miR-451a和miR-21-5p双重实时荧光定量PCR检测体系的建立及应用

目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率,本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR(real time fluorogenic quantitative PCR)检测体系,并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于miRNA双重检验的相关引物及探针并优化实验体系组分,建立基于TaqMan技术的miRNA双重实时荧光定量PCR检测体系并验证其特异性、灵敏度和可重复性;使用此检测体系对58份不同体液样本中的miR-451a与miR-21-5p进行检测,并借助miR-451a与miR-21-5p的比值鉴定法评估该体系的体液鉴别能力;使用该检测体系样本数据确定的最佳截断值对模拟案件样本进行鉴别。结果优化的检测体系能够实现对血液与非血液、月经血与外周血的100%区分,同时可以实现对模拟案件样本的准确鉴别。结论该双重实时荧光定量PCR检测体系将时间和材料成本均缩短至原来的一半,为后续建立更多重的实时荧光定量PCR检测体系并应用于体液鉴别打下了基础。

羊种布氏杆菌M5-90△26基因缺失疫苗双重实时荧光定量PCR方法的建立

为了寻找一种能够鉴别布氏杆菌M5-90△26疫苗株与其他布氏杆菌菌株的双重实时荧光定量PCR检测方法。针对布氏杆菌菌株的16S rRNA和Bp26基因,各设计一套引物和探针,并优化反应体系和反应程序。以布氏杆菌A19、S2、M5-90和M5-90△26四种疫苗株以及大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、沙门氏菌、链球菌进行双重荧光定量PCR扩增,评价该方法的特异性。克隆构建PCR_16S rRNA_Bp26标准品,通过倍比稀释进行双重荧光定量PCR扩增,评价该方法的灵敏度。使用该方法与虎红平板凝集试验、试管凝集试验进行检测结果对比,评价该方法的可行性。结果显示,本方法特异性好,布氏杆菌A19、S2、M5-90三种疫苗株均同时出现Bp26基因和16S rRNA基因的扩增,布氏杆菌M5-90△26疫苗株只出现16S rRNA基因的扩增,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、沙门氏菌、链球菌均未出现扩增曲线。该方法建立的16S rRNA基因序列扩增通道和Bp26基因序列扩增通道对标准品的最低检测限均达5 copies/μL。该方法对临床样本的检测结果与虎红平板凝集试验、试管凝集试验检测结果符合率较高,说明建立的羊种布氏杆菌M5-90△26基因缺失疫苗双重实时荧光定量PCR检测方法可用于临床的检测,为鉴别布氏杆菌M5-90△26疫苗株免疫与布氏杆菌野毒株感染提供一种可行的检测方法。

空肠弯曲菌和沙门菌双重实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种空肠弯曲菌和沙门菌的双重实时荧光定量PCR检测方法,根据空肠弯曲菌的保守基因hipO和沙门菌的保守基因invA分别设计合成引物和TaqMan探针,分别使用FAM、JOE作为探针报告基团,TAMRA作为探针淬灭基团。优化反应体系及条件,建立适用于检测食品中空肠弯曲菌和沙门菌的双重实时荧光定量PCR方法。结果显示,该检测方法特异性强,灵敏度高,空肠弯曲菌检测限可达10CFU/mL,沙门菌检测限达230CFU/mL。表明建立的双重实时荧光定量PCR可为实现食品中空肠弯曲菌和沙门菌的同时检测提供新方法。

双重实时荧光定量PCR检测人维生素D受体的方法学构建

目的 建立单管检测人维生素D受体（VDR）及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因的双重实时荧光定量聚合酶链反应（dual real-time PCR）的方法。方法 以GAPDH基因为内参,采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物及Taq Man探针,进行PCR扩增检测VDR基因。将VDR及GAPDH扩增产物片段纯化后克隆构建成重组质粒,作为定量检测基因表达的标准品,并用于分析该方法的灵敏度和重复性。结果 PCR扩增产物经测序分析证实为VDR及GAPDH特异性片段;该方法检测VDR与GAPDH灵敏度达40拷贝/μL;线性范围为4.00×10~1~4.00×10~5拷贝/μL;决定系数R2分别为0.998、0.999;扩增效率E分别为96.10%、85.15%;批内变异系数（CV）分别为0.09%~1.21%、0.35%~0.88%;批间CV分别为0.17%~0.51%、0.51%~2.46%。结论 成功建立了单管检测人VDR及GAPDH的双重实时荧光定量PCR方法,且该方法特异性好、灵敏度高、可快速高通量检测VDR的相对表达量,有效缩短时间,减小实验误差。

