血清长链非编码RNA肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1水平与钙化性主动脉瓣狭窄病人左心室功能的相关性研究

目的 分析血清长链非编码RNA(lncRNA)肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1(AFAP1-AS1)表达水平与钙化性主动脉瓣狭窄(CAS)病人左心室收缩及舒张功能的相关性。方法 于2020年1月至2021年12月,选取中国中医科学院广安门医院就诊的CAS病人129例作为CAS组[左心室射血分数(LVEF)≥50%],同期该院健康志愿者130例作为对照组。收集病人人口学资料、超声及实验室生化指标,检测血清lncRNA AFAP1-AS1表达。受试者操作特征曲线(ROC曲线)分析血清lncRNA AFAP1-AS1诊断CAS效能。结果 对照组血清lncRNA AFAP1-AS1表达水平(1.15±0.18)低于CAS组(1.58±0.30)(P<0.001)。轻度狭窄者血清lncRNA AFAP1-AS1表达水平(1.37±0.26)低于中、重度狭窄者,而中度狭窄者lncRNA AFAP1-AS1表达水平(1.59±0.30)低于重度狭窄者(1.79±0.34)(P<0.001)。ROC结果显示,血清lncRNA AFAP1-AS1诊断CAS、重度狭窄的曲线下面积分别为0.86[95%CI:(0.82,0.91)]、0.88[95%CI:(0.82,0.94)]。CAS组AVA水平低于对照组(P<0.001),左室舒张末期内径(LVEDD)、左室舒张末期容积(LVEDV)、室间隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LVPWT)、左房前后径(LAD)、主动脉瓣平均压差(PGmean)、主动脉瓣峰值流速(Vmax)水平高于对照组(均P<0.001)。相关性分析显示,血清lncRNA AFAP1-AS1与LVEDD、Vmax、二尖瓣口舒张早期血流速度峰值(E峰)、二尖瓣口舒张晚期血流速度峰值(A峰)、LVEDV、PGmean、LVESD呈正相关(r=0.60、0.66、0.72、0.68、0.56、0.57、0.50,均P<0.001),与LVEF、AVA呈负相关(r=-0.78、-0.62,均P<0.001)。结论 CAS病人血清lncRNA AFAP1-AS1表达水平升高,与CAS病情严重程度以及左心室舒张、收缩功能有关,并可作为无创血清标志物辅助临床诊断CAS。

长链非编码RNA烟酰胺核苷酸转氢酶-反义RNA1在肺癌发生发展中的作用研究进展

肺癌是世界上致死率最高的恶性肿瘤,其主要治疗手段为外科手术、化学治疗、放射治疗、靶向治疗等。烟酰胺核苷酸转氢酶-反义RNA1(NNT-AS1)作为新发现的长链非编码RNA(lncRNA)分子,通过miR-3666/E2F2、miR-22-3p/YAP1、miR-22/FOXM1、miR-1236-3p/ATG7、miR-129-5p、丝裂原活化蛋白激酶/Slug等信号通路,与肺癌细胞的凋亡、增殖、迁移、侵袭有关,还参与介导肺癌细胞的顺铂耐药性,与肺癌的不良生存结局和较差的临床病理特征显著相关,可以为肺癌提供新的治疗靶点及预后标志物。本文就lncRNA NNT-AS1在肺癌发生发展中的作用研究进展进行综述。

