通俗环毛蚓、参环毛蚓、赤子爱胜蚓的分子鉴定及纤溶、抗凝活性对比

目的 鉴定参环毛蚓、通俗环毛蚓以及药典外研究较多的赤子爱胜蚓,再比较3种鲜体蚯蚓在两种不同提取方法下的纤溶和抗凝活性,并检测乙醇沉淀物的分子量。方法 采用DNA分子鉴定法鉴别3种蚯蚓。采用水提法提取鲜体蚯蚓蛋白,进一步采用乙醇沉淀法对水提物中的蛋白进行富集,利用纤维蛋白平板法和纤维蛋白原-凝血酶时间法(Fibg-TT法)测定纤溶活性和抗凝活性,利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测3种蚯蚓乙醇沉淀物的分子量。结果 以线粒体细胞色素c氧化酶亚基I(COI)基因片段为识别片段准确鉴定出了3种蚯蚓。比较3种蚯蚓水提液的抗血栓活性:参环毛蚓水提液的抗凝活性和纤溶活性最强,而赤子爱胜蚓水提液活性最弱;比较3种蚯蚓乙醇沉淀物的抗血栓活性:参环毛蚓乙醇沉淀物的纤溶活性最强,而通俗环毛蚓乙醇沉淀物的抗凝活性最强;赤子爱胜蚓的乙醇沉淀物纤溶和抗凝活性均最弱。参环毛蚓和通俗环毛蚓乙醇沉淀物的蛋白分子量主要分布在25~70 kDa,赤子爱胜蚓乙醇沉淀物的蛋白分子量主要分布在25~40 kDa。结论 药典地龙品种通俗环毛蚓和参环毛蚓的纤溶、抗凝活性远大于药典外的常用品种赤子爱胜蚓,3种蚯蚓中抗血栓活性蛋白有明显差异;乙醇沉淀法可有效富集抗血栓蛋白。

参环毛蚓脂类挥发性成分分析

为了分析参环毛蚓(Pheretimaaspergillum)的脂类成分,我们采用不同溶剂索氏提取法、从该药材得到三种组分,用GC-MS法进行测定,确定了36种化合物的结构。在这三种组分中,乙醚组分中的11种成分均为脂类,不饱和脂肪酸的含量最高,占27.70%,如油酸、亚油酸、花生四烯酸和花生三烯酸。丙酮组分的脂类成分8种,占35.75%,不饱和脂肪酸只有亚油酸一种;乙醇组分的脂类成分13种,占72.09%,没有发现不饱和脂肪酸。本研究确定了参环毛蚓脂肪酸,尤其是不饱和脂肪酸的化学组成,为该中药化学物质基础的研究与药物的开发利用提供了依据。

重金属镉对参环毛蚓胃肠道上皮细胞超微结构损伤的研究

目的:研究不同浓度重金属镉离子胁迫下对参环毛蚓胃肠道结构的影响。方法:采用不同浓度镉离子胁迫参环毛蚓染毒、HE组织切片染色、光学显微镜及透射电镜下观察参环毛蚓胃肠道超微结构损伤的变化。结果:随着镉离子浓度的增加,参环毛蚓的肠道粘膜上皮细胞有大量溶酶体增生,高尔基复合体增生、扩张呈大泡状,微绒毛、纤毛排列不整齐、紊乱,当镉离子浓度达到30mg/kg时,参环毛蚓肠粘膜上皮细胞微绒毛出现萎缩,纤毛细胞出现溃疡坏死病灶,核膜解体、核质外溢,最后导致坏死。结论:参环毛蚓胃肠道粘膜上皮细胞超微结构的受损程度,是随土壤重金属的污染量而定。在较低重金属浓度条件下,参环毛蚓肠上皮细胞是以溶酶体增生、存积一定量的重金属元素的方式来应对其毒害作用,也可视为肠上皮细胞对有毒异物的一种应答反应,为可逆性损伤;而在较高重金属浓度条件下,肠上皮细胞是以微绒毛和线粒体损伤为主,核膜解体、核质外溢,最后导致坏死,为不可逆性损伤。由此推断,参环毛蚓对重金属的高耐受性或富集作用是通过其肠上皮细胞的这种特性来实现的。

