检测H6亚型禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法的建立及初步应用

为建立快速检测H6亚型禽流感病毒的血清学方法,试验利用前期制备的两株抗H6亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体,建立检测H6亚型禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法,并进行特异性、灵敏度、稳定性试验以及对活禽市场采集的48份咽拭子样品的检测效果。结果显示:该ELISA方法只与H6亚型禽流感病毒反应,而与H1、H3、H4、H5、H7、H9、H10、H12等其他亚型禽流感病毒,血清4型禽腺病毒、血清8b型禽腺病毒、血清3型鸭腺病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、鹅星状病毒、小鹅瘟病毒、传染性法氏囊病病毒以及禽白血病病毒均无交叉反应;该ELSIA方法可检测2.32×10^(4)TCID50/mLH6亚型禽流感病毒,批间和批内重复试验变异系数均小于10%;该ELISA方法和RT-PCR方法对活禽市场采集的48份咽拭子样品检测结果一致,进一步检测攻毒鸡的咽拭子显示该方法可有效检测咽拭子中H6亚型禽流感病毒。研究表明,基于两株单克隆抗体建立的检测H6亚型禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法具有特异性强、灵敏度高的特点,适用于H6亚型禽流感病毒感染的临床检测。

鸡减蛋综合征病毒中和性单克隆抗体的制备、鉴定及在双抗体夹心ELISA中的应用

为了制备针对鸡减蛋综合征病毒(EDSV)的中和性单克隆抗体,首先纯化得到重组EDSV纤维蛋白,经血凝试验(HA)鉴定纤维蛋白的血凝活性,HA效价为1∶2~7。之后将纤维蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,小鼠血清的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)效价最高达到1∶409 600,间接免疫荧光试验(IFA)效价最高达到1∶12 800。取效价最高免疫小鼠脾细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞,结合iELISA和IFA检测,经过多轮亚克隆,最终成功获得了2株稳定分泌中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株9G12和10E11。iELISA结果显示,单克隆抗体9G12和10E11的腹水效价分别为1∶128 000和1∶1 020 000;IFA效价分别为1∶2 000和1∶8 000。Western blot检测结果显示,单克隆抗体9G12和10E11均不能识别变性的EDSV纤维蛋白,表明二者识别纤维蛋白的构象型表位。病毒中和试验结果表明,单克隆抗体9G12和10E11均具有中和活性,中和效价分别为1∶2~7和1∶2~4。亚型鉴定表明,这2种单克隆抗体的轻链均为Kappa型,重链均为IgG1亚型。将基于单克隆抗体9G12和10E11建立的双抗体夹心ELISA方法应用于临床检测EDSV抗原,与荧光定量PCR检测结果的符合率为91.7%。综上,成功筛选出9G12和10E11杂交瘤细胞株,二者分泌抗EDSV特异性抗体,且这2种抗体具有中和EDSV感染活性,可应用于EDSV的临床检测。

禽腺病毒4型Fiber-2蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

旨在制备禽腺病毒4型(FAdV-4)Fiber-2蛋白的单克隆抗体并建立Fiber-2蛋白的定量检测方法。本研究将原核表达的Fiber-2蛋白免疫BALB/c雌鼠,通过细胞融合技术制备杂交瘤细胞,并通过免疫印迹、间接免疫荧光和抗体相加试验筛选杂交瘤细胞株;以制备的单克隆抗体为捕获抗体和酶标检测抗体,通过优化捕获抗体包被浓度和酶标抗体稀释度等条件,建立特异性检测Fiber-2蛋白的双抗体夹心ELISA方法。结果:本研究成功筛选到3株能够稳定传代的杂交瘤细胞株1H2、2A9和3E1,其分泌的抗体均与FAdV-4全病毒具有良好的反应性,可识别不同抗原表位;进一步发现,以1H2为捕获抗体、2A9为酶标检测抗体,能够建立检测Fiber-2蛋白的ELISA方法;该方法具有良好的重复性,批内重复及批间重复试验变异系数均小于10%;敏感性高,Fiber-2蛋白检测限为0.078 ng/μL;特异性好,不与FAdV-4的其他结构蛋白及鸭腺病毒3型的Fiber-2蛋白发生反应。综上,本研究成功制备了3株Fiber-2蛋白单克隆抗体,并建立了定量检测Fiber-2蛋白的双抗体夹心ELISA方法,为后续FAdV-4基础研究和Fiber-2亚单位疫苗研究奠定了物质基础。