长链非编码RNA ZEB1反义RNA1通过靶向微小RNA-224调控淋巴瘤细胞增殖、侵袭、迁移的分子机制研究

目的探讨长链非编码RNA ZEB1反义RNA1(LncRNA ZEB1-AS1)通过靶向微小RNA(miR)-224调控淋巴瘤细胞增殖、侵袭、迁移的分子机制。方法体外培养淋巴瘤细胞系Raji,分别转染si-NC、si-ZEB1-AS1、miR-NC、miR-224 mimics、si-ZEB1-AS1+anti-miR-NC、si-ZEB1-AS1+anti-miR-224。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)评估LncRNA ZEB1-AS1和miR-224在淋巴瘤细胞中的表达量;采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活力;采用Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;通过双荧光素酶报告实验确定LncRNA ZEB1-AS1对miR-224的调控作用;采用Western blot检测细胞周期素D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白的表达水平。结果与对照组比较,淋巴瘤组LncRNA ZEB1-AS1水平升高,miR-224表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与si-NC组比较,si-ZEB1-AS1组中LncRNA ZEB1-AS1的表达水平、光密度(OD)值、迁移细胞和侵袭细胞数量,以及CyclinD1、MMP-2和MMP-9表达水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-224组miR-224表达水平提高,而OD值、细胞迁移和侵袭数量以及CyclinD1、MMP-2和MMP-9表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。上调miR-224水平可降低WT-ZEB1-AS1的荧光素酶活性,但不影响MUT-ZEB1-AS1的荧光素酶活性。与pcDNA-NC组相比,pcDNA-ZEB1-AS1组miR-224表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);与si-NC组比较,si-ZEB1-AS1组miR-224表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与si-ZEB1-AS1+anti-miR-NC组比较,si-ZEB1-AS1+anti-miR-224组的OD值、迁移和侵袭数量,以及CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平提高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论抑制LncRNA ZEB1-AS1从而靶向上调miR-224的表达,能够有效降低淋巴瘤细胞的增殖、侵袭及迁移能力。

基于长链非编码RNA HOX转录反义RNA探讨次乌头原碱对人肝癌SK-Hep-1细胞自噬的影响实验研究

目的:基于长链非编码RNA(lncRNA)HOX转录反义RNA(HOTAIR)探讨次乌头原碱对人肝癌SK-Hep-1细胞自噬的影响。方法:取对数期人肝癌SK-Hep-1细胞,将lncRNA HOTAIR抑制质粒lncRNA HOTAIR-shRNA转染至SK-Hep-1细胞,随机分为转染组和联合组,转染组常规培养,联合组加入次乌头原碱(终浓度200μmol/L)。另取SK-Hep-1细胞随机分为空白组和次乌头原碱组,空白组常规培养,次乌头原碱组加入次乌头原碱(终浓度200μmol/L)。48 h后收集细胞,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测各组lncRNA HOTAIR表达量;流式细胞仪检测各组凋亡率;绿色荧光蛋白(GFP)-微管相关蛋白1轻链3(LC3)转染检测各组自噬情况;免疫印迹法检测细胞Beclin1、P62、微管相关蛋白1轻链3Ⅰ(LC3Ⅰ)蛋白相对表达量。结果:与空白组比较,次乌头原碱组lncRNA HOTAIR表达量升高,转染组lncRNA HOTAIR表达量降低(均P<0.05)。与次乌头原碱组比较,联合组lncRNA HOTAIR表达量降低(P<0.05)。与转染组比较,联合组lncRNA HOTAIR表达量升高(P<0.05)。与空白组比较,次乌头原碱组细胞凋亡率及Beclin1、P62、LC3Ⅰ蛋白相对表达量升高,GFP-LC3斑点数增加(均P<0.05);转染组细胞凋亡率及Beclin1、P62、LC3Ⅰ蛋白表达量降低,GFP-LC3斑点数减少(均P<0.05)。与次乌头原碱组比较,联合组细胞凋亡率及Beclin1、P62、LC3Ⅰ蛋白相对表达量降低,GFP-LC3斑点数减少(均P<0.05)。与转染组比较,联合组细胞凋亡率及Beclin1、P62、LC3Ⅰ蛋白相对表达量升高,GFP-LC3斑点数增加(均P<0.05)。结论:次乌头原碱可能通过诱导人肝癌SK-Hep-1细胞过度自噬而促进细胞凋亡,其作用机制可能与上调LncRNA HOTAIR表达有关。