参环毛蚓肠道内源性纤维素酶的分离纯化及酶学性质分析

通过对参环毛蚓肠道组织提取液进行DEAE阴离子交换及凝胶过滤层析，获得参环毛蚓单一的内源纤维素酶的活性组分．根据AlpHaEaseFC^TM软件计算出该组分分子质量约为45ku，命名为Cxl．羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethylcellulose，CMC）法对Cxl进行酶学性质分析．分析结果显示：对于底物羧甲基纤维素钠，Cxl的米氏常数（Km）为0．289mg/mL，Vmax为0．446U·mL^-1·min^-1，反应最适温度为55℃，最适pH为6．0，在40～60℃、pH5．0～8．0具有较好的热稳定性和pH稳定性，其相对酶活力都能保持在55％以上．Ag^＋和Ba^2＋对Cxl起显著激活作用，K^＋、Zn^2＋、Mg^2＋、Ca^2＋、NH^4＋、Ni^2＋、Na^＋、Pb^2＋部分抑制酶活性，Cu^2＋离子对Cxl有完全抑制作用，而Fe^2＋对酶活力无明显影响．

十三种神经递质和神经肽在参环毛蚓神经系统的分布:免疫细胞化学研究

选择生活在我国的环节动物门典型代表参环毛蚓 (Pheretimaaspergillum)为研究对象 ,使用 13种抗体 ,运用免疫细胞化学染色技术 ,在光学显微镜下观察神经递质和神经肽阳性细胞的形态与分布。研究发现在参环毛蚓脑 ,ACTH阳性神经细胞、AVP阳性神经细胞、calcitonin阳性神经细胞、CCK阳性神经细胞、glutamate阳性神经细胞和NPY阳性神经细胞染色浓重 ,分布密集 ,位于脑的后侧半 ,尤其特别的是在calcitonin阳性大神经细胞内含有粗大密集的分泌颗粒。β EP阳性神经细胞染色较淡 ,OT阳性神经细胞染色也较深 ,但分布稀疏 ,calbindin D、CGRP、GABA、SOM、VIP呈阴性反应 ;在咽下神经节与腹神经节 ,仅有少量AVP阳性神经细胞、glutamate阳性神经细胞和NPY阳性神经细胞散在分布 ;在肠神经系统 ,β EP阳性神经细胞、CGRP阳性神经细胞、SOM阳性神经细胞、VIP阳性神经细胞染色较深 ,分布散在 ;另外 ,在肠上皮 ,CGRP阳性上皮细胞、cal citonin上皮细胞和VIP阳性上皮细胞呈强阳性反应 ,分布于阴性上皮细胞之间。结果表明参环毛蚓神经系统存在着在其它环节动物所观察到的神经递质和神经肽 :ACTH、VIP、β endorphin、CCK、NPY、CGRP ,亦存在着文献从未报道过的神经递质和神经肽 :calcitonin、AVP、OT、glutamate、SOM ,其?

参环毛蚓中纤溶活性蛋白酶研究

分离纯化参环毛蚓中纤溶活性蛋白酶,并对其活性及氨基酸序列进行分析。采用凝胶层析等方法进行蛋白质的分离纯化,SDS-PAGE法进行分子质量的测定,纤维平板法测定纤溶活性,氨基酸自动分析仪分析氨基酸组成,并对一个具有纤溶活性的蛋白酶进行了序列分析。分离纯化得到4种酶,其中EQY-4活性较强,其N-端序列为:Gln-Ile-Gly-Gly-Thr-Asn-Ala-Ser-Pro-Gly-Glu-Phe-Pro-Pro-Gln-Leu-Ser-Gln-Thr。与文献报道中赤子爱胜蚓及粉正蚓中分离得到的蛋白酶对比,主要序列相近,但也有不同。

镉胁迫条件下对参环毛蚓体壁结构影响的研究

目的:研究不同浓度镉离子胁迫条件下对参环毛蚓体壁肌肉结构的影响,探索重金属镉在参环毛蚓体内的生物富集部位。方法:采用不同浓度镉离子胁迫参环毛蚓染毒,HE组织切片染色,光学显微镜下观察体壁肌肉结构的变化,以分析参环毛蚓富集重金属的方式。结果:内侧的斜纹肌损伤要明显比体壁外侧的环肌肉层要严重得多。结论:参环毛蚓体壁的损伤来源于其身体的内部,即对其构成损伤的物质来源于肠道的主动吸收,而不是通过其表皮的被动扩散吸收。