PDCoV与TGEV双重实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

试验旨在建立快捷、高效而准确的鉴别诊断猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)与传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的双重实时荧光定量PCR方法。通过绘制双重实时荧光定量PCR的标准曲线,检验该方法的特异性、敏感性和重复性,并对临床样品进行检测。结果显示,双重实时荧光定量PCR方法的循环阈值与PDCoV和TGEV质粒拷贝数的对数之间存在良好的线性关系,且对应的相关系数分别为R2(P)=0.9994和R2(T)=0.996;能特异性地检测PDCoV和TGEV,而与PEDV、PRV、PRRSV、CSFV和RV无交叉反应,具有较强的特异性;检验PDCoV与TGEV质粒标准品的最低检测限度分别达到2和20拷贝/μL,且分别比常规RT-PCR高1000和100倍,具有较高的敏感度;PDCoV与TGEV的批内和批间重复性检测的Ct均值基本相同,且变异系数(CV)均<2%,具有较好的重复性。用该方法对114份仔猪腹泻样品检测结果显示,PDCoV和TGEV的阳性率分别为5.6%(6/114)和8.8%(10/114),混合感染检出率为4.6%(5/114),比常规RT-PCR具有更高的检出率和敏感性。结果表明,本试验建立的双重实时荧光定量PCR方法具有特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好等优点,适用于病毒早期诊断和批量临床样品检测,为疾病防控、流行病学调查及相关性研究提供了技术支持及数据参考。

人血浆DNA双重实时荧光定量PCR检测法的建立

目的建立带有内参照的双重实时荧光定量PCR方法检测血浆DNA含量。方法构建重组质粒DNA作为内参照物,采用共用下游引物的双重实时荧光定量PCR技术同步扩增人看家基因β-actin和重组质粒载体中人工合成DNA序列,定量检测健康成年人血浆DNA含量。结果本法能在同一个反应管中对目的基因和内参照进行同步扩增,两者的扩增无相互干扰,特异性好;重组质粒DNA的平均扩增效率达90%,β-actin基因的平均扩增效率接近100%;本法批内变异系数(CV)11%,批间CV17%。结论成功建立含有内参照的双重实时荧光定量PCR方法,可对血浆DNA进行定量检测。

应用双重实时荧光定量PCR方法检测鸡马立克氏病血清1型病毒

本研究建立了鸡马立克氏病血清1型病毒(MDV1)绝对定量检测方法。研究中选择MDV1特有的Meq基因的一段保守序列作为检测对象,将其克隆到质粒载体中,作为阳性标准品;同时将管家基因-鸡卵铁转蛋白(Ovo)特异性基因片段克隆到质粒载体上作为内参照的标准品。经荧光定量PCR(FQ-PCR)法扩增获得MDV1的FQ-PCR两条标准曲线,建立了MDV1双重FQ-PCR检测方法。应用该方法绝对定量检测了实验攻毒鸡及吉林省某地发病鸡只的羽髓、淋巴细胞等组织样本中单位细胞病毒拷贝数,并与琼脂扩散(AGP)、常规PCR等检测方法进行比较。结果表明,不论实验攻毒鸡还是自然发病鸡,羽髓中病毒富含量均高于其它组织,每百万宿主细胞内病毒含量为107～108拷贝;FQ-PCR检测MD发病鸡只的阳性率高于AGP,达100%;该方法的灵敏度比常规PCR检测高10～100倍,在单位细胞内可灵敏地检测到2.78个拷贝的病毒。该方法可以在不同的样品中有效的绝对定量检测MDV1。

