三角梅品种‘绿叶樱花’4,5-多巴双加氧酶开放阅读框克隆与分析

【目的】多巴双加氧酶(4,5-DOPA dioxygenase extradiol)是甜菜色素生物合成途径的关键酶之一,能催化多巴分解形成甜菜醛氨酸,也是最可能与三角梅最终的花色形成相关的酶蛋白。克隆三角梅多巴双加氧酶基因的开放阅读框(ORF),对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,探讨三角梅花色变化机理和甜菜色素代谢途径。【方法】以三角梅品种‘绿叶樱花’的苞片为材料,提取其RNA,并进行逆转录,之后快速转化完成基因的克隆和基因PCR扩增,最后对其编码的氨基酸序列进行保守区预测、信号肽分析、磷酸化位点预测、跨膜信号预测、同源性比对、构建系统进化树以及二、三级结构预测,研究其氨基酸序列的结构和功能。【结果】‘绿叶樱花’的多巴双加氧酶基因ORF序列长801 bp,编码266个氨基酸。ORF序列所编码的氨基酸序列具有cd07363保守结构域,其编码蛋白是一种稳定的酸性亲水蛋白,分子量为29 734.76 kD,等电点为6.26,二级结构包含了11个α螺旋、7个β转角、20个β折叠结构,具有4个磷酸化位点,没有跨膜结构,可能只在细胞质内发挥作用。该序列还与66个序列高度同源,与同科的‘金心双色’、胶果木和梭房叶子花有着相同的进化分支,符合自然进化规律。【结论】‘绿叶樱花’多巴双加氧酶开放阅读框ORF的氨基酸序列属于第三类雌二醇双加氧基因家族,具有该基因家族具有的保守氨基酸序列,表明多巴双加氧酶基因在生成甜菜色素植物中具有独特的保守性,且属于稳定、酸性的亲水蛋白,没有跨膜结构,可能只在细胞质内发挥作用。三角梅中控制花色变化的主要是甜菜色素,研究三角梅甜菜色素合成途径中的关键酶,解析其甜菜色素的合成代谢机制,可为三角梅花色形成机制提供理论参考,有望在今后的工作中,利用转基因手段丰富三角梅花色。

食管癌组织吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO-1)高表达与食管癌患者不良预后相关

目的 基于多种生物信息学数据库和免疫组织化学染色分析吲哚胺2, 3-双加氧酶1(IDO-1)在食管癌中的表达及临床意义。方法 通过免疫组织化学染色法检测IDO-1在食管癌组织和癌旁组织的表达水平,利用肿瘤免疫评估资源数据库(TIMER)、基因表达谱交互分析数据库(GEPIA)、阿拉巴马大学伯明翰分校癌症数据分析数据库(UALCAN)、 Kaplan-Meier plotter、癌症基因组图谱数据库(TCGA)等数据库分析IDO-1在食管癌组织中的表达情况,IDO-1差异表达对食管癌患者预后的影响,IDO-1表达与肿瘤特征基因通路的相关性,IDO-1表达与免疫细胞浸润情况及免疫检查点表达情况的相关性。结果 免疫组织化学染色结果显示,IDO-1在食管癌组织中的阳性表达率为70%,明显高于癌旁组织的15%;IDO-1表达与患者年龄、性别无显著差异。IDO-1表达在低分化食管癌组织、高临床分期级有淋巴结转移的组织表达增加;GEPIA数据库和TIMER数据库分析结果显示,IDO-1在食管癌组织中表达水平显著高于癌旁组织;UALCAN数据库分析结果显示,IDO-1在低分化食管癌、有淋巴结转移的患者高表达;GEPIA数据库、 Kaplan-Meier plotter数据库、 UALCAN数据库分析结果显示,IDO-1高表达的食管癌患者,特别是食管鳞状细胞癌患者的生存时间显著缩短,但食管腺癌患者的IDO-1表达水平与生存时间并无显著相关性;TCGA数据库食管癌RNA-seq数据的通路富集、免疫细胞浸润、免疫检查点表达情况分析结果显示食管癌患者IDO-1的表达水平与多种食管癌恶性进展基因通路密切相关,并且IDO-1表达与多种免疫细胞浸润和免疫检查点表达关系密切。结论 IDO-1在食管癌中高表达并与患者不良预后密切相关,高表达IDO-1是食管癌恶性进展及免疫抑制微环境形成的关键因素。

