花鲈肠上皮细胞原代培养及鉴定方法的探讨研究

为探究建立稳定可靠的花鲈肠上皮细胞原代培养方法,通过组织块法和酶消化法培养花鲈肠上皮细胞,确定酶消化法的最佳消化液及消化时间,所得细胞悬液于L-15培养液中进行培养。利用形态学观察、透射电镜观察和碱性磷酸酶染色方法对细胞进行鉴定。结果显示:组织块法细胞迁出情况不稳定,且迁出时间较长;酶消化法的最佳消化液为胶原酶Ⅰ、Ⅳ联合消化液,最佳消化时间为45 min;胶原酶Ⅰ、Ⅳ联合消化法获得的细胞连接紧密、排列整齐、呈上皮细胞典型的“铺路石”状,细胞相对独立、界限清晰。透射电镜观察和碱性磷酸酶染色进一步证实所培养的细胞为肠上皮细胞。总之,经胶原酶Ⅰ、Ⅳ联合消化液消化45 min、培养48 h可得到初始条件一致、生长旺盛的花鲈原代肠上皮细胞。

罗氏沼虾神经细胞的原代培养及其在病毒研究中的应用

细胞平台是研究病原–宿主互作的重要工具,虾类细胞系的缺少严重制约了虾类病毒学研究。传染性早熟病毒(IPV)是近年来发现的能够导致罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)性早熟和生长缓慢的一种新病毒,主要侵染罗氏沼虾神经组织。为建立罗氏沼虾病毒–宿主互作的体外研究平台,本研究采用木瓜蛋白酶消化健康罗氏沼虾的脑、眼柄、胸神经节和腹神经节,获取罗氏沼虾神经细胞,并利用L-15培养基进行离体培养。选择培养效果最佳的脑神经细胞进行IPV体外感染。结果显示,培养的原代细胞在含有谷氨酰胺的L-15培养基中生长良好,其中,从脑组织和眼柄X器官–窦腺复合体中分离出的细胞在体外存活时间可达15d,从胸腹神经节中分离出来的细胞在体外存活时间达9 d。在本研究所采用的感染方式和剂量条件下,脑细胞在感染96 h后检测到高载量的IPV。本研究建立了一种操作简便的罗氏沼虾神经细胞原代培养技术,为罗氏沼虾神经内分泌研究和病毒–宿主互作提供了基础数据和平台。

新生小鼠小脑颗粒神经元的原代培养与鉴定

目的通过改进已报道的新生小鼠小脑颗粒神经元培养方法,以获得纯度更高,杂质更少,状态更佳的颗粒神经元。方法将小鼠小脑组织剪碎,经木瓜蛋白酶消化后得到单细胞悬液,采用Percoll非连续性密度梯度离心法分离出颗粒神经元前体细胞,种植在基质胶包被过的培养皿中并在培养20 h后给予阿糖胞苷(5μmol/L)处理8h。使用激光共聚焦显微镜及神经元特异性标志物微管相关蛋白2(MAP2)对小脑颗粒神经元细胞进行纯度鉴定。结果细胞存活率达98.03%±1.048%;神经元纯度为99.71%±0.2%。结论该方法获取的颗粒神经元存活率和纯度较高,是一种小鼠小脑颗粒神经元体外培养的可靠方法。

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定

分析大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定。方法 选取大鼠进行取脑,并对其开展原代培养,通过形态学观察、CD31免疫荧光染色对培养、鉴定的细胞实施检测,以获取检测结果。结果 在对细胞进行培养后,以脑微血管段为中心,放射性向周围移动,渐渐形成“铺路石”样,CD31免疫荧光染色鉴定结果显示,细胞质呈棕红色荧光,DAPI衬染的细胞核呈蓝色荧光,阳性细胞率较高。结论 该方法能够成功分离及培养大鼠脑微血管内皮细胞,对研究脑微血管内皮细胞的生物学特性以及功能具有重要作用。

巩固递进式动物细胞原代培养实验教学的构建与实践

为解决传统实验教学中学生实验成功率低、能力素质锻炼不足的问题,对面向本科生的动物细胞原代培养实验教学进行改革,构建一种巩固递进式实验教学模式并付诸实践。该实验教学模式对重要且应用广泛的无菌技术、酶消法细胞原代培养技术进行多次巩固练习,并随实验项目的依次开展,逐步引入植块法细胞原代培养、免疫细胞化学鉴定对细胞原代培养实验进行递进深化,还适时安排学生进行先易后难的自主实验方案设计,实验的扩展性、深入性、综合性和设计性等均相应递增。学生的实验结果和教学效果问卷调查结果显示,该巩固递进式实验教学模式提高了学生的实验成功率,强化了学生实践、合作、分析和解决问题的能力,提高了实验教学质量。

