荧光原位杂交法检测环境硝化细菌实验条件优化及应用

通过正交试验筛检荧光原位杂交 (FISH)技术在检测环境中硝化细菌时的最佳及适合的实验条件.结果显示,样品预处理较优的条件为:热固定 2h,乙醇脱水 3min;FISH技术检测环境样本中亚硝化细菌的最佳实验条件为:杂交温度 46℃,杂交时间 3h,洗脱液中NaCl浓度 20mmol/L;检测硝酸菌最佳实验条件为:杂交温度 46℃,杂交时间 5h,洗脱液中NaCl浓度 60mmol/L.应用该方案对太湖、玄武湖、南京锁金村污水处理厂活性污泥中硝化细菌分布进行分析,结果显示,环境样本中亚硝化细菌和硝酸菌含量分别是:太湖 1.68×103, 0.54×103cells/mL;玄武湖 1.34×103, 0.38×103cells/mL;锁金村污水处理厂活性污泥 8.30×106, 0.52×106cells/g.FISH技术检测环境样品中硝化细菌与传统检测方法相比具有快速、简便、准确的优点,在研究环境微生物方面有较好的应用前景.

用原位杂交法研究猪下丘脑内瘦素长形受体mRNA的分布定位

用体外转录方法合成了瘦素 (leptin)长形受体 (Ob Rb)反义和正义RNA探针 ,用原位杂交法研究了 5头 2～ 3月龄母猪下丘脑内瘦素长形受体mRNA的分布定位。结果表明 ,猪瘦素长形受体mRNA分布于下丘脑的弓状核、腹内侧核、背内侧核、室旁核。

RNA原位杂交法检测组织内弓形虫的实验研究

目的 探讨RNA原位杂交法在弓形虫病理检测中的应用。方法 设计并合成弓形虫SAG2基因来源的寡核苷酸探针。弓形虫RH株感染昆明株小鼠 ,分别于感染后第 2、3、4、5、6、7天处死 ,取肝组织制备石蜡标本进行RNA原位杂交 ,结果同HE染色及免疫组化相比较。结果 RNA原位杂交法于感染后第 2天检到阳性结果 ,组织内弓形虫的检出率 (2 8/ 2 8)高于免疫组化 (2 1/ 2 8)及HE染色法 (16 / 2 8)。结论 RNA原位杂交法是一种简便准确的弓形虫病理检测方法。

荧光原位杂交法在活性污泥硝化细菌检测中的应用

采用荧光原位杂交(FISH)法对活性污泥样品中的硝化细菌进行了检测研究。与传统方法相比,FISH法具有快速便捷的特点,可原位检测出活性污泥菌胶团上的硝化细菌的分布情况,结合稀释的方法,可对环境样品中的硝化细菌进行定量分析。此法既可定性,又可对环境中的硝化细菌进行直接计数,为研究硝化细菌类群的空间和数量分布提供有效的检测工具。

菌落原位杂交法检测革兰阴性菌Ⅰ类整合子的研究

目的用菌落原位杂交法检测革兰阴性菌中Ⅰ类整合子。方法制备Ⅰ型整合酶基因的特异性探针,采用菌落原位杂交法检测革兰阴性菌中的Ⅰ型整合酶基因,并与PCR的检测结果比较。结果40株多重耐药的革兰阴性菌中,经菌落原位杂交法检测出有18株含Ⅰ类整合子,另外22株杂交结果阴性,与PCR法检测结果一致。结论菌落原位杂交法可替代PCR法检测革兰阴性菌Ⅰ型整合酶基因。