猕猴桃类胡萝卜素裂解双加氧酶基因AcCCD的克隆与表达分析

【目的】对猕猴桃类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCD)基因进行克隆,并进行理化和表达分析。【方法】从猕猴桃基因数据库中鉴定CCD候选基因,克隆3条目的基因全长,并利用荧光定量PCR技术分析所选基因在猕猴桃果实发育期及不同组织的表达量。【结果】克隆得到3个类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCD)基因,命名为AcCCD1.1、AcCCD1.2和AcCCD7。其开放阅读框(ORF)分别为1 890、1 632和1 818 bp,编码629、543和605个氨基酸。经预测,3种AcCCD蛋白均定位于细胞质,不具有信号肽,不属于分泌蛋白。经分析,AcCCD1.1、AcCCD1.2蛋白属于CCD1蛋白家族,AcCCD7蛋白属于CCD7家族。系统进化树显示,3个基因编码的蛋白与野茶树等植物蛋白相似性高。对AcCCD基因qRT-PCR,结果表明AcCCD1.1在根中表达量高,叶中最低;AcCCD1.2在花、果实发育后期表达量高。AcCCD7表达量总体较低,根中表达量高于在其茎、叶、花和果的表达量。【结论】推测AcCCD1基因对于猕猴桃果实颜色以及香味的形成有重要联系。AcCCD7基因对于猕猴桃根系生长上具有重要调控作用。

对羟苯基丙酮酸双加氧酶的研究进展

农药作用靶标或作用机制的创新是农药科学研究需要解决的关键科学问题之一。对羟苯基丙酮酸双加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,HPPD)是生物体酪氨酸代谢途径中的关键酶,在不同的生物体内参与的代谢路径不同。前期的研究表明,HPPD抑制剂在医药和除草方面发挥了较大的作用,而近期的研究发现其在抑菌和杀蚊等方面也表现出了潜在的应用价值。本文概述了HPPD在不同生物体中的生理功能,介绍了HPPD在人、植物、吸血节肢动物、真菌体内参与的代谢过程,总结了不同种属来源HPPD的三维结构,概述了HPPD作为靶标在医药以及农药(除草、杀虫、杀菌等)方面的研究现状并进行了展望。

吲哚胺2,3-双加氧酶在血液系统恶性肿瘤中的作用双加氧酶在血液系统恶性肿瘤中的作用及临床研究进展

吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)是调节色氨酸代谢的关键酶,其过表达会引起肿瘤中色氨酸代谢异常,通过下游信号通路进一步调控肿瘤微环境(TME)中细胞成分发生变化,参与肿瘤细胞免疫逃逸。临床研究发现,IDO过表达与血液系统恶性肿瘤患者预后不良密切相关,IDO抑制剂在血液系统恶性肿瘤的治疗中显示出广阔前景。本文对IDO在血液系统恶性肿瘤中的作用及临床研究进展进行综述。

吲哚胺2,3双加氧酶在真菌感染的研究进展

吲哚胺2,3双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)是色氨酸(tryptophan,TRP)沿着犬尿氨酸(kynurenine,KYN)降解的限速酶。IDO调控KYN途径已经被认为是重要的耐受刺激和免疫应答调节机制。在真菌感染性疾病中,IDO活性的表达与真菌感染性疾病严重程度成正相关。该文主要综述在宿主抵御真菌时,诱导IDO活化调控宿主免疫机制的研究进展。