参环毛蚓细胞原代培养灭菌方法的研究

【目的】选择最佳灭菌方法,建立参环毛蚓细胞原代培养实验体系。【方法】通过4因素和3水平的正交试验法考察不同浓度比例抗生素组合液对参环毛蚓细胞的灭菌效果,比较不同抗生素种类和浓度对参环毛蚓细胞原代培养的影响。【结果】以抗生素组合液200 U/mL青霉素钠+400μg/mL硫酸链霉素+300 U/mL硫酸庆大霉素+5μg/mL两性霉素B对组织块的灭菌效果最佳,10 d污染率为0%,且细胞能保持较好活性,并贴壁生长。【结论】组合式灭菌法是参环毛蚓细胞原代培养的最佳有效灭菌方法,且操作简捷易行。

参环毛蚓对土壤含水量及pH值因子的选择研究

目的考察参环毛蚓对土壤含水量、pH值二因子的选择性，建立其生活所需要的土壤含水量、pH值单因子数学模型。方法在养殖槽内设置不同土壤含水量、pH值区域，由参环毛蚓选择适宜的生活区域。结果参环毛蚓生活适宜的土壤含水量为18.2%-24.6%，pH值为3.7-5.5。结论参环毛蚓选择在湿度适中，偏酸性的土壤中生活；高湿及较干燥，强酸性和碱性的土壤不适宜其生活。

参环毛蚓体内核苷磷酸化酶的活性测定及动力学分析

目的建立参环毛蚓体内嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）的检测方法,以肌苷为底物,评价该酶的活性。方法采用HPLC法,色谱条件：Ecosil C18-AQ柱（250 mm×4.6 mm,5μm）,流动相为10 mmol·L^-1磷酸二氢铵缓冲液（p H4.5）和甲醇,梯度洗脱,流速为0.8 m L·min^-1,柱温为室温,检测波长254 nm,用底物肌苷与组织粗蛋白提取液在室温孵育30 min,沸水煮5 min终止反应,12000 r·min^-1离心10 min,取上清过滤后进行HPLC分析,以Origin Pro 8.5软件作图,计算酶动力学参数。结果酶反应中产物次黄嘌呤在0.5-40μmol·L^-1范围内呈良好的线性关系（r=0.9996）;精密度小于3.5%,回收率大于80%。PNP酶动力学参数：Vmax为0.015nmol·min^-1·mg^-1,Km为19.8μmol·L^-1。结论成功构建了参环毛蚓体内次黄嘌呤代谢酶活性测定相关的实验体系,该法所得数据稳定可靠,可准确反映关键酶活性的动态变化。

参环毛蚓与赤子爱胜蚓的对比研究

目的:赤子爱胜蚓的抗栓活性可靠,为评价参环毛蚓的溶栓的药用价值,进行了相关的对比研究。方法:通过纤维蛋白平板试验对比活性,通过电泳法对比酶谱。结果:2种蚯蚓活性相近,参环毛蚓及赤子爱胜蚓的许多酶谱的分子量都相近,分子量多在60000以下,主要集中在30000左右。结论:参环毛蚓与赤子爱胜蚓活性与酶谱相近,具有进一步开发价值。

参环毛蚓不同部位细胞原代培养及鉴定

目的：筛选出参环毛蚓体内细胞培养的最佳部位,为建立参环毛蚓细胞原代培养方法提供实验基础。方法：分别提取参环毛蚓的皮、肠道、嗉囊、前列腺细胞进行培养,观察其细胞生长。结果：参环毛蚓的表皮和肠道细胞经培养后,细胞均有生长,并发现肠道细胞生长良好,5~6天后基本达到融合,细胞呈多边鹅卵石样,透明度及折光性强。另发现参环毛蚓的嗉囊、前列腺等部位的细胞没有增长迹象。结合形态学鉴定,原代培养及传代的细胞98%以上为肠上皮细胞。结论：参环毛蚓的肠道是建立细胞系的首选材料,采用此方法分离培养的肠上皮细胞数量多,均一性生长佳,可重复性强。