荧光原位杂交法对胃癌组织HER-2基因状态的检测

目的:比较荧光原位杂交(FISH)法与免疫组织化学(IHC)染色法检测胃癌组织HER-2基因状态的一致性.方法:选择本课题组前期IHC染色法检测775例胃腺癌标本中HER-2蛋白表达为(2+)及(3+)的病例,应用FISH法对HER-2基因扩增情况进行验证.结果:FISH结果显示,86例HER(3+)标本中,60例存在HER-2基因扩增,符合率69.77%;26例阴性病例中10例为多倍体,占38.46%.43例HER-2(2+)的病例中,6例(13.95%)存在H E R-2基因扩增;37例阴性病例中20例为多倍体,占54.05%.全组扩增效果不满意率1.97%(3/152).结论:IHC可作为HER-2状态的初步筛查方法,对于IHC检测HER-2(3+)及HER-2(2+)拟行靶向治疗的病例仍有必要进一步行FISH检测,以确定HER-2基因状态,同时在评价HER-2基因状态时,要考虑17号染色体多体的影响因素.

双探针原位杂交法检测慢性肝病和肝细胞癌患者肝组织TTV DNA的感染状况

目的 探讨慢性肝病和肝细胞癌患者肝组织TTVDNA的感染状况。方法 采用PCR扩增法分别合成G1a、G2b两种亚型的双链TTVDNA探针。应用两型探针对 45例肝组织标本进行TTVDNA原位杂交检测 ,巢氏PCR法检测血清TTVDNA。结果 3 1例血清TTVDNA阳性患者的肝组织TTVDNA均为阳性 ( 10 0 % )。 14例血清TTVDNA阴性的患者肝组织中TTVDNA阳性者 7例 ( 5 0 % )。慢性肝病患者的肝组织中TTVDNA散在分布在汇管区周围的肝细胞核内 ,肝癌患者TTVDNA则集中分布在肝癌细胞核内及癌组织周围的肝细胞核内。结论 慢性肝病与肝癌患者肝组织中TTVDNA的感染状态存在一定差异。

应用原位杂交法对比研究慢型克山病、扩张型心肌病与肠道病毒的关系

本文用生物素标记的柯萨奇B_3病毒(CVB_3)的cDNA探针,通过原位杂交技术检测50例组织学诊断为慢型克山病、14例扩张型心肌病的心肌石蜡包埋切片,并以15例正常心肌标本作阴性对照。结果50例慢型克山病有34例出现阳性结果。14例扩张型心肌病有7例出现阳性结果。15例正常对照心肌标本杂交均为阴性,从而确定慢型克山病的心肌组织中、扩张型心肌病的心肌组织中有肠道病毒核酸存在,表明肠道病毒感染与慢型克山病、扩张型心肌病的发病高度相关。经统计学处理二者之间无明显差异。

原位杂交法检测MDR1基因在食管癌中的表达及与p53的关系

目的:了解食管癌组织MDR1基因表达的临床意义及其与p53的关系。方法:用原位杂交法检测了57例食管癌组织标本中MDR1基因的表达,免疫组化法检测了其中44例p53蛋白的表达并进行临床病理分析及相关性分析。结果:57例食管癌组织中MDR1mRNA阳性表达率为35%(20/57),其中食管癌无淋巴结转移的患者阳性表达为29%(8/29),有淋巴结转移患者阳性表达分别为41%(12/28),高于无淋巴结转移患者的表达。临床Ⅱ期食管癌患者阳性表达分别为27%(8/30),临床Ⅲ-Ⅳ期阳性表达为44%(12/27),高于临床Ⅱ期患者的表达。食管癌患者MDR1mRNA表达与肿瘤大小、部位、分化程度、肿瘤浸润的程度无明显相关。44例食管癌组织中p53蛋白阳性表达率为73%(32/44),其中食管癌浸润至肌层,p53表达率为45%(5/11),肿瘤浸润至外膜,p53表达率为82%(27/33),差异有显著性,P<0.01。食管癌患者p53表达与肿瘤大小、部位、分化程度、有无淋巴结转移、临床分期无明显相关。32例p53蛋白表达阳性的组织中有10例MDR1mRNA表达阳性,它们之间的表达在统计学上无明显相关。结论:MDR1基因及突变型p53在食管癌组织中均有过表示,其表达可能与食管癌进展相关。在食管癌组织中MDR1基因表达可能并非受p53的调控。