TET甲基胞嘧啶双加氧酶2在心血管疾病发病机制中的研究进展

心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)是中国人最主要的死亡原因。动脉粥样硬化、心肌细胞凋亡、心肌肥厚和纤维化是CVD主要的病理过程。基因的表观遗传修饰特别是DNA甲基化在CVD中起重要作用。研究表明,TET甲基胞嘧啶双加氧酶2(Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 2,TET2)参与基因表观遗传调控,TET2在CVD的发病机制中起重要作用。TET2可以调节心脏发育、改善动脉粥样硬化过程中内皮细胞功能障碍、调节血管平滑肌细胞表型转换、抑制免疫炎症反应和心肌细胞凋亡、心肌肥厚和纤维化。本文就TET2在CVD发病机制中的研究进展进行综述。

吲哚胺2,3-双加氧酶1在肝癌中的表达及其作用的初步研究

目的:探讨吲哚胺2,3–双加氧酶1(IDO1)在肝癌与癌旁组织中的表达情况及其作用。方法:应用公共数据库获取IDO1在泛癌和肝癌中的表达数据。应用免疫荧光染色法对82例肝癌和配对癌旁组织以及14例无配对的肝癌组织中IDO1的表达情况进行检测。皮下接种人源肝癌细胞SK–HEP1建立裸鼠皮下移植瘤模型,并予以IDO1抑制剂干预,通过苏木精–伊红(HE)病理染色和增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色评价IDO1抑制剂对肝癌细胞在体内生长速度的影响,免疫荧光染色检测瘤体组织中簇分化抗原(CD)4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞的浸润情况。结果:IDO1在多种癌组织中高表达。与癌旁组织相比,肝癌组织中IDO1的表达水平明显升高。病理染色结果示,抑制IDO1的表达可以明显降低肝癌移植瘤组织中PCNA的表达水平,增加CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞的浸润。结论:IDO1在肝癌组织中高表达,下调IDO1的表达可抑制肝癌细胞在体内增殖,延缓皮下瘤体的生长速率,增强免疫细胞对肿瘤细胞的应答。

深海沉积物宏基因组中新型对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因的鉴定

为采用不依赖培养的方法获取深海沉积物微生物遗传资源,利用深海沉积物DNA构建了2个宏基因组文库,对对羟基苯丙酮酸双加氧酶(4HPPD)活性进行了筛选,并分离出3个克隆子。体外转座子突变和全长测序发现了两个新的4 HPPD基因和一个新的尿黑酸(HGA)代谢基因簇。克隆到pMD18-T载体中的3个新的4 HPPD基因能够在大肠杆菌中产生水溶性棕色素。该色素被鉴定为黑色素,并与HGA相关。结果表明,深海沉积物宏基因组含有多样性丰富的4 HPPD功能基因,可用于发现新的黑色素生物合成基因。

吲哚胺2,3-双加氧酶1在胃癌中的研究进展

胃癌(Gastric Cancer,GC)是全球第五大最常见的恶性肿瘤,也是第四大癌症死亡相关原因。胃癌异质性明显,肿瘤微环境复杂,免疫检查点抑制剂虽然在晚期胃癌中展现出一定抗肿瘤疗效,但获益人群仍在少数。吲哚胺2,3-双加氧酶1(Indoleamine 2,3-Dioxygenase 1,IDO1)是色氨酸沿犬尿氨酸途径代谢中的关键酶,对肿瘤免疫逃逸起到了关键作用。目前已有多项研究表明IDO1在胃癌发生发展及幽门螺杆菌感染和EB病毒感染中发挥重要作用,所以靶向IDO1有望成为胃癌免疫治疗的新策略。本文就IDO1作用机制、IDO1在胃癌及相关疾病中的研究进展及IDO1抑制剂在胃癌中的应用前景进行综述。