新生SD大鼠大脑皮质神经元的原代培养及鉴定

背景:培养神经元的质量是研究中枢神经系统疾病的关键所在,但培养方法一直没有统一的标准。目的:探究取材部位及阿糖胞苷处理对原代培养神经元活性、纯度及成熟度的影响。方法:选取新生24 h内的SD乳鼠,取大脑皮质表面2.0-3.0 mm处细胞,培养后24,48,72 h,用5μmol/L或10μmol/L阿糖胞苷处理48 h;另取全部大脑皮质细胞,培养后48 h用5μmol/L阿糖胞苷处理48 h。培养至第7天,倒置显微镜下观察细胞形态,采用CCK-8法检测阿糖胞苷对神经元活性的影响,免疫荧光和Western blot检测神经元的纯度及成熟度。结果与结论:①倒置显微镜:10μmol/L阿糖胞苷24,48,72 h组神经元密度分别低于同时间下的5μmol/L阿糖胞苷组,该6组神经元突起相互之间均可连接成紧密的网状结构,神经元胞体丰满并充满折光特性;全皮质组细胞密度低于正常对照组,并可明显观察到非神经元;②CCK-8检测:各阿糖胞苷组细胞活性均低于正常对照组(P<0.001),10μmol/L阿糖胞苷24,48,72 h组神经元活性低于同时间下的5μmol/L阿糖胞苷组(P<0.05),5μmol/L阿糖胞苷24 h组神经元活性低于5μmol/L阿糖胞苷48,72 h组(P<0.01);③免疫荧光染色:各阿糖胞苷组神经元纯度大于正常对照组、全部皮质组(P<0.001),各阿糖胞苷组神经元纯度无差异;④Western blot检测神经元特异性烯醇化酶蛋白表达:各阿糖胞苷组神经元成熟度高于正常对照组(P<0.05),其中以5μmol/L阿糖胞苷48 h组成熟度最高;⑤结果表明:取新生24 h内大鼠大脑皮质表面2.0-3.0 mm处皮质,培养后48 h加入5μmol/L阿糖胞苷处理得到的神经元活性、成熟度和纯度较好。

黑斑侧褶蛙脑微血管内皮细胞的原代培养及鉴定

为了建立蛙脑微血管内皮细胞原代培养方法,实验以黑斑侧褶蛙脑组织为实验材料,在无菌条件下分离出大脑灰质,利用0.1%Ⅱ型胶原酶和胶原酶-分散酶进行消化,经过Percoll密度梯度离心后,将获取的脑微血管段接种于鼠尾胶包被的培养瓶中,于28℃、5%CO_(2)条件下原代培养蛙脑微血管内皮细胞,并通过细胞形态学观察和Ⅷ因子相关抗原免疫荧光对细胞进行鉴定,最后用四唑蓝比色法(MTT)测定细胞的生长状态。结果显示,微血管段在体外培养1 d后开始贴壁生长,并逐渐扩大成团簇状,培养至7 d时,细胞呈“铺石路样”镶嵌式排列,表现为区域性单层生长;Ⅷ因子免疫荧光检测发现胞质呈红色,表达为阳性,阳性细胞率达97%以上;MTT实验显示,细胞在第3~5天时生长速率最快。本研究首次建立了蛙脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定方法,为体外研究蛙类神经性疾病的发病机理奠定基础,也为相关药物的研发和筛选提供了细胞模型。

胎鼠神经干细胞原代培养及传代条件优化

目的:探讨胎鼠神经干细胞(NSCs)原代培养方法和活性评价体系,确定NSCs的最佳传代条件。方法:选取孕11~14 d SD大鼠,提取胎鼠原代NSCs,采用巢蛋白免疫荧光染色鉴定NSCs。将NSCs以1.0×10^(4)、2.0×10^(4)、6.0×10^(4)、1.0×10^(5)、1.6×10^(5)和2.0×10^(5) mL^(-1)的细胞密度进行传代培养48 h后观察神经球的形态表现,测定神经球直径。活死细胞染色法检测不同直径神经球中NSCs存活率。结果:NSCs呈巢蛋白阳性,培养的细胞为神经干细胞。NSCs呈聚集生长和牢固细胞间黏附聚集模式,形成神经球,平均直径为(152.72±47.52)μm,球与球之间少有单独的细胞散在。与2.0×10^(4) mL^(-1)传代密度比较,6.0×10^(4) mL^(-1)和1.0×10^(5) mL^(-1)传代密度的神经球直径增大(P<0.05)。1.0×10^(5) mL^(-1)、1.6×10^(5) mL^(-1)和2.0×10^(5) mL^(-1)传代密度的神经球直径比较差异无统计学意义(P>0.05)。与0~40μm、40~60μm、60~80μm和80~100μm直径神经球比较,100~200μm直径神经球中NSCs存活率降低(P<0.05)。结论:以1.0×10^(5) mL^(-1)的密度进行传代时神经球直径为80~100μm,可有效提高NSCs传代培养效率和活性。