神经营养因子受体TrkA、TrkB、TrkC和TrkE在参环毛蚓体内的分布

高亲和性神经营养因子受体Trk ,广泛存在分布于哺乳动物神经组织。研究表明 :随着动物进化程度的降低 ,亚型Trk受体的类型有所减少 ;在低等动物 ,关于环节动物 (Annelida)Trk受体存在与否、分布如何尚未见报道。以我国环节动物门典型代表参环毛蚓 (Pheretimaaspergillum)为研究对象 ,运用免疫细胞化学染色技术 ,在光镜下观察TrkA、TrkB、TrkC和TrkE阳性细胞和纤维的形态与分布。发现Trk存在于参环毛蚓的神经系统和非神经组织。各亚型分布有所差异 ,TrkA阳性神经细胞存在于咽下神经节和肠神经系 ,阳性神经纤维存在于腹神经索和肠神经系 ;TrkB阳性细胞存在于非神经组织的肠上皮 ;TrkC阳性神经细胞存在于脑、咽下神经节和肠神经细胞 ,阳性神经纤维存在于围咽神经环、腹神经索和肠神经系 ;TrkE阳性神经细胞存在于脑、阳性神经纤维存在于咽下神经节和腹神经索。上述研究结果表明 :Trk存在于进化程度较低的环节动物 ,Trk在进化上具有悠久的历史。各亚型Trk受体的不同分布提示不同部位的神经细胞受不同神经营养因子的作用。

重金属镉对参环毛蚓表皮结构的损伤

目的:探讨不同浓度镉离子胁迫下,对参环毛蚓表皮结构的影响。方法:采用不同浓度镉离子胁迫参环毛蚓染毒、HE组织切片染色、光学显微镜,下观察其体表结构损伤的变化。结果:随着镉离子浓度的增加和染毒时间的增长,参环毛蚓的环带附近有充血肿胀、溃疡病变。在光学显微镜下,在低浓度组时,皮肤的超微结构却发生了明显的改变,皮肤角质层明显增厚,而在高浓度组时,表皮层发生溃疡,其皮肤的防御体系受到损坏,体表的角质层变薄。结论:重金属镉对参环毛蚓表皮结构具有明显的损伤,且随着浓度的增加和染毒时间的增长,这种损伤更加明显,反映了参环毛蚓对该重金属的防御性反应。

参环毛蚓肠上皮细胞重金属镉离子的耐受性研究

【目的】观察参环毛蚓肠上皮细胞(IEC)对重金属镉离子(Cd2+)的耐受能力,探讨其耐受特性与广地龙药材重金属超标的相关性。【方法】采用不同浓度Cd2+对参环毛蚓IEC进行胁迫处理,分别利用台盼蓝染色法和噻唑蓝法测定细胞死亡率和细胞活力,并借助显微镜观察与比较参环毛蚓IEC胁迫处理前后的形态变化。【结果】IEC对Cd2+的耐受特性主要表现为:①未经孵育时IEC可耐受Cd2+的最高浓度为8μmol/mL;②胁迫处理24 h后IEC可耐受Cd2+的最高浓度为6.25×10-2μmol/mL;③胁迫处理48 h时,IEC可耐受Cd2+的最高浓度为3.125×10-2μmol/mL,上述3个浓度分别是《中华人民共和国药典》(2010年版)中地龙项下镉限量指标的2 997.33、23.33和11.66倍;④IEC对Cd2+的耐受性在一定的时间范围内与剂量呈负相关。【结论】参环毛蚓IEC对重金属Cd2+具有较高的耐受性。Cd2+对IEC的毒性作用不是接触性的损伤,而有可能是产生于细胞代谢过程中。

