酒精对人原代培养肝细胞的氧化损伤与CYP 2E1关系的研究

目的 研究急性酒精暴露下对人原代培养肝细胞中CYP 2E1依赖的毒性作用和氧化损伤。方法 分离培养人原代肝细胞 ,以 2 5～ 10 0mmol L乙醇作用于人原代肝细胞 9h及 10 0mmol L乙醇作用于人原代肝细胞 0～ 2 4h后 ,检测人原代肝细胞中CYP 2E1的含量 ,并研究 10 0mmol L乙醇作用于人原代肝细胞 0～ 2 4h后 ,天冬氨酸转胺酶 (aspartatetransaminase ,AST)的释放量及肝细胞中谷胱甘肽 (Glutathione ,GSH)、丙二醛 (Malondialdehyde ,MDA)的含量。结果 急性酒精暴露导致人原代肝细胞中CYP 2E1的释放增加 ,并呈明显的剂量效应和时间效应关系 ;在 10 0mmol L乙醇作用下 ,AST和MDA明显升高 ,在 0～ 2 4h内呈明显的时间效应关系 ,而GSH含量在 6h后明显降低。结论 10 0mmol L乙醇急性暴露可导致人原代培养肝细胞明显的氧化损伤 ,这种损伤与CYP 2E1活性的变化直接相关。

拟炎症高NO大鼠原代培养肝细胞的信号转导途径研究

目的 :通过对信号分子 NO在原代培养大鼠肝细胞所经由的信号转导途径研究 ,探索炎症急性期肝细胞高 NO的生物学意义 ,及药物可能作用的新靶点。方法 :采用 NO供体硝普钠 (SNP)模拟肝脏急性炎症期高 NO环境 ,Griess法测定 NO的特异氧化终产物 NO2 - / NO3- 。测定肝细胞中 c GMP的浓度和肝细胞培养液中 GSNO的浓度 ,由此分别了解在原代培养大鼠肝细胞模型 ,NO经由 c GMP通路信号转导 ,还是经由非 c GMP通路信号转导的途径。结果 :1.5 4 3mmol/ L SNP释放 NO达峰值分别为 ,以 2 5 mmol/ L GSH为 NO释放通路 ,30 min时为 (0 .6 3± 0 .0 6 ) mmol/ L ;以 2 5 mmol/ L L - Cys为活性巯基通路 ,2 5 min时为 (0 .98± 0 .11) mmol/ L。 SNP与原代培养大鼠肝细胞共孵育过程中 ,随着孵育时间的延长及 SNP浓度的增高 ,细胞内 c GMP含量与对照组相比有显著性差异 (P<0 .0 5 ) ;培养液中 GSNO浓度也有增高。与对照组比均有显著差异 (P<0 .0 5 )。结论 :NO供体 SNP在含有巯基(GSH和 Cys)的肝细胞培养液中可持续释放 NO,通过 c GMP依赖性通路和 c GMP非依赖性通路—— GSNO通路进行信号转导 。

TGF-β对原代培养肝细胞及肝癌细胞BEL7401生长作用的影响

目的 研究转化生长因子－β（ＴＧＦ－β）对正常大鼠肝细胞和肝肿瘤细胞的影响。方法 分离和培养原代大鼠肝细胞，培养ＢＥＬ４０１肝癌细胞，通过测定细胞ＤＮＡ合成、细胞活性（ＭＴＴ）及碱性磷酸酶活性，研究ＴＧＦ－β对正常大鼠肝细胞和肝肿瘤细胞的影响方式及可能的作用途径。结果 实验发现，ＴＧＦ－β可以刺激ＢＥＬ７４０１肝癌细胞的增生，促进其ＤＮＡ合成，并增强其活性ＳＴＧＦ－β对原代培养肝细胞ＤＮＡ合成无明显影响，对其活性有明显的抑制作用。实验还发现，ＴＧＦ－β明显刺激ＢＥＬ７４０１肝癌细胞中的碱性磷酸酶增高，同时抑制原代培养肝细胞的碱性磷酸酶活性。结论ＴＧＦ－β对正常细胞和肝癌细胞ＢＥＬ７４０１的生长有不同的影响作用，这种结果可能是通过不同的细胞信号传导途径实现的。