4种品系小鼠角质形成细胞原代培养比较研究

目的体外分离、培养并鉴定成年小鼠背部皮肤角质形成细胞(KC);对比4种品系小鼠KC的增殖与分化能力。方法剪取4种品系成年小鼠背部皮肤,剥离皮下脂肪组织,0.25%胰蛋白酶消化获得KC;免疫荧光法鉴定KC;显微镜下观察细胞生长状况;设计不同的种板时间和密度,使用CCK-8法、EdU和高内涵法检测细胞增殖活力;通过Western blot检测4种成年小鼠KC分化情况。结果对4种品系成年小鼠背部相同面积的皮肤组织进行胰蛋白酶消化,昆明(Kunming,KM)小鼠提取的KC数量最低,C57BL/6提取的细胞数量最多;BALB/c、KM、裸小鼠分别以8×10^(3)个/孔的密度铺板增殖效率较高,C57BL/6以1.6×10^(4)个/孔的密度铺板增殖效率较高;4种品系小鼠,BALB/c小鼠原代KC较C57BL/6小鼠原代KC增殖能力弱,分化程度差异无统计学意义。结论采用简便易行的方法成功分离并比较4种成年小鼠背部皮肤原代KC的增殖和分化能力,为皮肤相关疾病模型小鼠的品系选择提供一定实验依据。

阿糖胞苷对原代培养的大鼠海马和大脑皮层神经元生物学特性的影响

目的:探讨阿糖胞苷(Ara-C)不同浓度、不同介入时间以及不同处理时长对原代培养的大鼠海马和大脑皮层神经元纯度及活性的影响。方法:取孕16~18 d的胎鼠海马及皮层组织进行原代神经元培养,培养后48 h分别加入浓度为0、2.5、5、7.5、10μmol/L的Ara-C处理24 h,检测不同浓度的Ara-C对原代神经元生物学特性的影响;培养后24、48、72、96及120 h,加入5μmol/L的Ara-C处理24 h,检测Ara-C不同介入时间对原代神经元生物学特性的影响;培养后48 h,加入5μmol/L的Ara-C处理0、6、12、24、48 h,检测Ara-C不同处理时长对原代神经元生物学特性的影响。培养后第8天倒置显微镜下观察细胞的形态及生长状况,免疫荧光检测微管相关蛋白2(MAP2)、神经纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,并计算MAP2阳性细胞占细胞总数的比例。使用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测神经元细胞活性。结果:与对照组(0μmol/L)相比,Ara-C浓度为5μmol/L组海马神经元纯度达89.8%、细胞活性为48.6%。与对照组相比,种板后48 h加入Ara-C获得的海马神经元纯度为96.2%,细胞活性为44.8%。与对照组(0 h)相比,Ara-C处理12 h组获得的海马神经元的纯度为90.8%,细胞活性为47.5%。在大鼠原代培养的皮层神经元中,与对照组(0μmol/L)相比,给予不同浓度的Ara-C(2.5、5、7.5、10μmol/L)处理,原代皮层神经元纯度的差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,给予不同介入时间(24、48、72、96、120 h)的Ara-C处理,皮层神经元纯度的差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组(0 h)相比,给予不同时长(6、12、24、48h)的Ara-C处理,仅Ara-C处理24 h后皮层神经元纯度稍增高(P<0.05)。结论:在大鼠原代海马神经元的早期培养过程中,种板后48 h加入5μmol/L Ara-C处理12 h得到的海马神经元的纯度与活性最佳,而在大鼠原代皮层神经元培养中无需添加Ara-C即可获得较高纯度和活性的神经元。