参环毛蚓神经组织的NSE、NF200、ED1、GFAP和NO细胞化学特性

为研究环节动物的神经组织学特性 ,我们选择生活在我国的环节动物门典型代表参环毛蚓 (Pheretimaaspergillum)为研究对象 ,使用若干种兔抗鼠抗体 ,进行了免疫细胞化学与细胞化学染色 ,在光学显微镜下观察反应阳性细胞的形态与分布。研究发现 ,在参环毛蚓脑、咽下神经节、腹神经节所有神经细胞呈NSE阴性 ;在参环毛蚓脑 ,部分神经细胞呈NF2 0 0阳性 ,在咽下神经节、腹神经节未观察到NF2 0 0阳性神经细胞 ;在参环毛蚓脑观察到较多ED1阳性细胞 ;在参环毛蚓脑、咽下神经节、腹神经节均未观察到GFAP阳性细胞 ;在参环毛蚓脑未观察到NADPH d阳性神经细胞 ,而在咽下神经节和腹神经节部分神经细胞及纤维NADPH d阳性。结果表明 ,参环毛蚓神经细胞的神经细胞特异的烯醇化酶特性、神经微丝蛋白特性与星型胶质细胞的GFAP特性不同于哺乳动物 ;其神经组织存在有数量较多的吞噬功能的类似于哺乳动物小胶质细胞的细胞 ;参环毛蚓的脑不含有NO能神经细胞 ,而咽下神经节和腹神经节含有NO能神经细胞。

谷氨酸与代谢型谷氨酸受体1亚型、2/3亚型、4亚型在参环毛蚓的分布——免疫细胞化学研究

目的 探讨谷氨酸与其代谢型谷氨酸受体在参环毛蚓 (P .aspergillum)的存在与否及分布情况。方法 用免疫细胞化学染色技术 ,在光学显微镜下观察谷氨酸与代谢型谷氨酸受体 1亚型、2 / 3亚型、4亚型阳性细胞的形态与分布。 结果 发现谷氨酸存在于参环毛蚓的脑、咽下神经节、腹部神经节的神经细胞、肌间神经细胞 ,以及肠上皮和体表上皮的非神经细胞。在围咽神经环与腹神经链及腹神经链所发出侧支的切面可见深染的细密的阳性神经纤维束。代谢型谷氨酸受体 1亚型、4亚型仅存在于参环毛蚓的脑。未观察到代谢型谷氨酸受体 2 / 3亚型阳性细胞的存在。 结论 参环毛蚓中枢神经系统谷氨酸阳性神经细胞的部分细胞突起显著 ,形态成熟 ,围咽神经环与腹神经链及腹神经链所发出侧支的阳性神经纤维是它们的投射纤维 ;部分细胞无突起 ,形态幼稚 。

气相色谱/质谱法研究华南参环毛蚓的脂肪酸

本文作者用醚提取华南参环毛蚓中的脂肪酸甘油酯,然后以KOH—甲醇甲酯化,利用气相色谱/质谱/计算机联用技术研究其脂肪酸组成.从蚯蚓干粉及体腔液中均检出葵酸、月桂酸、十三酸、10—甲基十二酸、豆蔻酸、十五酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、硬脂酸等10种脂肪酸和2,6—二异丁基—甲基苯酚.

中药地龙中参环毛蚓环介导等温扩增快速检测方法

[目的]建立中药材地龙中参环毛蚓的环介导等温扩增(LAMP)检测技术,实现对参环毛蚓的快速检测。[方法]采集不同产地地龙,提取总DNA后将所提取的总DNA进行线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COI)基因片段扩增、测序、比对,判断各产地地龙物种。用设计的LAMP引物组进行地龙LAMP实验,反应结束后向扩增产物中加入核酸染料SYBR GreenⅠ,分别在自然光、紫外光下直接通过肉眼来观察颜色变化及利用琼脂糖凝胶电泳来检测其引物的特异性。[结果]利用新设计的LAMP引物对参环毛蚓实现了特异性扩增,且检出限达40 fg/μL,具有极高的灵敏度。[结论]利用LAMP技术可实现参环毛蚓的现场快速检测。

抗栓用参环毛蚓水提取方法的筛选

目的优选抗栓用参环毛蚓的最佳水提工艺。方法采用L9(34)正交试验法筛选最佳水提条件。结果最佳水提条件为第1次加4倍水,浸泡30 min,第2次加3倍水,浸泡30 min。结论采用本工艺提取参环毛蚓溶栓效价为300 U/g,该工艺稳定、可行。