牛病毒性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

将牛病毒性腹泻病毒超免疫血清以常规方法提取IgG,采用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶(HRP),建立了从粪样中检测牛病毒性腹泻病毒抗原的双抗体夹心ELISA。结果,抗体的最佳包被量为150μg/mL,酶标抗体最适工作浓度为1∶200;封闭液为50mL/L的兔血清;待检粪样及酶标抗体的感作时间为37℃120min;底物显色时间为室温15min。应用建立的检测方法对河北省8个大中型奶牛场298份乳牛腹泻粪样进行了检测,结果,阳性检出率为42.6%。

双抗体夹心ELISA检测排泄物PEDV

用蔗糖密度梯度离心法纯化猪流行性腹泻病毒(PEDV)免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术获得2株分泌抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)单克隆抗体,建立检测PEDV的双抗体夹心ELISA方法。结果表明,该双抗体夹心ELISA最佳反应条件为,兔抗PEDV抗体稀释度为1:800包被37℃1 h加4℃12 h,样品反应时间为90 min,酶标抗体工作浓度为1:2 000作用45 min,以OD490nm≥0.37作为阳性判定标准。该ELISA的重复性变异系数小于10%,最低检测限为5×103.67TCID50/m L,并与猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒无交叉反应。用该ELISA方法和RT-PCR方法检测48份临床粪便样品,结果显示,ELISA阳性检出率为39.6%,而RT-PCR方法检测卡的阳性检出率为43.8%。表明双抗体夹心ELISA方法具有特异性强、灵敏性高和重复性好等优点,可用于PEDV快速检测。

Pfs25蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的建立

目的:制备恶性疟原虫子孢子囊表面膜蛋白Pfs25的单克隆抗体(mAb),建立检测Pfs25蛋白的双抗体夹心ELISA方法。方法:纯化毕赤酵母表达的重组Pfs25蛋白,并免疫BALB/c小鼠,采用骨髓瘤细胞Sp2/0与免疫BALB/c鼠脾细胞杂交的细胞融合技术,通过间接ELISA检测获得分泌抗Pfs25抗体的阳性杂交瘤细胞株,通过免疫F1鼠诱生腹水,纯化腹水,并进行mAb的各项生物学鉴定。辣根过氧化物酶(HRP)标记纯化后的抗体,以4B7为包被抗体,1B4为酶标抗体,建立了双抗体夹心ELISA法。结果:获得3株抗Pfs25的杂交瘤细胞株,其中2株有良好的稳定性和特异性。并建立了双抗体夹心ELISA检测法,检测有效范围在0.07～1 mg/mL,其检测灵敏度为41.6 ng/mL。结论:成功制备抗Pfs25蛋白的单克隆抗体,并建立了一种可用于Pfs25蛋白检测的双抗体夹心ELISA法,为Pfs25蛋白制备传播阻断型疟疾疫苗奠定了基础。

双抗体夹心ELISA定量检测血清Cap43蛋白方法的建立与评价

目的建立定量检测血清Cap43蛋白表达双抗体夹心ELISA法,并初步探讨血清Cap43蛋白表达水平在肺癌患者与正常人群间有无差异,以及该蛋白表达水平的高低与肺癌组织学分型间的关系。方法建立双抗体夹心ELISA方法对肺癌患者与正常人群血清中Cap43蛋白的含量进行定量检测。结果双抗夹心ELISA包被Ⅰ抗羊抗人NDRG1多克隆抗体(PcAb)、Ⅰ抗兔抗人Cap43PcAb以及辣根酶(HRP)标记的羊抗兔Ⅱ抗的最佳工作浓度分别为1∶750,1∶1200,1∶350,标准蛋白曲线的回归方程为:y=0.53566+0.00046x,R2=0.9939,P<0.0001。应用该方法初步检测结果显示:肺癌组血清标本Cap43蛋白含量明显高于正常对照组(P<0.01),且肺腺癌组病人血清Cap43含量高于肺鳞癌组(P<0.01)。该方法的敏感度(SE)为84.51%,特异度(SP)为35.00%。结论建立了一种敏感度高,重复性好的定量检测血清中Cap43蛋白的双抗体夹心ELISA方法;Cap43蛋白在肺癌患者血清中呈现高表达,且在肺腺癌组病人血清中表达水平高于肺鳞癌组。