色氨酸-2,3-双加氧酶2在类风湿关节炎患者外周血单个核细胞和滑膜组织中的表达及意义

目的探讨色氨酸-2,3-双加氧酶2(TDO2)在类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMC)和滑膜组织中的表达及临床意义。方法选取40例RA患者作为RA组,另选取同期36例健康人作为正常对照组。流式细胞术检测RA组和正常对照组PBMC中TDO2表达;免疫荧光法检测RA组和正常对照组滑膜组织中TDO2表达;分析RA组PBMC中TDO2表达与其炎症指标之间的相关性。结果与正常对照组相比,RA组PBMC和滑膜组织中TDO2表达均显著升高,差异有统计学意义(P<0.001);RA组PBMC中TDO2表达与红细胞沉降率(ESR)呈正相关(r=0.405,P=0.045)。结论TDO2在RA患者PBMC和滑膜组织中表达增加,并与炎症指标ESR呈正相关,提示TDO2可能参与了RA的疾病进展。

不结球白菜类胡萝卜素裂解双加氧酶基因BrCCD4a的克隆及表达分析

为探究CCD基因在不结球白菜叶片类胡萝卜素调控中的作用,本试验以不结球白菜NN2108为试验材料,克隆获得BrCCD4a基因。应用生物信息学方法对BrCCD4a蛋白氨基酸序列、理化性质及CCD4基因亲缘关系等方面进行分析,利用亚细胞定位技术明确BrCCD4a基因的空间表达。此外,以3个不结球白菜品种HB02、SX04和NN2108为材料,测定叶片中类胡萝卜素含量及BrCCD4a基因的相对表达水平。结果表明,BrCCD4a含有1个长为1 797 bp的开放阅读框(ORF),编码598个氨基酸,其编码的蛋白质相对分子质量为65 860,等电点为6.42。氨基酸序列分析结果表明,BrCCD4a属于CCD蛋白家族成员,与甘蓝CCD4氨基酸序列相似度最高。系统进化结果也显示其与甘蓝的进化关系最近。BrCCD4a蛋白主要由无规则卷曲、延伸链构成,且不存在信号肽。亚细胞定位分析发现BrCCD4a定位在叶绿体上。不同不结球白菜品种叶片中叶黄素和β-胡萝卜素含量差异较大,HB02叶片中叶黄素含量最低,为1.14 mg/g, SX04叶片中叶黄素含量最高,达2.34 mg/g。NN2108叶片中β-胡萝卜素含量最高,达2.31 mg/g,是HB02含量的1.94倍。BrCCD4a在3个品种叶片中的相对表达水平趋势与β-胡萝卜素含量趋势一致,在NN2108叶片中表达量最高,在SX04中次之,在HB02叶片中表达量最低。本研究结果为探究BrCCD4a在不结球白菜叶片类胡萝卜素降解过程中的作用提供理论基础。

拟南芥尿黑酸双加氧酶基因突变体转录组分析

尿黑酸双加氧酶(Homogentisate dioxygenase, HGO)催化酪氨酸降解代谢第三步反应。HGO突变会促进拟南芥生长。该研究对拟南芥hgo突变体和野生型的转录组进行分析,探究HGO影响拟南芥生长的机制。结果表明,突变体和野生型间1413个基因表达存在差异;其中741个基因在突变体中表达上调,672个基因在突变体中表达下调。GO功能注释显示,差异基因显著富集在生长素响应、氨基酸代谢、谷胱甘肽代谢等过程。KEGG通路分析显示,差异基因主要涉及苯丙烷类生物合成、类黄酮生物合成、MAPK信号途径、谷胱甘肽代谢、植物激素信号传导、淀粉和蔗糖代谢等通路。研究结果表明HGO可能通过影响苯丙烷类生物合成和激素信号传导等调控拟南芥生长。该研究结果可为进一步探究酪氨酸降解代谢在植物中的功能奠定基础。