双重实时荧光定量PCR技术检测中药制剂中沙门氏菌和大肠埃希菌

目的:建立双重实时荧光定量PCR(multiplex quantitative real-time PCR,multiplex qPCR)快速检测中药制剂中沙门氏菌和大肠埃希菌2种常见控制菌的方法。方法:筛选两种目标菌株的特异性引物与探针,扩增沙门氏菌的invA基因和大肠埃希菌的uidA基因,优化反应体系,建立双重荧光定量PCR方法。结果:两对引物探针对沙门氏菌和大肠埃希菌均有较好地扩增效率,人工污染中药制剂中沙门氏菌的检出限为101 CFU·mL^(-1),大肠埃希菌的检出限为101 CFU·mL^(-1)。结论:本研究建立的双重实时荧光定量PCR方法具有特异性强、重复性好,灵敏度高等特点、适用于中药制剂中沙门氏菌和大肠埃希菌的快速检测。

伪狂犬病病毒TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为建立快速、特异、灵敏的鉴别伪狂犬病病毒(PRV)野毒株和疫苗株的方法,本试验基于PRV gB和gE基因保守区域序列,设计了2对特异性的引物和探针,探针标记不同发光基团,以区分野毒株和疫苗株。通过对引物的筛选和反应条件的优化,建立了可鉴别PRV野毒株和疫苗株的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性和干扰性等进行评估。结果显示,该方法能同时特异性地检测出PRV野毒株和疫苗株,而与PPV、PCV2、PRRSV、CFSV、JEV等无交叉反应;该方法灵敏性高,对PRV gE和gB基因最低检测量分别为27.1 copies/μL和2.74 copies/μL;该方法重复性好,变异系数小于1%;用该方法对18份临床样本进行PRV gB和gE基因检测,且与普通PCR方法相比,符合率高达100%。结果表明,本试验建立的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法可用于临床样本中PRV野毒株和疫苗株的鉴别检测,为猪伪狂犬病防制和净化提供了一种有效的技术手段。

橙汁饮料中橙与橘成分双重实时荧光定量PCR检测技术

目的:建立双重实时荧光定量PCR检测橙汁饮料中橙与橘成分的方法。方法:通过设计和筛选橙、橘成分的引物和探针,检测水果寻找橙和橘的荧光扩增规律,利用橙和橘在FAM/VIC两个荧光通道上的比值差异来判定橙、橘成分。采用模拟橙汁掺杂柑橘汁试验验证方法检测的最低掺杂比例,对市售橙汁饮料进行检验来验证方法可行性。结果:纯橙水果在FAM和VIC两通道均有荧光扩增曲线,FAM/VIC通道荧光比值在0.5±0.2的范围内,而纯橘水果仅在FAM通道有很强的荧光扩增曲线。模拟掺杂试验中,可以检测出橙汁中掺有10%及以上的柑橘汁。结论:该方法能够检测橙汁饮料中的橙和橘成分,可用于市售橙汁饮料的鉴伪。

BVDV 1型和2型TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)和2型(BVDV2)的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank上收录的95株BVDV1和BVDV25′-非编码区设计特异性引物,构建含有BVDV1和BVDV2目的片段的阳性质粒,优化反应条件,构建标准曲线,进行双重实时荧光定量PCR方法的特异性、敏感性和重复性检测,并利用建立的实时荧光定量PCR检测方法对采自吉林省的临床样品进行检测。【结果】建立的双重实时荧光定量PCR方法最适退火温度为57.0℃,最适引物浓度为0.5μmol/L,最适探针浓度为0.3μmol/L,BVDV1和BVDV2型的标准曲线分别为:Y=-3.54X+37.36(R^(2)=0.990)和Y=-3.18X+35.95(R^(2)=0.997)。对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)和牛副流感病毒3型(BPIV3)均无特异性扩增,批内和批间变异系数均<3%,检测下限为10拷贝/μL。临床样品检测结果显示,总体阳性率为23.1%(36/156),其中BVDV1阳性率为17.9%(28/156),BVDV2阳性率为5.1%(8/156)。【结论】本研究建立了可同时快速、准确鉴别BVDV1和BVDV2的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法,为BVDV的防控与净化提供技术支撑。