荧光原位杂交法与免疫组织化学法检测乳腺癌HER-2基因扩增及蛋白表达的对比研究

目的比较桂林市荧光原位杂交法(FISH)和免疫组织化学法(IHC)检测乳腺癌组织中人表皮生长因子受体(HER-2)基因扩增及其蛋白表达情况的一致性,探讨FISH与IHC检测乳腺癌HER-2基因状态的临床意义。方法应用IHC和FISH对50例乳腺癌患者HER-2蛋白表达、基因扩增情况及17号染色体倍体性进行检测,分析IHC与FISH检测HER-2基因状态的差异以及HER-2蛋白状态与17号染色体倍体性的相关性。结果FISH与IHC结果总的符合率为82.0%,两者之间存在较好的一致性(kappa=0.640),FISH检测IHC结果为3+、2+和0/1+者的符合率分别为92.9%、70.0%和80.8%;IHC3+及2+者出现17号染色体多体性的几率比IHC0/1+者高(P<0.05)。结论FISH可以准确和稳定地检测乳腺癌组织中HER-2的基因状态及17号染色体倍体性;FISH检测IHC3+者符合率较高,FISH与IHC的差异主要在于IHC2+和IHC0/+组,IHC仅作为检测HER-2基因状态的初筛方法,而IHC结果为2+或0/1+者的HER-2基因状态必须应用FISH进一步确定。

仔猪前脑基底部内生长抑素mRNA的分布定位──原位杂交法研究

用原位杂交法研究了５只仔猪前脑基底部一些结构内生长抑素ｍＲＮＡ的分布。结果表明，生长抑素ｍＲＮＡ分布于尾状核、伏隔核、壳核、屏状核、隔核、杏仁核、嗅结节和梨状叶。含生长抑素ｍＲＮＡ的神经元胞体多呈卵圆形或梭形。尾状核和伏隔核内的标记细胞分布较均匀（尾状核前部未观察）。壳核、屏状核、梨状叶和嗅结节内的多位于深层。隔核和杏仁核内出现的标记细胞较少，隔核内的分布于隔外侧核。在猪体上的实验结果与用免疫组织化学法在绵羊和马体上获得的结果有一些差异。

荧光原位杂交法检测尿液膀胱癌细胞标本制片体会

据报道,全世界每年约有26万膀胱癌新发病例,其中90%以上为尿路上皮（移行细胞）癌。膀胱癌筛查和复发监控的常用方法为尿液细胞学检查,但其敏感度不够高。

利用流式荧光原位杂交法测定细胞端粒长度

目的建立利用流式荧光原位杂交法检测细胞端粒长度的技术方法。方法以端粒酶敲除的G3小鼠和同龄野生型小鼠为检测对象,分离其外周血中的单个核细胞后与肽核酸荧光探针杂交,用流式细胞仪采集和分析其端粒长度,分别用荧光原位杂交方法和SYBR Green荧光定量PCR方法验证其准确性。结果流式荧光原位杂交法测定G3小鼠细胞端粒相对长度与C57BJ/6野生型小鼠相比为0.5345,荧光定量PCR测定端粒相对长度为0.5717,结果基本一致。结论流式细胞术与原位杂交方法结合起来检测细胞端粒的平均长度可靠易行,对单个核细胞端粒平均长度的检测有较高的实用性。