术前血清V-set和免疫球蛋白结构域4以及长链非编码核糖核酸SBF2反义RNA1与肾结石患者经皮肾镜取石术后急性肾损伤的关系

目的探讨术前血清V-set和免疫球蛋白结构域4(VSIG4)以及长链非编码核糖核酸(LncRNA)SBF2反义RNA1(SBF2-AS1)与肾结石患者经皮肾镜取石术后急性肾损伤(AKI)的关系。方法选择2020年1月—2022年12月本院收治的109例肾结石患者为研究对象。术前检测患者血清VSIG4水平以及LncRNA SBF2-AS1表达,术后记录AKI发生情况。采用多因素Logistic回归模型分析肾结石患者经皮肾镜取石术后发生AKI的影响因素;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析VSIG4、LncRNA SBF2-AS1预测肾结石患者经皮肾镜取石术后发生AKI的价值。结果本研究中,术后发生AKI者16例。AKI组血清VSIG4水平低于非AKI组,LncRNA SBF2-AS1表达高于非AKI组,差异均有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,术前高尿酸水平、术前高LncRNA SBF2-AS1表达、较长的手术时间、术中低血压是肾结石患者经皮肾镜取石术后发生AKI的危险因素(P<0.05),术前高VSIG4水平是保护因素(P<0.05)。术前血清VSIG4、LncRNA SBF2-AS1水平预测肾结石患者经皮肾镜术后发生AKI的曲线下面积分别为0.854、0.705,二者联合预测的曲线下面积为0.948,大于各指标单独预测(Z=1.995、2.958,P<0.05)。结论肾结石患者术前血清VSIG4水平降低、LncRNA SBF2-AS1表达增高与经皮肾镜取石术后AKI的发生有关,联合检测术前VSIG4、LncRNA SBF2-AS1可预测术后AKI的发生风险。

长链非编码RNA F-box富含亮氨酸的重复蛋白19反义RNA 1调节微小RNA-342-3p/自噬相关蛋白10轴对结直肠癌细胞增殖、迁移和奥沙利铂耐药性的影响实验研究

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA) F-box富含亮氨酸的重复蛋白19反义RNA 1(FBXL19-AS1)调节微小RNA(miR)-342-3p/自噬相关蛋白10(ATG10)轴对结直肠癌(CRC)细胞增殖、迁移和奥沙利铂耐药性的影响。方法:实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测组织及正常肠上皮细胞(NCM460)、人CRC细胞系RKO、HCT-8细胞及HCT-8/L-OHP细胞中FBXL19-AS1、miR-342-3p、ATG10 mRNA表达水平。将HCT-8细胞分为shFBXL19-AS1组、shRNA组、shFBXL19-AS1+inhibitor NC组和shFBXL19-AS1+miR-342-3p inhibitor组,并以未转染的细胞为空白组。将HCT-8/L-OHP细胞分为L-OHP+shFBXL19-AS1组、L-OHP+shRNA组、L-OHP+shFBXL19-AS1+inhibitor NC组和L-OHP+shFBXL19-AS1+miR-342-3p inhibitor组,并以未转染的细胞为空白组。细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测HCT-8、HCT-8/L-OHP细胞增殖及其耐药性。划痕实验检测细胞迁移能力。免疫印迹法(Western blot)检测P-糖蛋白(P-gp)、增殖蛋白(Ki-67)、迁移侵袭增强子因子1(MIEN1)、ATG10蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验分析miR-342-3p与FBXL19-AS1、ATG10靶向关系。结果:FBXL19-AS1、ATG10 mRNA表达在HCT-8/L-OHP细胞及CRC组织中增加,miR-342-3p表达则降低(均P<0.05)。shFBXL19-AS1组细胞增殖、细胞迁移、FBXL19-AS1和ATG10 mRNA表达以及Ki-67、MIEN1、ATG10蛋白表达较shRNA组和空白组降低,miR-342-3p表达则增加(均P<0.05)。shFBXL19-AS1+miR-342-3p inhibitor组细胞增殖、细胞迁移、ATG10 mRNA以及Ki-67、MIEN1、ATG10蛋白表达较shFBXL19-AS1+inhibitor NC组增加,miR-342-3p表达则降低(均P<0.05)。L-OHP+shFBXL19-AS1组细胞增殖、细胞迁移、细胞耐药性及P-gp、Ki-67、MIEN1、ATG10蛋白表达较L-OHP+shRNA组和空白组降低(均P<0.05)。L-OHP+shFBXL19-AS1+miR-342-3p inhibitor组细胞增殖、细胞迁移、细胞耐药性及P-gp、Ki-67、MIEN1、ATG10蛋白表达较L-OHP+shFBXL19-AS1+inhibitor NC组增加(均P<0.05)。结论:干扰lncRNA FBXL19-AS1通过上调miR-342-3p/ATG10轴抑制CRC细胞的增殖、迁移,改善奥沙利铂耐药性。