夹竹桃天蛾胚胎细胞的原代培养

夹竹桃天蛾是一种世界性害虫。以夹竹桃天蛾虫卵为材料,通过机械破碎的方法对其进行原代培养,确定了Grace’s insect medium为最适合的培养基。对夹竹桃天蛾胚胎细胞进行了长达12月的原代培养,观察到在原代培养物中分化出的多种形态的原代细胞。夹竹桃天蛾胚胎细胞的原代培养初探为进一步建立夹竹桃天蛾细胞系提供了重要的实验依据。

乳兔心脏成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的:探讨并建立乳兔心脏成纤维细胞原代培养方法。方法:选取新出生1 d的新西兰白兔,采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化心脏组织,差速贴壁法分离和纯化心脏成纤维细胞;使用倒置显微镜观察细胞形态及生长情况,绘制细胞生长曲线;采用CCK-8法检测细胞活力;波形蛋白免疫荧光细胞化学染色法鉴定细胞纯度;Western blot法检测异丙肾上腺素刺激心脏成纤维细胞后Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平。结果:差速贴壁90 min后在相差显微镜下可见部分成纤维细胞已贴壁生长;3 d后成纤维细胞数量较前增多,形态多样,多为不规则的多边形及扁平形;5 d时成纤维细胞数量显著增多(P<0.05),细胞形态趋于多样性,细胞间完全融合;细胞生长曲线类似“S”形。波形蛋白阳性率可达95%。CCK-8实验结果显示在4~5 d细胞活力最强(P<0.05);给予第2代心脏成纤维细胞异丙肾上腺素刺激48 h后,Col I及α-SMA水平显著增加(P<0.05)。结论:本研究建立了乳兔心脏成纤维细胞原代培养方法。

体外原代培养人视网膜色素上皮细胞(英文)

目的:探讨建立体外原代培养人类视网膜色素上皮细胞(RPE)技术。为研究溶血磷脂酸(lysophos-phatidic acid, LPA)对培养的人类视网膜色素上皮细胞DNA合成与增殖的作用。方法:取自愿者贡献的意外事故成年眼球,用2.5g/L胰酶消化获取人RPE细胞、150mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养,细胞接近融合状态时进行传代培养。取自愿者贡献的眼球并游离其视网膜色素上皮细胞,用DMEM加100mL/L血清及MEM氨基酸和庆大霉素,进行细胞传代培养。用溶血磷脂酸、转移因子β2(TGF-β2)及LPA+TGF-β2进行视网膜色素上皮细胞增殖试验,用细胞染色法进行细胞计数,提取视网膜色素上皮细胞DNA,用Spectrophotometer进行DNA定量测定。结果:RPE原代细胞镜下为圆形,大小不一,内含较多的色素颗粒,胞核无法辨认。原代细胞培养贴壁后3d增殖速度明显加快,至4～5d即可基本融合,细胞浆内色素颗粒则随传代次数增多而逐渐减少。第3代培养的视网膜色素上皮细胞膜表面可见微绒毛,细胞质内细胞器丰富,线粒体量多,体积较小,内外膜分界清晰,嵴较短。色素颗粒散在分布于胞浆内,多数细胞质内数量较少呈高电子密度包含物。LPA对原代培养的视网膜色素上皮细胞增殖有促进作用。含有和/或缺乏10mL/L小牛血清的两种LPA(10μmol/L雪均明显刺激视网膜色素上皮细胞?

人角膜缘干细胞的体外原代培养和生物学鉴定

目的 建立人角膜缘干细胞体外培养方法,观察其生物学特性。方法 用含20%胎牛血清1640培 养液对人角膜缘干细胞进行体外培养,进行形态学观察和免疫细胞化学鉴定。结果 植块3～4d后细胞开始贴壁 生长,10～15d形成良好的单层,细胞呈圆形、卵圆形,类角膜上皮细胞;免疫细胞化学染色显示,培养第11d,少量 细胞表达AE5,大量细胞表达p63。结论 应用20%胎牛血清1640培养液组织培养的方法获得的原代培养细胞具 有与正常角膜缘干细胞相一致的生物学特性。

人羊膜上皮细胞原代培养及肝细胞特异性蛋白的表达

目的完善人羊膜上皮细胞（AECs）的原代培养技术，检测肝细胞特异性蛋白在AECs中的表达。方法采用胶原酶-胰蛋白酶联合消化法分离获取AECs并进行愿代培养。分别向培养液中添加10、20、40ng／mL表皮生长因子（EGF）和10ng／mL的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），倒置显微镜观察细胞生长和增殖情况，从中选择最适宜AECs原代培养的细胞培养液。以培养液中未添加生长因子的原代培养细胞作为对照。将羊膜组织石蜡切片和AECs细胞爬片进行免疫组化染色，