原位杂交法检测BP1基因在乳腺癌组织中表达

目的探讨BP1同源盒基因在乳腺癌中的表达及其与临床病理指标的关系。方法收集165例乳腺癌临床和病理资料,采用原位杂交法检测BP1的表达,同时用二步法进行ER、p53、PCNA、bcl2、cerbB2免疫组化染色。结果BP1基因表达率为67.88%,免疫组化:ER70.30%、p5349.09%、PCNA74.55%、bcl253.33%、cerbB275.52%。BP1与bcl2具有相关性(P<0.01),且均与ER相关(P<0.05),与p53呈负相关(P<0.05)。BP1与PCNA、cerbB2、患者年龄、组织学类型、淋巴结转移等无相关性。结论BP1可能通过某种非依赖p53基因调控机制,与bcl2、ER协同抑制肿瘤细胞的凋亡而参与乳腺癌的发生。

实验动物泰泽病原位杂交法的建立

目的 建立实验动物泰泽病原位杂交检测方法。方法 用已感染Tyzzer菌小鼠的 3T3细胞 (MT -3T3细胞 )感染 4周龄的ICR小鼠 ,以 4 .0× 10 5细胞量感染动物 ,动物于感染后 4～ 7d发病。根据Tyzzer菌 16srDNA序列设计出两对特异引物 ,以MT - 3T3细胞的DNA提取物为模板 ,进行套式PCR。扩增出Tyzzer菌特有的 196bp条带。以此产物为探针 ,用地高辛PCR一步法进行探针标记。选择感染动物的肝脏 ,采用不同探针浓度进行原位杂交。结果 当探针的最小浓度为 4 0ng μl时 ,在肝细胞的胞质中有阳性结果。 结论 原位杂交方法能直接定位Tyzzer菌的感染位置 ,本研究建立的方法简单 ,易于操作 ,便于普及。

心脏VPm RNA阳性神经细胞的研究——原位杂交法

以原位杂交方法研究中华蟾蜍心内神经细胞递质的性质 ,在四只实验动物发现血管加压素 m RNA阳性神经细胞1 2 8个 ,散在分布于心内神经节。细胞呈椭园或园形 ,以小型及中型为主 ,本文在基因水平上证实部分心内神经节细胞能合成血管加压素。并对其存在的意义进行了讨论。

16SrRNA寡核苷酸探针原位杂交法在粪便微生物研究中的应用

16SrRNA寡核苷酸探针(以下简称16SrRNA探针)原位杂交法,可简单、快速和准确地对粪便微生物进行定性和定量测定,本文对该方法及其应用作一综述。

荧光原位杂交法对血培养常见菌的快速鉴定

目的 建立快速鉴定阳性血培养的荧光原位杂交法。方法 针对血培养中的常见病原菌 ,以细菌 16SrRNA和真菌 18SrRNA为靶序列 ,设计种属特异性的寡核苷酸探针。BacT/ALERT仪器报警后 ,取阳性血培养液 15 μl于玻片上 ,5 0℃杂交 1h ,然后 5 0℃下洗涤缓冲液洗涤 10min ,荧光显微镜下检测鉴定结果。同时对临床标本进行常规培养鉴定。结果 118份阳性血培养标本中 ,116份标本杂交法检测为阳性 ,敏感率为 98.3%。除少数阴性杆菌 ,阳性杆菌不能鉴定至种属的水平外 ,92 .5 %的病原体可于 2h内鉴定至种或属的水平。结论 荧光原位杂交法可快速鉴定血培养中的常见菌 。

荧光原位杂交法快速鉴定血培养中白念珠菌的方法学评价

目的 :评价荧光原位杂交法 (FISH)快速鉴定血培养中阳性的白念珠菌的应用价值。方法 :当BacT/ALERT报警后 ,涂片革兰染色 ,若发现念珠菌 ,与针对白念珠菌的特异性探针杂交 ,同时将分离菌转种沙保罗培养基 ,比较 2种方法的鉴定结果。结果 :探针的特异性经 15株标准菌株证实 ,分离到的 36株念珠菌中 ,杂交法在 3h内可全部得到鉴定结果 ,与培养法比较 ,杂交法的特异性和敏感性均为 10 0 % .结论 :使用FISH可直接快速鉴定报警阳性血培养中的白念珠菌 ,结果可靠。