急性乙醇暴露对人原代培养肝细胞的氧化损伤

目的 研究急性乙醇暴露下人原代培养肝细胞的氧化损伤。方法 分离培养人原代肝细胞 ,以 2 5～ 10 0mmol/L乙醇作用于人原代肝细胞 9h及 10 0mmol/L乙醇作用于人原代肝细胞 0～ 2 4h后 ,分别检测人原代肝细胞上清液中天冬氨酸氨基转移酶 (aspartatetransaminase ,AST)、乳酸脱氢酶 (lactatedehydrogenate ,LDH)的释放量及肝细胞中谷胱甘肽(Glutathione ,GSH)、丙二醛 (Malondialdehyde ,MDA)和Fe2 + 的含量。结果 急性乙醇暴露导致人原代肝细胞上清液中AST、LDH的释放增加 ,并呈明显的剂量 效应和时间 效应关系 ;在 10 0mmol/L乙醇作用下 ,人原代肝细胞上清液中Fe2 + 和MDA含量明显升高 ,在 0～ 2 4h内呈明显的时间 效应关系 [Fe2 + 对照组 :( 60 5 0± 4 2 ) μmol/mgprot ,2 4h( 188 81± 9 6)μmol/mgprot;MDA对照组 :( 3 6 3 7± 3 64 )nmol/mgprot ,2 4h( 72 11± 3 2 6)nmol/mgprot] ,而GSH[对照组 :( 7 5 2± 0 2 9) ,2 4h( 0 5 0± 0 5 1)nmol/mgprot]含量在 0～ 1h内先升高 ,随后明显降低 ,差异有非常显著性。结论 10

三种胃肠肽对四氯化碳损伤原代培养肝细胞的保护作用

目的研究表皮生长因子(EGF)、神经降压素(NT)、降钙素基因相关肽(CGRP)对四氯化碳(CCl_4)损伤原代培养肝细胞的保护作用。方法建立大鼠离体培养肝细胞损伤模型,设对照组、损伤组及不同浓度胃肠肽预处理组(胃肠肽提前1h加入),24h后测上清液酶水平、肝细胞SOD活性和MDA(丙二醛)含量,以台盼蓝染色试验计算肝细胞存活率,观察形态学变化。结果 EGF、NT明显降低原代培养肝细胞CCl_4损伤后上清液酶学水平、MDA含量,提高SOD活性和细胞存活率(P<0.01),改善形态学变化。CGRP对上述指标和形态学改变无明显影响。结论 EGF、NT对离体培养肝细胞CCl_4损伤有直接保护作用,而CGRP无此作用。EGF、NT可能是通过稳定生物膜、抗脂质过氧化起作用的。

硝普钠抑制脂多糖诱导的大鼠原代培养肝细胞表面细胞间粘附分子-1的表达

目的 评价模拟肝脏急性炎症期一氧化氮与细胞间粘附分子 1(ICAM 1)表达的关系。方法 用免疫细胞化学技术检测加入不同浓度NO供体硝普钠 (SNP)和 (或 )细菌内毒素 (LPS)后 ,原代培养大鼠肝细胞ICAM 1的表达情况。结果 当培养时间达4h ,各组肝细胞均未见ICAM 1显著表达 ;但当培养至 8,2 4h ,LPS组的肝细胞ICAM 1表达强度明显升高 (P <0 .0 5 ) ,SNP则可呈浓度依赖性地抑制LPS诱导的大鼠肝细胞ICAM 1的表达。结论 SNP可显著抑制LPS诱导的原代培养大鼠肝细胞ICAM 1表达。

实时定量RT-PCR方法检测雌二醇诱导原代培养青鳉鱼肝细胞的基因表达

利用原代培养的雄性青鳉鱼肝细胞进行了相同雌二醇(E2)浓度(100nmol·L-1)下的不同时间(2、4、6、8d)和相同暴露时间(4d)下的不同浓度(1、10、100、1000、10000nmol·L-1)的雌二醇(E2)实验,采用实时定量RT-PCR方法对青鳉鱼VTG-I、VTG-Ⅱ、CHG-H、CHG-L和ERα的基因表达进行了研究.结果表明, VTG-I、VTG-Ⅱ、CHG-H、CHG-L和ERα的基因表达与E2的暴露浓度呈现很好的剂量-效应关系,且1nmo·lL-1E2暴露就能显著诱导肝细胞内VTG-I、VTG-Ⅱ、CHG-H、CHG-L和ERα的基因表达.作为生物监测雌激素活性的in vitro方法,实时定量RT-PCR的灵敏度高于其它已经发表的方法.因此,实时定量RT-PCR方法与原代培养青鳉鱼肝细胞相结合的方法在环境雌激素效应的评价上具有很大地应用潜力.

