号;成熟期卵母细胞胞质中未发现杂交信号,在滤泡细胞和周围的网状组织中发现杂交信号。信号在初级卵母细胞的细胞质中分布较为均匀且表达最强,随着卵母细胞的发育信号聚集在核周区且信号逐渐减弱。以雄性中华鳖为对象,注射雌激素E2,3种亚型Vtg表达量表现出明显的时间和剂量相关性。研究结果表明,在中华鳖卵黄积累过程中Vtg发挥重要作用,首次证实其Vtg存在内源性合成,并发现其可以作为雌激素暴露的生物标志物。

条纹密鲈卵黄蛋白原基因的克隆与检测

采用RT-PCR方法克隆并分析了条纹密鲈卵黄蛋白原(VTG)和β-肌动蛋白(β-actin)cDNA部分序列。获得的VTG cDNA序列片段长3 464 bp,全部处于编码区,编码1 150个氨基酸;β-actin cDNA序列片段长1 253 bp,编码375个氨基酸。使用活体与离体的实验方法,检测了VTG mRNA转录情况,并以此评价雌二醇(E2)、辛基酚(OP)、镉(Cd2+)和全氟辛烷磺酸类化合物(PFOS)引起的雌激素效应。结果显示,E2和OP在活体和离体实验中均能剂量依赖性地诱导VTG mRNA表达。Cd2+仅在活体实验低剂量组诱导VTG mRNA表达,PFOS在活体和离体实验的各个浓度组均未见显著的VTG mRNA表达。结果表明,所诱导的雌激素效应强弱的排列顺序为E2>OP>Cd2+。Cd2+的雌激素效应活体和离体实验的结果不一致,推测Cd2+引起雌激素效应的机理可能和E2不同。条纹密鲈VTG cDNA对环境激素敏感,适合作为监测环境激素的生物标志物。

96孔板-PCR排除法筛选猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因

为了从猪蛔虫雌虫cDNA文库中筛选出猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因,本研究根据猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因的EST序列为模板设计引物,采用96孔板-PCR排除法对猪蛔虫雌虫cDNA文库进行筛选,并筛选出阳性克隆F993-G10-A10。测序结果表明,该基因序列长621bp,有完整的3'端。经BLAST分析,其推导的氨基酸序列与秀丽隐杆线虫(C.elegans)的卵黄蛋白原基因(Vit1、Vit2、Vit3、Vit4和Vit5)的氨基酸序列的一致性分别为35%、35%、34%、34%和35%,核苷酸序列相似性分别为55%、57%、54%、54%和53%。该阳性克隆的获得为该基因的深入研究奠定了基础。同时也证明了96孔-PCR排除法是一种高效、简便、低成本的筛选文库方法。

大劣按蚊卵黄蛋白原基因cDNA全长序列扩增及功能域蛋白的表达与纯化研究

目的对大劣按蚊卵黄蛋白原(Anopheles dirus vitellogenin, AdVg)基因cDNA的全长序列进行扩增和分析,并对其功能域蛋白进行表达与纯化。方法基于前期克隆的AdVg基因cDNA片段,利用RACE PCR技术,扩增AdVg基因的5′末端及3′末端序列。用Vector NTI软件将测序得到的AdVg cDNA片段、5′末端序列、3′末端序列进行校正,拼接得到完整的AdVg cDNA全长序列。对AdVg全长序列进行功能域预测。利用pet28a(+)构建重组质粒进行AdVg功能域蛋白的表达与纯化。结果成功获得AdVg基因全长cDNA序列,包括117 bp的5′UTR序列、192 bp的3′UTR序列和6 186 bp的ORF序列。AdVg蛋白主要包含Vit N、DUF1943及vWD 3个结构域。通过构建重组质粒,成功表达和纯化了AdVg Vit N功能域蛋白。结论成功克隆了大劣按蚊卵黄蛋白原基因的全长序列,并获得了重组蛋白。