BVDV和IBRV双重实时荧光定量PCR检测方法建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′端非编码区和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因保守区基因序列,参考文献分别合成了2对特异性引物和探针。利用构建的包含BVDV和IBRV目标基因片段的阳性质粒,对退火温度、引物和探针的浓度以及反应条件进行了优化,构建了实时荧光定量PCR(qPCR)标准曲线,并对双重qPCR方法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。试验结果显示,qPCR最适退火温度为54.0℃,BVDV引物浓度为0.2μmol/L,IBRV引物浓度为0.3μmol/L,BVDV探针浓度0.2μmol/L,IBRV探针浓度为0.1μmol/L。BVDV的RNA最低检测限为100拷贝/μL,IBRV的DNA最低检测限为1拷贝/μL,并具有良好的特异性和重复性,为BVDV和IBRV的同时、快速、定量检测提供了有效的方法。

非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型的双重实时荧光定量PCR检测方法建立

随着基因Ⅰ型非洲猪瘟(GenotypeⅠASFV)在我国开始流行,使我国对ASF的诊断、预防和控制更具挑战性。本研究使用中国动物疾病预防控制中心(CADC)推荐使用的B646L引物与探针,结合针对GenotypeⅠASFV EP402R基因保守特异性区域设计引物与探针,建立了一种在诊断ASF的同时可对ASFV进行GenotypeⅠASFV鉴别的快速检测方法,并对其灵敏性、特异性进行检测。结果显示,该方法具有良好的灵敏性以及特异性,可有效用于ASFV的临床诊断以及GenotypeⅠASFV的监测。

猪圆环病毒3型和4型TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速检测猪圆环病毒3型(PCV3)和4型(PCV4)的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法,根据Gen Bank已登录的PCV3和PCV4基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,经优化各反应条件,构建标准曲线,分析其敏感性、特异性和重复性,并利用建立的荧光定量PCR方法对采自安徽省的临床样品进行检测,与普通PCR方法进行一致性评价。结果显示,PCV3的标准曲线为Y=–3.534 6 logX+41.11(R^(2)=1.00),PCV4的标准曲线为Y=–3.382 5 logX+40.67(R^(2)=1.00)。PCV3和PCV4的检测限分别为49.5和27.1 copies·μL^(-1)。对猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)无特异性扩增,组内和组间变异系数均<1%。临床样品检测结果显示,PCV3阳性检出率为40.8%,PCV4阳性检出率为20.4%,混合感染率为19.0%。建立了灵敏、特异,可同时快速、准确鉴别PCV3和PCV4的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法,为PCV3和PCV4的检测和监测提供技术支撑。

双重实时荧光定量PCR检测转基因植物常用调控元件的适用性研究

目的建立一种双重实时荧光定量PCR检测转基因植物中常用调控元件pCaMV35S和tNOS。方法通过扩增多个植物DNA来测定所建立的反应系统的特异性,将转基因棉花的模板DNA稀释5个梯度,检测此方法检出限(limit of detection,LOD),建立标准曲线判断该方法的定量能力,通过相对模拟掺假试验测定方法的灵敏度。结果特异性试验的检测结果显示此系统具备较强的特异性,能够区分含有上述两种调控元件的转基因植物和非转基因植物。此方法中,pCaMV35S基因的检测限为1 ng,tNOS基因的检测限为10 ng。依托此方法建立的标准曲线的扩增效率分别为96%和87%,r2均大于0.99,方法具有较好地定量能力,相对灵敏度达到1%,满足混合样品中转基因成分的检测要求。结论建立的双重实时荧光PCR方法表现出较强的特异性和较高的灵敏度,有高通量、低成本以及定量检测的能力。