酮康唑对原代培养大鼠肝细胞的毒性作用及其机制

目的观察酮康唑(ketoconazole,KCZ)对原代培养大鼠肝细胞的毒性效应,探讨其可能的毒性机制。方法采用胶原酶二步灌流法分离制备雄性SD大鼠肝细胞,进行原代培养。量效关系研究中KCZ设56、75、94、113和188μmol/L,染毒时间4 h;时效关系研究中KCZ设188μmol/L,染毒时间分别为0.5、1、2和4 h;同时设溶剂对照。检测染毒后肝细胞活力、胞内LDH泄漏情况以及巯基状态的变化。结果(1)量效关系研究中,随着KCZ剂量的升高,肝细胞活力逐渐下降,培养液中LDH活力逐渐增高,肝细胞内巯基也呈下降趋势,上述指标均有明确的剂量-反应关系(γLDH=0.906,P<0.01);(2)时效关系研究中,KCZ在188μmol/L剂量下染毒后肝细胞活力呈时间依赖性下降;培养液中LDH活力随染毒时间延长逐渐增高;细胞内巯基出现相应性下降。结论KCZ可以导致肝细胞活力下降,胞内LDH泄漏,巯基含量减少,并有明确的量效和时效关系,提示酮康唑对肝细胞的毒作用可能与细胞内巯基状态改变有关。

普鲁泊福对原代培养人肝细胞CYP3A4同工酶的影响

目的 :观察不同浓度普鲁泊福对原代培养肝细胞中 CYP3A4同工酶活性及蛋白表达的影响 ,并进一步探讨其临床药理学意义。 方法 :取肝血管瘤患者的瘤旁正常肝组织标本 ,胶原酶消化制备原代培养肝细胞 ,不同浓度普鲁泊福孵育 2 4 h后 ,Nash法测定 CYP3A4同工酶比活性 ,Western印迹法测定 CYP3A 4蛋白表达。结果 :临床剂量 (0 .0 1mmol/ L )的普鲁泊福即可抑制 CYP3A 4同工酶的活性 ,且酶的活性与普鲁泊福的浓度呈负相关。临床剂量的普鲁泊福对该同工酶蛋白的表达并无显著影响 ,直至浓度为 0 .5 m mol/ L时才轻度抑制 CYP3A4蛋白表达。结论 :麻醉药普鲁泊福对 CYP3A4产生明显的抑制作用 ,可能是一种潜在的 P4 5 0抑制剂 ,会导致 CYP3A 4底物的生物转化速率的下降 ,其作用主要在表达后水平。

铁水平和孵育时间对原代培养肉鸡鸡胚肝细胞中铁含量及含铁酶活性、基因表达和蛋白表达的影响

本试验旨在研究铁水平和孵育时间对原代培养肉鸡鸡胚肝细胞中铁含量及含铁酶活性、基因表达和蛋白表达的影响。采用5×3两因子完全随机设计,铁水平分别为0、0.25、0.50、0.75、1.00 mmol/L,孵育时间分别为24、48和72 h,共形成15个组,每组6个重复。结果表明:1)铁水平、孵育时间及两者的互作对肝细胞铁含量有显著影响(P<0.05)。24、48和72 h时,0.25、0.50、0.75、1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中铁含量均显著高于0 mmol/L铁水平组(P<0.05)。2)铁水平和孵育时间对肝细胞中胞琥珀酸脱氢酶(SDH)和细胞色素c氧化酶(COX)活性有显著影响(P<0.05)。与0 mmol/L铁水平组相比,0.25、0.50、0.75和1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中SDH活性显著降低(P<0.05);24 h肝细胞中SDH活性显著高于48 h(P<0.05),而72 h又显著高于24和48 h(P<0.05)。与0 mmol/L铁水平组相比,0.75和1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中COX活性显著提高(P<0.05);24和48 h肝细胞中COX活性显著高于72 h(P<0.05)。3)铁水平、孵育时间及两者的互作对肝细胞中SDH、过氧化氢酶(CAT)、COX7A2L和铁蛋白重链1(FTH1)的mRNA表达水平有显著影响(P<0.05),铁水平及铁水平与孵育时间的互作对肝细胞中COX1的mRNA表达水平有显著影响(P<0.05)。4)铁水平和孵育时间对肝细胞中COX1的蛋白表达水平有显著影响(P<0.05),铁水平及铁水平与孵育时间的互作对肝细胞中FTH1的蛋白表达水平表达有显著影响(P<0.05)。24和72 h肝细胞中COX1的蛋白表达水平显著高于48 h(P<0.05),1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中COX1的蛋白表达水平显著高于其他铁水平组(P<0.05)。由此可见,铁水平和孵育时间可影响原代培养肉鸡鸡胚肝细胞中铁含量,SDH、CAT和COX的活性、基因表达,以及FTH1的基因表达。综合考虑以上指标,适宜铁的水平应为0.50 mmol/L,孵育时间为24 h。