尿液水通道蛋白-2双抗体夹心ELISA测定法的建立

目的建立较为稳定的定量检测尿液水通道蛋白-2(AQP2)的酶联免疫吸附测定(ELISA)法。方法人工合成AQP2蛋白C-末端的CELHSPQSLPRGSKA多肽片段,并与KLH联接,制备兔抗AQP2多肽片段的多克隆抗体,用辣根过氧化物酶标记部分抗AQP2抗体IgG。建立检测充血性心力衰竭模型大鼠尿液AQP2的双抗体夹心ELISA法。结果双抗体夹心ELISA法成功建立,灵敏度为15.625 pmol/ml,批内及批间变异系数分别为4.65%和14.05%;用该法定量检测左冠状动脉结扎术后不同梗死面积充血性心力衰竭模型大鼠的尿AQP2浓度,其结果与Western blotting半定量检测结果一致。结论双抗体夹心ELISA法可以较好地定量检测充血性心力衰竭模型大鼠的尿AQP2蛋白浓度且较Western blotting更加简便易行,便于临床推广使用。

猪传染性胃肠炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的快速检测方法,本研究以抗TGEV N蛋白单克隆抗体(MAb)为包被抗体,纯化的抗TGEV N蛋白多克隆抗体(PcAb)为检测抗体建立了TGEV双抗体夹心ELISA方法,优化其反应条件为:抗TGEV N蛋白MAb包被浓度为0.4μg/mL,抗TGEV N蛋白PcAb和酶标二抗的工作浓度分别为3.5μg/mL和1∶5 000,以P/N>2,同时OD490nm≥0.316作为阳性判定标准。该ELISA的重复性变异系数小于10%,与猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪轮状病毒等无交叉反应。对22份临床猪粪便样品RT-PCR的阳性检出率为31.8%;ELISA的阳性检出率为22.7%,二者符合率达81.8%,结果表明本研究建立的双抗体夹心ELISA方法检测TGEV具有较高的特异性和敏感性,可以用于TGEV的病原学检测。

检测外周血MUC1蛋白双抗体夹心ELISA方法的建立及初步应用

目的为提高外周血MUC1蛋白检测的敏感度,建立了抗MUC1多克隆抗体的夹心ELISA试剂盒,并对其进行了初步测试。方法首先成功构建-表达并纯化了MUC1-GST和MUC1-MBP融和蛋白;通过免疫家兔和大鼠,获得抗MUC1血清,经饱和硫酸铵沉淀、Protein A/G纯化及抗GST和MBP抗体吸收的进一步纯化获得纯的家兔抗人及大鼠抗人MUC1多克隆抗体;通过凝血酶溶解MUC1-GST获得MUC1标准品。经不同的筛选确立了以家兔抗人MUC1抗体作为包被抗体、大鼠抗MUC1抗体作为检测抗体的双抗体夹心试剂盒,敏感度可达到0.2 ng/ml。结果对32例乳腺癌患者和20例健康受试者外周血血清中MUC1蛋白水平的检测结果显示,乳腺癌患者的阳性检出率达到53.1%(17例/32例),而健康对照组检出率为0。结论本研究建立的抗MUC1多克隆抗体双夹心试剂盒有望应用于临床诊断。

转基因玉米中膦丝菌素乙酰转移酶双抗体夹心ELISA检测方法的建立

【目的】以单克隆抗体（monoclonal antibody,mAbs）为基础，建立检测膦丝菌素乙酰转移酶（the phosphinothricin acetyltransferase,PAT）的双抗体夹心ELISA方法,为转基因玉米PAT蛋白的检测提供参考。【方法】由P3301质粒扩增出膦丝菌素乙酰转移酶基因（blalaphos resistance gene）bar，并与表达载体pET28a构建重组质粒，诱导表达产生外源性PAT蛋白；以纯化后的PAT蛋白为免疫原，制备mAbs，建立双抗体夹心ELISA方法，并与PCR检测方法进行比较，确定该方法的准确性和可靠性。【结果】应用mAbs 4D5和3E8成功建立了检测PAT蛋白的双抗体夹心ELISA方法，其有效检测范围为3.125～50 ng/mL。采用该夹心ELISA方法对36份已知转基因背景的玉米样品进行了检测，根据阴阳性判定值OD450〉0.210，检测出含PAT蛋白的Bt176阳性样品4份，以bar基因为检测目标利用传统PCR方法也检测出相同的Bt176样品4份，2种检测方法的符合率为100%。【结论】利用建立的双抗体夹心ELISA免疫学检测方法，可以对转基因玉米中的PAT蛋白进行准确、特异、有效的检测。

霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的建立

目的制备霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体（mAb）、建立双抗体夹心ELISA并初步应用于食品检测。方法采用差速离心法提取霍乱弧菌Vc75菌株的鞭毛蛋白，并以此为抗原免疫BALB／c小鼠，抗血清效价达到1：32000时，取脾细胞与生长良好的对数期Sp2／0骨髓瘤细胞进行融合。多次克隆化培养后获得杂交瘤细胞株并制备腹水，纯化后得到抗体。结果获得6株持续、稳定分泌抗霍乱孤菌鞭毛蛋白mAb的杂交瘤细胞株，命名为VcNo．1～VcNo．6，抗体效价高达1：2×10^6。SDS-PAGE结果显示，提取出的鞭毛蛋白相对分子质量（肘，）为44000并且纯度较高。采用VcNo．6抗体建立了霍乱弧菌双抗体夹心ELISA，该方法的检测灵敏度达到10^3CFU／mL菌液，通过采用100株霍乱弧菌和101株非霍乱弧菌进行特异性实验，100株霍乱弧菌呈阳性反应，101株非霍乱弧菌呈阴性反应，结果表明VcNo．6抗体具有良好的特异性。在基质添加试验中，最低检出限为1CFU／g样品。结论成功制备了霍乱弧菌鞭毛蛋白mAb，并将其应用于双抗体夹心ELISA，该方法的检测灵敏度达到10^3CFU／mL菌液，与所测试的非霍乱弧菌没有交叉反应。

抗CPV-2a单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

犬细小病毒病是危害养犬业的重要传染病之一,患病犬难以治愈。单克隆抗体治疗此病效果明显,本文介绍了制备抗CPV-2a单克隆抗体的方法。用纯化的犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)2a型分离株免疫新西兰大白兔和Balb/c小鼠制备抗CPV-2a多克隆抗体及单克隆抗体。经亚克隆得到1H9、2B5、2B7和2C7共4株单抗,Western blotting鉴定单抗的免疫反应性;间接ELISA方法检测单抗的特异性。为了快速对犬细小病毒病作出诊断,建立了CPV-2a双抗夹心ELISA方法。兔多抗作为捕获抗体,鼠单抗作为示踪抗体,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG作为检测系统;捕获抗体和示踪抗体最佳稀释度分别为1:800和1:2000;检测系统最佳稀释度为1:4000。结果表明:所得4株单抗与pET-32a-VP2蛋白发生特异性反应,且与狂犬病毒(RV)、犬温热病毒(CDV)不交叉反应;建立的双抗夹心ELISA方法对病毒的最低检出量为4.375μg/mL,与美国RB试剂盒相比,符合率为95%。单抗制备为犬细小病毒病的治疗奠定了基础;双抗夹心ELISA方法的建立为疑似粪便样本提供了简单、快速和可靠的检测手段。

马流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立一种快速、有效的检测马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)的方法,以EIV中国分离株A/马/新疆/07(H3N8)制备的多克隆抗体为捕获抗体,原核表达的核蛋白(NP)制备的单克隆抗体为检测抗体,在国内首次建立了检测EIV的双抗体夹心ELISA方法。用该检测方法分别检测EIV、马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型和马乙型脑炎病毒阳性样品。结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性;与常规检测EIV的血凝试验相比,其敏感性是后者的2.5～10倍;同时与H7N7亚型EIV有交叉反应。攻毒试验结果表明该方法可有效检测鼻腔分泌物中的EIV。该方法的建立为EIV的检测及早期防控提供了有效工具。

多抗—单抗双抗体夹心ELISA检测血吸虫循环抗原的研究

用抗血吸虫成虫抗原的多克隆抗体为捕捉抗体，抗虫卵抗原的单克隆抗体MG2为标记抗体的双抗体夹心ELISA检测血吸虫循环抗原。对慢性血吸虫病的阳性检出率为95．4％（83／87）；检测正常人血清222份，11例假阳性（50％）；对17例肺吸虫病人和40例其他寄生虫病人的交叉反应率分别为11．7％和2．5％；检测血吸虫病中度流行区人群622名和低度流行区人群1099名，阳性率分别为22．5％和4．6％。对血吸虫病疗效考核的结果表明，治后3月循环抗原阴转率为542％、6月为70．0％、1年为977％，表明本检测系统能区分过去感染和现症感染。

蓝舌病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

用将纯化的蓝舌病病毒(BTV)免疫BALB/c小鼠,分离免疫鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,得到了3株(1F5、4E5和6A1)可以稳定分泌抗BTV VP7特异性单抗的杂交瘤细胞株。用纯化的BTV免疫家兔,按常规方法制备BTV多抗。选用抗VP7单抗(1F5)包被ELISA板,用兔抗BTV多抗作为捕获抗体,建立了BTV双抗体夹心ELISA检测方法。用该ELISA方法分别检测BTV、鹿流行性出血病病毒、水疱性口炎病毒、赤羽病病毒、小反刍兽疫病毒阳性样品。结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性。用该ELISA和RT-PCR同时检测259份临床样品,ELISA的特异性和敏感性分别为99.1%和85.7%,两种方法的符合率为97.7%。该方法的建立为BTV的检测及蓝舌病的流行病学调查提供了有效工具。