莲类胡萝卜素裂解双加氧酶4(NnCCD4)基因家族鉴定与功能分析

莲以其独特香气深受人们喜爱。为了研究莲的香气物质形成机制,本研究通过生物信息学对莲香气物质形成的关键酶NnCCD4基因家族进行分析,分析NnCCD4的催化产物,进一步探索莲属植物香气物质形成的分子机制,并通过同源克隆从莲基因组中获得3个NnCCD4基因家族成员(NnCCD4a、NnCCD4b和NnCCD4c)。结果表明,植物CCDs家族结构相似且都含有保守结构域,与NnCCD4c相比,NnCCD4a与NnCCD4b之间具有较高的同源性;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果发现,NnCCD4家族成员在莲子、叶片和花中表达量存在显著差异;构建NnCCD4原核表达载体,细菌颜色互补试验结果证明NnCCD4b可以催化β-胡萝卜素氧化裂解,产生挥发性物质β-紫罗兰酮。本研究为NnCCD4的生物学功能研究提供了理论基础。

吲哚胺2,3-双加氧酶1对急性放射性肠道损伤的保护作用

目的:探讨吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)对急性放射性肠道损伤的作用。方法:使用TCGA和GTEX数据集中结肠癌、直肠癌组织和正常对照组织的测序结果,分析IDO1基因在肠癌组织及正常肠道组织中的表达情况。使用CRISPR/Cas9技术敲除鼠正常肠上皮IEC-6细胞中IDO1基因的部分第2、3外显子序列,建立鼠IEC-6的IDO1 KO(IDO1^(-/-))细胞系,并给予两个细胞系(野生型和IDO1^(-/-))放射处理。C57BL/6野生型小鼠和IDO1基因敲除(IDO1^(-/-))小鼠也给予腹部X射线照射以建立细胞和动物急性放射性肠道损伤模型。使用蛋白质印记法(Western blot)检测野生型和IDO1^(-/-)的IEC-6细胞及小鼠肠道组织中上皮紧密连接蛋白在放射前、后的蛋白表达水平。结果:Western blot证实IDO1在鼠IEC-6细胞、肠道组织中均有表达。对TCGA和GTEX数据集分析后也同样看到IDO1基因在结肠癌、直肠癌、正常肠道组织中均有表达,但癌组织中IDO1水平较正常肠道组织高(P<0.05)。体内外的放射照射后,IDO1、Claudin 1、Occludin、ZO-1等出现明显变化:与放射前比,放射后的细胞和小鼠组织中的IDO1的表达水平升高(P<0.05),而紧密连接蛋白Claudin 1、Occludin、ZO-1则下降(P<0.05);与野生型IEC-6细胞和小鼠相比,在IDO1^(-/-)IEC-6细胞和小鼠肠组织中,Claudin 1、Occludin、ZO-1下降更显著(P<0.05)。结论:IDO1在急性放射性肠道损伤中起保护作用,其保护作用可能是通过保护肠上皮细胞间紧密连接功能而实现的。

基于虚拟筛选的新型吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂的发现及活性评价

目的应用药效团模型及分子对接的综合虚拟筛选策略,对Specs及Chembridge数据库进行筛选并进行生物学活性评价,以期发现新型吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO1)抑制剂。方法基于已报道IDO1抑制剂,利用Discovery Studio 2019软件的Pharmacophores(Hiphop)模块构建药效团模型。通过最优药效团模型初步筛选了Specs及Chembridge数据库,后采用LibDock及CDOCKER程序靶向IDO1活性位点进行层级分子对接,最终保留了40个苗头化合物,并在100μmol/L浓度下进行了细胞水平IDO1酶抑制活性初筛。选取初筛抑制率大于50%的11个化合物进行细胞水平及生化水平抑酶活性的进一步测定。采用SPR及分子对接模型进一步确证及阐明化合物与IDO1酶之间的相互作用方式。结果发现羟基嘧啶类化合物29在细胞水平及生化水平上均呈现了IDO1酶抑制活性,EC50和IC50分别为(53.93±1.22)μmol/L和(179±8.12)μmol/L。SPR研究进一步确证了化合物29与IDO1之间的直接结合(KD=65.92μmol/L)。分子对接模型研究显示羟基嘧啶基团与IDO1的卟啉环之间存在较为丰富的相互作用,是靶向识别的关键基团。结论羟基嘧啶类化合物29是一类新型IDO1抑制剂,可作为IDO1酶抑制剂的先导物,通过进一步结构改造及优化,有望获得高效、结构新颖的IDO1抑制剂及新型肿瘤免疫治疗药物。