小檗碱、巴马汀和药根碱在“三明治”培养大鼠原代肝细胞中的胆汁外排特征

目的研究小檗碱、巴马汀和药根碱在大鼠原代细胞的胆汁外排特征。方法建立"三明治"培养大鼠原代肝细胞(sandwich cultured rat hepatocytes,SCRH)模型,分别加入小檗碱、巴马汀、药根碱,在含Ca^(2+)和无Ca^(2+)缓冲液中孵育,采用UPLC-MS/MS分别测定3种生物碱的细胞蓄积量,计算胆汁排泄指数和胆汁清除率,评价小檗碱、巴马汀、药根碱在大鼠原代细胞的胆汁外排特征;并考察P-gp、Mrp2抑制剂对3种活性成分在SCRH细胞模型中的外排转运影响。结果随着孵育时间的延长,3种生物碱的细胞蓄积量增加,且含Ca^(2+)条件下的细胞蓄积量与无Ca^(2+)条件下相比具有明显差异;P-gp抑制剂环孢素A、维拉帕米均能减少小檗碱、巴马汀、药根碱的胆汁排泄,且呈浓度依赖性,Mrp2抑制剂MK571、丙磺舒对3种生物碱的胆汁排泄无明显影响。结论小檗碱、巴马汀、药根碱均经过胆汁外排,P-gp介导了3种生物碱的胆汁外排,Mrp2未参与其胆汁排泄。

原代肝细胞培养技术研究现状及其新药研发中的应用

通过查阅近期有关文献,综述了国内外原代肝细胞分离、培养技术研究情况及其药代动力学与毒理学方面的应用。

牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞的促凋亡作用研究

目的探索分离培养原代正常大鼠肝细胞的条件和方法,研究牛磺酸对原代培养的正常大鼠肝细胞的促凋亡作用。方法使用经典的两步灌注法分离原代肝实质细胞后贴壁培养,记录细胞生长状况,台盼蓝拒染法测定细胞活率、绘制生长曲线。经用不同浓度的牛磺酸培养24 h后,用TUNEL法测定牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞致凋亡作用,测定细胞凋亡率(AI)。结果两步灌注分离取得的肝细胞活率>70%,贴壁生长良好,从生长曲线可看出培养第3天进入对数生长期;TUNEL实验3个给药组AI分别为:3.71%,29.72%,42.56%。结论两步灌注法是一种细胞产量高,损伤小,纯度高的分离原代正常大鼠肝细胞的方法;高浓度的牛磺酸对体外培养肝细胞有一定致凋亡作用。

原代小鼠肝细胞培养方法的比较

目的:比较3种不同培养条件下原代小鼠肝细胞的形态以及肝细胞功能,寻找适合于原代小鼠肝细胞体外培养的培养基配方。方法:采用改良Seglen两步胶原酶灌注法分离原代小鼠肝细胞,糖原染色观察细胞纯度,在贴壁4 h后用基础培养基、基础培养基加DMSO(DMSO组)、基础培养基加DMSO和EGF(DMSO+EGF组)等3种不同的条件培养肝细胞。镜下观察肝细胞形态,用MTT法检测细胞活力,生化分析仪检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)水平以及用ELISA法检测细胞培养上清液中白蛋白水平。结果:成功分离小鼠原代肝细胞,肝细胞纯度达95%以上;原代肝细胞培养至96 h时,DMSO组仍能较好地维持细胞形态,基础培养基组的细胞活力比DMSO组和DMSO+EGF组分别降低了66.87%和67.16%(P<0.05),且基础培养基组的LDH水平均高于DMSO组和DMSO+EGF组(P<0.05)。此外DMSO组在96 h时仍能维持较高水平的白蛋白分泌,比基础培养基组和DMSO+EGF组分别增加了185%和24.2%(P<0.05)。结论:小鼠原代肝细胞培养基中加入DMSO对于维持肝细胞的形态和功能有促进作用,本研究为体外原代肝细胞培养模型的建立和优化提供了实用的方法。