胎鼠肺细胞的分离纯化及原代培养

目的 建立一套可靠的胎鼠肺细胞分离、纯化和培养技术 ,用于体外研究肺发育和早产儿肺部疾病。方法采用胰酶和胶原酶消化 19d胎鼠肺组织块 ,经差速离心和反复贴壁法 ,分离、纯化胎鼠肺泡Ⅱ型细胞 (AECⅡ )和肺成纤维细胞 (LF) ,并进行原代培养。用细胞角蛋白 (cytokeratin)和波形蛋白 (vimentin)免疫细胞化学染色和透射电镜对所分离的细胞进行鉴定。结果 该方法所得细胞产量大、纯度高。免疫细胞化学鉴定 ,AECⅡ细胞cytokeratin染色阳性 ,vimentin染色阴性 ,LF则相反。透射电镜观察AECⅡ ,可见细胞内板层小体。结论 该方法是一种可靠的胎鼠肺细胞的分离纯化培养技术 。

鸡肠上皮细胞的分离及原代培养方法

取18日龄鸡胚，研究鸡肠上皮细胞（IEC）分离及原代培养的方法。结果表明：较好的分离条件是肠组织经0.1g／L中性蛋白酶和300U／mL胶原酶Ⅺ联合消化；较佳的培养条件是细胞在含2．5％～5％胎牛血清的DMEM培养基中，39℃、5％～7．5％CO2下培养，IEC可在1～2d贴壁，6～7d明显增殖，11～12d汇合成片。

大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定

背景:组织工程需要大量的种子细胞,成骨细胞已成为骨组织工程构建的重要种子细胞之一。但成骨细胞取材困难,获得的成骨细胞的纯度不一。目的:建立大鼠新生乳鼠颅骨来源成骨细胞的分离培养纯化方法,观察颅骨来源成骨细胞生物学特点。方法:采用二次酶消化法对SD大鼠乳鼠成骨细胞进行原代培养,扩增。通过差速贴壁法进行成骨细胞纯化。通过形态学、细胞碱性磷酸酶检测、茜素红染色、钙结节Vonkossa法染色、超微结构以及细胞增殖曲线,确定其增殖与成骨活性。结果与结论:二次酶消化法培养颅骨来源成骨细胞可获得原代细胞增殖,传代扩增细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活性。碱性磷酸酶、茜素红染色、钙结节Vonkossa法染色均呈阳性结果。超微结构显示为高分化功能活跃成骨细胞,细胞增殖曲线显示细胞生长活跃。提示,新生SD大鼠颅骨来源成骨细胞具有良好的增殖与成骨活性,能连续传代增殖,纯度高,细胞生物学特征稳定,适用于做体外实验研究。

新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定

采用倒置相差显微镜、环境扫描电子显微镜对新生24h内SD大鼠大脑皮质原代培养的神经元进行了形态学观察，建立了大脑皮质神经元原代培养方法。应用2．5μg／mL阿糖胞苷（Ara-C）对培养3d的神经元进行24h干预，去除神经胶质细胞、成纤维细胞、神经干细胞等杂质细胞，以提高神经元产率；用Nissl’s染色法进行神经元鉴定；利用微量滴定（MTT）法测定了一个培养周期（约10d）的神经元活性分布。光学显微镜观察结果表明，培养至第4h绝大多数神经元已贴壁生长，胞体上可见1～2个细小突起；培养至第3d、第6d时，Nissl’s染色结果显示，加Aralc能显著提高神经元纯度（≥929／6）；MTT结合形态学观察结果表明，神经元培养至第6d时活性最强，细胞呈卵圆形、蜘蛛状、锥体状等多种形态，细胞胞体饱满，光晕明显，神经网络形成完整。

大鼠睾丸支持细胞的原代培养与鉴定

目的采用改良方法对大鼠睾丸支持细胞进行分离、纯化和原代培养,为得到更高纯度和稳定的支持细胞原代培养体系,并建立一种简单、易行的支持细胞鉴定方法。方法采用酶消化法分离大鼠睾丸支持细胞,用Tris-HCl处理后除去生精细胞,实现进一步纯化。并用Feulgen染色法鉴定支持细胞,对支持细胞进行形态学观察。结果培养的支持细胞纯度达到95%,每个睾丸可获取支持细胞约107个,Feulgen染色后明显可见支持细胞核内的双极小体。结论酶消化法分离和Feulgen染色法鉴定大鼠支持细胞简单易行,且细胞纯度较高。