圆唇散白蚁补充生殖蚁发育过程中的卵黄蛋白原基因的表达及卵子发生

【目的】研究圆唇散白蚁Reticulitermes labralis(Hsia)补充生殖蚁分化及发育过程中卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)基因的表达、卵母细胞的发育以及子代品级分化。【方法】通过使用实时定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction)技术测定补充生殖蚁从分化到产卵的过程中Vg基因相对表达量的动态变化;采用组织染色的方法进行卵母细胞发育阶段的观察;对子代的数量及分化进行统计分析。【结果】补充生殖蚁发育过程中,Vg基因表达呈现先升高后降低的动态变化模式。在补充生殖蚁分化后的第10天开始形成具卵黄的卵母细胞,在20 d时具卵黄卵母细胞的数量达到最高值。第1个月至第3个月,补充生殖蚁的产卵数逐渐增加,分别为(2.45±1.43)、(7.68±2.53)和(12.10±7.09)粒。第3个月,巢内开始出现幼蚁,数量为(5.15±2.41)头;第10个月,巢群内有工蚁、前兵蚁和兵蚁的分化,分别为(17.03±2.28)、(1.45±0.31)和(0.79±0.18)头。【结论】在新建巢群中,若蚁的分化在工蚁和兵蚁分化之后。圆唇散白蚁若蚁在巢群需要的时候,可以在很短时间内转化为补充生殖蚁;Vg基因的表达水平与卵母细胞的卵黄形成相关,Vg基因表达量的增加启动了卵母细胞的卵黄摄取过程。虽然单个补充生殖蚁产卵量不如单个原始生殖蚁的多,但是在一个巢内补充生殖蚁总的产卵数目要远远超过原始生殖蚁,因为补充生殖蚁的数量比原始生殖蚁的数量多。因此补充生殖蚁对巢群稳定和发展具有重要作用。

利用食蚊鱼目标基因转录水平评价东莞寒溪河雌/雄激素物质污染现状

应用食蚊鱼(Gambusia affinis)的卵黄蛋白原(VTGα)基因和雌/雄激素受体(ERα/ARα)基因转录水平为指标,评价广东东莞寒溪河受雌/雄激素物质污染的现状。结果显示,与对照点从化流溪河(LX)相比,寒溪河松山湖(SM)、杨屋村(YW)、横沥镇(HL)、樟村污水处理厂上游(ZU)和樟村污水处理厂下游(ZC)各采样点雄性成年食蚊鱼肝脏中的VTGα转录水平都具有显著或极显著水平的升高(P<0.05和P<0.001),分别为7.67、169.43、148.69、152.01和98.12倍;而较之对照点,雄鱼臀鳍的雌激素受体ERα转录水平仅HL位点有显著性升高(P<0.05),其余位点则不明显(P>0.05)。此外,寒溪河SM、YW、HL、ZU和ZC各采样点雌鱼臀鳍雄激素受体ARα转录水平分别是对照点从化流溪河(LX)的1.21、0.82、0.34、0.41和0.89倍,但是只有HL和ZU点有显著性减小(P<0.05),其余各点的变化差异不显著(P>0.05)。研究结果显示,生活在东莞寒溪河中的食蚊鱼受雌/雄激素物质干扰明显,普遍出现显著的雌激素效应,表明寒溪河水体受雌激素物质污染更严重。此外证明,鱼类肝脏VTGα基因相对于臀鳍ERα/ARα基因转录水平更适合作为监测水体环境雌/雄激素物质的生物标志物。

利用食蚊鱼目标基因转录水平评价四会市邓村河雌/雄激素物质污染现状

利用西部食蚊鱼(Gambusia affinis)的雌/雄激素受体(ERα/ARα)基因和卵黄蛋白原(VTGα)基因的转录水平为生物学指标,对广东省四会市邓村河的雌/雄激素物质污染现状进行评价。结果显示,与未受造纸废水污染的对照点REF相比,受造纸废水污染位点A、B、C中雌性食蚊鱼臀鳍中的雄激素受体ARαm RNA转录水平均比对照点显著升高(P<0.05),雄性食蚊鱼臀鳍的雌激素受体ERα转录水平不明显(P>0.05)。造纸废水暴露位点A、B、C中雄性食蚊鱼肝脏中的VTG受体VTGαm RNA转录水平均比对照点显著升高(P<0.05)。结果表明,生活在受造纸废水污染的邓村河中的食蚊鱼受雌/雄激素物质干扰明显,且受雄激素物质污染更严重。鱼类肝脏VTGα基因和臀鳍ARα基因转录水平可适合作为监测水体环境雌/雄激素物质的生物标志物。