肺腺癌长链非编码RNA表皮生长因子受体-反义RNA 1的表达水平与表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂治疗有效率及预后的关系

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)表皮生长因子受体(EGFR)-反义RNA 1(AS1)的表达水平与EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗有效率及预后的关系。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测并比较80例肺腺癌患者的肺腺癌组织和癌旁组织、3组转染PC9细胞(control组、pcDNA3.1-NC组、pcDNA3.1-EGFR-AS1组)、PC9细胞和PC9/GR细胞经吉非替尼培养后lncRNA EGFR-AS1的表达水平,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和细胞划痕实验分别检测3组转染PC9细胞的活力和迁移能力。以lncRNA EGFR-AS1表达水平的中位数为分界将肺腺癌患者分为lncRNA EGFR-AS1高表达组和低表达组,比较lncRNA EGFR-AS1高、低表达组患者EGFR-TKI治疗的效果及临床特征、生存情况。采用Cox回归法分析肺腺癌患者预后的影响因素。结果肺腺癌组织和经吉非替尼培养后PC9/GR细胞中lncRNA EGFR-AS1表达水平分别高于癌旁组织和PC9细胞,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。lncRNA EGFR-AS1低表达组患者EGFR-TKI治疗总有效率和中位生存时间均明显高于lncRNA EGFR-AS1高表达组患者,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。lncRNA EGFR-AS1高、低表达组患者TNM分期、分化程度、淋巴结转移情况、美国东部肿瘤协作组(ECOG)体力状况评分比较,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。多因素Cox分析结果显示,TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期、lncRNA EGFR-AS1高表达均是肺腺癌患者预后不良的危险因素(P﹤0.05)。pcDNA3.1-EGFR-AS1组PC9细胞中lncRNA EGFR-AS1表达水平、细胞存活率及细胞迁移率均高于control组和pcDNA3.1-NC组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。结论lncRNA EGFR-AS1参与肺腺癌的发生发展,并且影响患者的预后和EGFR-TKI治疗的有效率。