双重实时荧光定量PCR法检测腹泻中病毒的价值

目的研究腹泻患者粪便中诺如病毒(GⅠ+GⅡ)行双重实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法检测的价值。方法研究2019年1月-2020年3月我市人民医院送检的腹泻患者的粪便标本共400份,均接受双重实时荧光定量PCR法检测,GⅠ型诺如病毒特异性采用Taqman探针的5’端标记为FAM,GⅡ型诺如病毒特异性采用Taqman探针的5’端标记为VIC,立于同一反应管中,同时检测、分型诺如病毒,分析最终的病毒检出率。结果GⅠ型诺如病毒感染有15例,检出率是3.75%;GⅡ型诺如病毒感染有59例,检出率是14.75%;GⅠ型、GⅡ型诺如病毒混合感染有6例,检出率是1.50%,诺如病毒的总检出率是20.00%。结论腹泻患者的粪便采用双重实时荧光定量PCR法检测具有较高的临床应用价值。

基于非洲猪瘟病毒B646 L和I177L基因双重实时荧光定量PCR鉴别ASFV-G-ΔI177 L疫苗株的检测方法

为建立一种可鉴别非洲猪瘟病毒(ASFV)野毒株与ASFV-G-ΔI177L(I177L基因缺失株)疫苗株的实时荧光定量PCR检测方法,本试验针对非洲猪瘟病毒B646L与I177L两种基因保守性高的区域,分别设计了引物和探针,通过引物、探针最佳工作浓度筛选和退火温度优化,建立了一种双重实时荧光定量PCR核酸检测方法,并验证该方法的敏感性、特异性、重复性。结果显示,该检测方法建立的标准曲线线性关系良好,R2均>0.99;对pUC57-B646L和pUC57-I177L质粒标准品最低检出限均为10 copies/μL;与其他常见猪病病原无交叉反应,特异性强;批内变异系数为0.11%~1.39%,批间变异系数为0.21%~0.96%,均小于1.4%,重复性和稳定性良好。结果表明,本试验成功建立了一种性能良好的非洲猪瘟病毒B646L与I177L基因双重实时荧光定量PCR核酸检测方法,可为临床上非洲猪瘟病毒野毒株和ASFV-G-ΔI177L疫苗株的检测和鉴别提供技术支撑。

双重实时荧光定量PCR法检测腹泻患者粪便中诺如病毒(GⅠ+GⅡ)的研究

目的建立同时检测GⅠ和GⅡ型诺如病毒的双重实时荧光定量PCR方法,并在临床检验中得到应用。方法本研究采用了双重实时荧光定量PCR法,对诺如病毒GⅠ型病毒的特异性Taqman探针的5’端标记了FAM和对诺如病毒GⅡ型病毒的特异性Taqman探针的5’端标记了JOE,从而实现了在同一反应管中对诺如病毒同时进行检测和分型。2015年采集两所哨点医院符合要求的门诊腹泻患者的380份粪便标本运用此方法进行了检测和分型。结果诺如病毒GⅠ型和诺如病毒GⅡ型分别在FAM检测通道和JOE检测通道出现相应的荧光扩增曲线;380例符合定义的临床标本中诺如病毒GⅠ型的检出率为3.68%,诺如病毒GⅡ型的检出率为14.74%,诺如病毒GⅠ型和诺如病毒GⅡ型混合感染的检出率为1.58%,全年诺如病毒的总检出率为20.00%。结论双重实时荧光定量PCR法具有重复性好、特异性强、时效性好和简单易操作的特点,具有极大的应用和推广价值。

鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。

绿豆象实时荧光定量PCR内参基因的筛选

绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响。本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献报道,筛选出8个候选内参基因(β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、AK、GAPDH、RPL40、Hsc70、eEF1-α),采用qRT-PCR技术分析在绿豆象不同发育阶段(幼虫、蛹、雌雄成虫)以及成虫不同组织中的(触角、头、腹、足、翅)各候选基因的表达量;利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线网站RefFinder并结合△Ct值评估8个候选内参基因的稳定性。结果显示,在绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中,各候选内参基因Ct值和跨度均不同,表明各候选内参基因表达量存在差异。不同算法综合比较内参基因稳定性以及GeNorm软件最佳内参基因数目的分析显示,在绿豆象虫不同发育阶段中推荐采用β-Act、β-Tub作为内参基因,而在绿豆象成虫不同组织中推荐采用β-Tub、α-Tub作为内参基因,这有利于在绿豆象的基因表达研究中取得更为可靠、准确的数据。