红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)Vtg基因实时荧光定量PCR分析的引物设计与评估

为应用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)基因的组织表达谱,利用Primer5.0软件设计了扩增红鳍东方鲀Vtg基因片段的引物并进行了qPCR评估。结果显示:引物对VtgF-VtgR在qPCR扩增时,熔解曲线为单一尖锐峰;标准曲线分析显示:引物的扩增效率为105.32%,R^2值为0.999。上述结果说明该对引物具有良好的扩增特异性和扩增效率,满足了qPCR扩增的要求。

醋酸甲羟孕酮暴露致食蚊鱼的雄激素效应

目的 探讨人工合成孕激素（醋酸甲羟孕酮,MPA）暴露对雌性食蚊鱼（Gambusia affinis）的雄激素效应.方法 将成年雌性食蚊鱼随机分为4组,包括对照组和40 ng/L（低密度组）、200 ng/L（中密度组）和1 000 ng/L（高密度组）等3个MPA实验暴露组,并设置平行组.持续暴露28 d后观察与测定食蚊鱼的体长（BL）、体质量（BW）、身体健康指数（CF）、臀鳍第3鳍条分节数（FJ）、第4、5、6鳍条长度（FL）变化和第14、15、16椎体脉棘的形态变化等5项指标,并在7d、14d、21 d、28 d测定了卵黄蛋白原基因（VTGα）、雄激素受体基因（ARα）和细胞色素P450芳香化酶基因（CYP19α）mRNA表达水平的变化.结果 食蚊鱼经MPA暴露28d后,与对照组相比,200 ng/L和1 000 ng/L实验组食蚊鱼的BL、BW和CF均无明显变化（分别P＞0.05）.臀鳍第3鳍条分节数和第6鳍条长度变化不明显（P＞0.05）,但第4、5鳍条的长度显著增加（P＜0.01）.暴露在200 ng/L和1 000 ng/L MPA中、高浓度组食蚊鱼的第14椎体脉棘的总长（L）、尾部尖端到脊的高度（D）值,第15椎体脉棘的投影长（P）、P∶D值和第16椎体脉棘的P、L∶D、P∶D值分别呈现显著性变化（P＜0.05或P＜0.01）,椎体脉棘伸长,且与脊椎骨接近垂直,显示形态雄性化效应.与对照组相比,低浓度组（40 ng/LMPA） VTGα,CYP19α基因的表达量上升（P＜0.01）,而ARα表达被抑制（P＜0.05）;中浓度组VTGα,CYP19α,ARα基因的表达量都显著上升（P＜0.01）;高浓度组CYP19α,ARα基因的表达量显著上升（P＜0.01）,而VTGα的表达量则被抑制（P＜0.01）.结论 MPA暴露致雌性食蚊鱼骨骼出现形态雄性化,目标基因表达水平的变化结果证明MPA对食蚊鱼具雄激素效应,表明MPA是一种具有雄激素效应的孕激素.

凡纳滨对虾繁殖性状的SNP分子标记筛选的初步研究

对虾繁殖性状的相关分子遗传标记一直是甲壳动物中研究极少的部分,为了筛选与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)繁殖性状(产卵与产卵量)相关的SNP(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)分子标记,为凡纳滨对虾的良种选育提供参考,选择卵黄蛋白原(vitellogenin,VG)基因作为筛选基因。本实验采用PCR产物直接测序法对VG基因进行SNP位点筛查,并与繁殖性状进行关联分析。结果表明:(1)在150个凡纳滨对虾样品中,VG基因的4个结构域一共可以检测到37个SNP位点,8个能引起蛋白质氨基酸的同义突变,3个错义突变,26个无义突变。(2)对37个位点进行分析,发现4个可能的SNP候选位点。(3)多态性分析结果显示,4个候选位点都在中等多态水平,多态信息较为丰富。(4)对4个候选位点与产卵次数、产卵总量、平均产卵量和单位体质量产卵量繁殖性状进行单因素方差分析,结果显示位点3 839与总产卵量和单位体质量产卵量存在显著性差异(P <0. 05),其他位点不存在显著差异(P> 0. 05)。