柱状黄杆菌双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为快速检测柱状黄杆菌,本研究以纯化的柱状黄杆菌单克隆抗体为捕获抗体,以多克隆抗体为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测法。最佳的方案为用0.08μg/孔纯化的单克隆抗体4℃包被过夜,30g/L牛血清白蛋白37℃封闭90min,多克隆抗体的工作浓度为0.11μg/孔,检测抗原、多克隆抗体、酶标抗体均为37℃作用1h,显色15min后终止反应,当D492nm值≥0.776且P/N≥2.1时判定为阳性。该方法特异性强,与迟钝爱德华氏菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌等水产病原菌均无交叉反应。最低检测剂量为1×103 CFU。本研究首次建立了检测柱状黄杆菌的双抗体夹心ELISA方法,经验证该方法特异性强、灵敏度高。

牛副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立牛副流感病毒3型（BPIV3）双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）检测方法,本研究采用纯化的病毒分别免疫小鼠与家兔,制备鼠抗BPIV3单克隆抗体（MAb）与兔抗BPIV3多克隆抗体（PAb）。以纯化的兔抗BPIV3 PAb作为包被抗体,鼠抗BPIV3 MAb作为检测抗体,采用棋盘滴定法确定DAS-ELISA的最适工作条件。结果显示,纯化的兔抗BPIV3 PAb与鼠抗BPIV3 MAb的效价分别为1：25 600和1∶12 800,均可与BPIV3病毒蛋白特异性结合。建立的DAS-ELISA方法捕获抗体最佳包被浓度为10μg/m L,37℃孵育1 h;检测抗体最佳工作浓度为2.5μg/m L,37℃孵育1 h;TMB室温显色30 min。判定的临界值为0.451。本研究建立的DAS-ELISA方法与牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒均无交叉反应,特异性较强。检测下限为103TCID50。批间和批内变异系数均小于10%,具有良好的重复性。利用该方法和RT-PCR对75份牛鼻拭子临床样品进行检测,两者符合率为94.6%。本研究建立的检测BPIV3的DAS-ELISA方法适用于兽医基层临床样品的大规模检测。

Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

为建立Asia1型口蹄疫(FMD)快速病原学诊断方法,本研究采用纯化的Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合并筛选到一株能够稳定分泌抗Asia l型FMDV单克隆抗体(MAb)2E10。经间接免疫荧光试验特异性鉴定,2E10为FMDV型特异型MAb。其抗体亚类为Ig G1/资,杂交瘤细胞上清和腹水抗体效价分别为1颐256和1颐104,相对亲和力常数为2.5 mol/L。在此基础上,以本实验室前期制备的MAb 2D8为包被抗体,以HRP标记的MAb 2E10为检测抗体建立了检测Asia1型FMDV抗原的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)方法。该方法针对FMDV细胞毒的最低检出量为103TCID50,对O型FMDV、A型FMDV、牛肠道病毒、牛呼肠孤病毒及牛传染性鼻气管炎病毒检测结果均为阴性。本研究建立的Asia1型FMDV DAS-ELISA方法为Asia1型FMD病原学诊断试剂盒的研发奠定了基础。

双抗体夹心ELISA法测定猪α-干扰素的浓度

为了能够准确测定猪血清中猪α-干扰素（Po IFN-α）含量及猪α-干扰素制品的浓度,本研究以制备并经过亲和层析提纯的兔抗猪α-干扰素Ig G多克隆抗体为包被抗体,以制备的鼠抗猪α-干扰素单克隆纯化抗体作为二抗,建立了测定猪α-干扰素浓度的双抗体夹心ELISA法（DAS-ELISA）。通过条件优化,最佳兔抗猪α-干扰素Ig G多克隆纯化抗体包被浓度为12.5μg·m L^-1,最佳鼠抗猪α-干扰素单克隆纯化抗体作用浓度为6.25μg·m L^-1,利用本实验室制备的已知浓度猪α-干扰素标准蛋白建立标准曲线,确定该方法检测猪α-干扰素浓度范围为0.0781-2.50μg·m L^-1。与Lowry法、冻干称量法测定猪α-干扰素浓度相比较,3种方法检测结果无显著差异,但所建立的双抗体夹心ELISA法能够检测血清中猪α-干扰素浓度,且方法简便。