在“三明治”培养大鼠原代肝细胞中研究利福平及联用丹参酮ⅡA对普伐他汀经BSEP转运的影响

目的 以普伐他汀为BSEP底物,在“三明治”培养大鼠原代肝细胞模型上(sandwich-cultured rat hepatocytes, SCRH),研究利福平及联用丹参酮ⅡA对BSEP转运能力的影响。方法构建SCRH模型,利用MTT筛选给药剂量;建立普伐他汀的HPLC-MS/MS检测方法并进行方法学验证;考察利福平及联用丹参酮ⅡA对胆管内普伐他汀浓度的影响,并计算胆管外排指数(biliary excretion index, BEI)。结果成功构建了SCRH模型,并确定了利福平、丹参酮ⅡA、格列本脲及普伐他汀的合适给药剂量;建立了稳定可靠的普伐他汀HPLC-MS/MS检测方法;与空白组相比,利福平能够降低胆管内普伐他汀的浓度和普伐他汀的BEI,高浓度利福平的降低效果最明显( P <0.01);与利福平高浓度组相比,联用丹参酮ⅡA后,胆管中普伐他汀的浓度以及普伐他汀的BEI增大,高浓度丹参酮ⅡA的增加效果最明显( P <0.01)。结论在SCRH中,利福平能够抑制BSEP的转运能力,丹参酮ⅡA可以逆转利福平对BSEP转运能力的抑制作用。

d-Penicillamine2,5-enkephalin作为底物考察三明治大鼠原代肝细胞的转运体功能研究

目的:通过液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)法测定d-Penicillamine2,5-enkephalin(DP-DPE)在肝细胞和Hank's缓冲液中的浓度,研究DPDPE作为底物用于"三明治"培养大鼠原代肝细胞(SCRH)的转运体功能。方法:将SCRH与溶于Hank's缓冲液的DPDPE共温孵,采用LC/MS/MS法测定细胞内蓄积的和外排到缓冲液中的DPDPE浓度,用于评价模型药物α-萘异硫氰酸酯(ANIT)对参与DPDPE摄取的Oatp和负责DPDPE外排的Mrp2的转运功能的影响。结果:建立的样品处理和测定方法能够满足体外转运实验需要的灵敏度和线性范围,在Hank's缓冲液中线性范围为0.5～50ng/mL(r2=0.9995),在细胞基质中线性范围为0.1～5ng/well(r2=0.9997),样品处理操作简便。日内日间精密度(RSD)均小于15%;提取回收率大于65%。ANIT可抑制DPDPE在SCRH胆管侧的外排及基底侧的摄取,对基底侧外排无显著影响。结论:该分析方法选择性好,灵敏度高,操作简便,并成功地用于将DPDPE作为探针底物研究SCRH模型上转运体的功能。

SV40LT抗原介导的人源性肝细胞系的构建

目的 :建立人源性永生化肝细胞系 ,为生物人工肝和肝细胞移植等提供合适的细胞源。方法 :利用 SV4 0 L Tag基因和真核表达载体 pc DNA3.1(- )经脂质体转染至来源于 2 5岁男性脑死亡者供肝的原代培养细胞 ,使其永生化 ,进一步鉴定其形态学特征和生物学功能。结果 :经 G4 1870 0～ 30 0μg/ ml筛选 ,4 2天后获一抗 G4 18永生化肝细胞系。该细胞系呈单层贴壁、上皮细胞样形态生长 ,体外培养可无限传代 ,具有分泌 AL B、ALT、AST及 LDH的功能 ,超微结构观察发现 ,转染肝细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征 ,如较大的细胞核、胞浆内含有丰富的糖原颗粒、大量的线粒体和粗面内质网等。经 RT- PCR和 Western blot检测 ,转染肝细胞的 ALB m RNA阳性和细胞色素 P4 5 0 2 E1阳性。结论 :新建人源性肝细胞系与原代培养肝细胞具有类似的形态学特征和生物学功能。