苯酚降解菌红球菌PNAN5菌株(Rhodococcussp.strain PNAN5)的分离鉴定、降解特性及其开环双加氧酶性质研究

分离到一株能以苯酚、苯甲酸、对甲酚、萘为唯一碳源和能源生长、具有同时降解单环和双环芳烃能力的细菌菌株,经生理生化、16SrRNA基因序列分析等鉴定为红球菌PNAN5菌株(Rhodococcussp.strainPNAN5).在实验条件下和在温度为20～40℃、pH7 0～9 0范围内菌株PNAN5降解苯酚的效率保持在80%～100%之间,苯酚浓度在2～10mmol·L-1范围内变化对降解效率没有明显的影响.该菌株通过邻苯二酚1,2 双加氧酶催化的开环途径降解芳烃,不同于已知的浑浊红球菌(R.opacus)是通过邻苯二酚2,3 双加氧酶催化芳烃降解.以细胞裂解液测定该酶的酶促反应动力学常数Km值为35 94μmol·L-1,Vmax为0 84μmol·L-1·min-1·mg-1.

邻苯二酚2,3-双加氧酶基因克隆、定位和高效表达

采用特异性引物 ,以菲、芘降解菌株ZL5的代谢性质粒为模板 ,扩增出邻苯二酚 2 ,3-双加氧酶 (C2 3O)基因 .将该基因和表达载体pET - 30a(+)连接 ,转化E .coliJM10 9(DE3) ,获得了高效表达的转化子 .SDS -PAGE结果表明 ,转化子的C2 3O蛋白不仅在细胞内存在 ,而且能被分泌到胞外 ,薄层扫描显示 ,转化子细胞内和细胞外表达蛋白总量占细胞总蛋白的 4 2 % .酶活分析表明 ,分布在转化子细胞内、外的表达蛋白都具有较高的C2 3O比活力 .Southern杂交将菌株ZL5的C2 3O基因定位在内生质粒的不同酶切片段上 .图 5表 1参

两相体系中固定化联苯双加氧酶全细胞产靛蓝特性研究

微生物全细胞转化靛蓝的过程中,靛蓝易被游离细胞吸附,造成产物提取困难,是微生物产靛蓝工业化进程中面临的主要问题之一.为解决该问题,尝试了不同固定化方法将基因工程菌固定,其中海藻酸钠包埋法取得了最好的效果,最佳包埋条件为3.5%海藻酸钠、1%氯化钙,固定化细胞在有机-水两相体系中可以重复利用两次,首次转化6h后,靛蓝浓度为15.9mg/L.另外,两相体系的引入有效避免了固定化细胞产靛蓝过程中伴随的产物分解现象,选择正十二烷作为有机相,优化得到其最佳比例为体积分数40%.体系对吲哚的最佳耐受浓度为400mg/L,在此条件下,靛蓝产率为0.28mg/mg.

石油污染土壤中芳烃降解菌及邻苯二酚2,3双加氧酶的克隆

石油污染土壤中的芳烃降解菌是进行土壤修复的主要生物资源,本研究对某炼油厂附近土壤中的芳烃降解菌及邻苯二酚2,3双加氧酶基因进行了研究。结果表明,部分石油烃污染土壤中存在着大量的芳烃降解菌;对其中一个土壤样本中的邻苯二酚2,3双加氧酶基因进行克隆,获得了7个不同的邻苯二酚双加氧酶基因序列,序列分析表明这些基因可能来源于土壤中的假单胞菌,且该基因在土壤中的丰度与污染水平及芳烃降解菌的数量相关。可见,土壤中芳烃降解菌数量及降解基因的丰度和多样性,可以对石油污染土壤的生物修复进行监控并为生物修复提供丰富的微生物资源。