血清miRNA-199a-5p、α-1-B-糖蛋白反义RNA1水平与脑胶质瘤患者术后复发的关系

目的检测脑胶质瘤患者的血清微小RNA(miRNA)-199a-5p、α-1-B-糖蛋白反义RNA1(A1BG-AS1)水平,并分析其与患者术后复发的关系。方法选取94例接受手术治疗的脑胶质瘤患者和84例健康体检者,分别作为研究组和对照组。术后所有脑胶质瘤患者均随访2年,依据是否复发分为复发组(n=71)和非复发组(n=23)。采用聚合酶链反应(PCR)检测血清miRNA-199a-5p、A1BG-AS1水平,比较研究组和对照组、复发组和非复发组的血清miRNA-199a-5p、A1BG-AS1水平。采用Spearman相关分析法分析血清miRNA-199a-5p、A1BG-AS1水平与脑胶质瘤患者术后复发的相关性。绘制受试者工作特征(ROC)曲线,计算曲线下面积(AUC),分析血清miRNA-199a-5p、A1BG-AS1单独及联合检测对脑胶质瘤患者术后复发的评估价值。结果研究组患者血清miRNA-199a-5p水平明显低于对照组,血清A1BG-AS1水平明显高于对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。复发组患者血清miRNA-199a-5p水平低于非复发组,血清A1BG-AS1水平高于非复发组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。血清miRNA-199a-5p水平与脑胶质瘤患者术后复发呈负相关(r=-0.382,P﹤0.05),血清A1BG-AS1水平与脑胶质瘤患者术后复发呈正相关(r=0.423,P﹤0.05)。ROC曲线显示,血清miRNA-199a-5p、A1BG-AS1联合检测评估脑胶质瘤患者术后复发的AUC和灵敏度均高于二者单独检测。结论脑胶质瘤患者血清miRNA-199a-5p水平降低,血清A1BG-AS1水平升高,且其表达水平与脑胶质瘤患者术后复发有关,联合检测对术后复发具有较好的评估价值。

长链非编码RNA动力蛋白3反链/反义RNA在肿瘤中的研究进展

动力蛋白3反链/反义RNA(DNM3OS)作为一种重要的长链非编码RNA(lncRNA),在肿瘤的发生、发展过程中发挥关键作用。lncRNA DNM3OS参与调控多种分子过程,如染色质重塑、转录、转录后修饰或信号转导等。lncRNA DNM3OS的异常表达与多种肿瘤的发生、发展密切相关。本文对lncRNA DNM3OS在肿瘤中的研究进展进行综述,总结DNM3OS在肿瘤中作用机制的研究成果,并强调其作为新型肿瘤治疗靶点的潜力,有望为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路和方法。

茄红素-β-环化酶反义RNA基因对烟草的遗传转化

采用农杆菌介导的叶盘法 ,用胡萝卜茄红素 -β-环化酶反义 RNA基因对烟草 SRI野生类型种及Xanthi品种进行了遗传转化。 GU S检测结果表明 ,胡萝卜茄红素 -β-环化酶反义 RNA基因对两个不同烟草材料的遗传转化率均为 4 1 .7% ;Xanthi Southern杂交的阳性率为 6 7% ;

p53反义RNA对人肺癌细胞表型和顺铂敏感性的影响

目的 研究外源p53反义RNA对有p53基因 2 4 8密码点突变的人肺癌细胞系恶性表型和顺铂敏感性的影响。方法 构建p53反义RNA真核细胞表达载体PEGFP p53(AS) ,经酶切图证明反向联结质粒。Lipofectin介导转染有p53基因 2 4 8密码点突变的人肺癌细胞系 80 1D ,经G41 8筛选获耐受克隆。稀释法建立单细胞克隆系 ,应用PCR检测外源基因 ,荧光显微镜检测细胞绿色荧光蛋白表达 ,p53单抗免疫组化染色检测p53突变蛋白表达 ,体外集落形成实验检测细胞生长 ,流式细胞仪检测细胞周期 ,MTT法检测细胞对顺铂药物敏感性。结果 酶切图证明了p53 cDNA反向联结于质粒 ,构建了PEGFP p53(AS) ,并建立了转染单细胞克隆系PEGFP p53(AS) 80 1D及空载细胞系PEGFP 80 1D。PCR检测外源p53基因和neo基因存在于转染细胞系 ,而荧光显微镜下发现其胞浆有绿荧光蛋白表达。免疫组化染色p53突变蛋白在 80 1D细胞系为阳性 ,而PEGFP p53(AS) 80 1D为阴性 ,证明外源反义p53在转染细胞稳定表达并封闭内源突变蛋白表达。与母系相比 ,PEG FP p53(AS) 80 1D集落形成抑制率为 61 % (P <0 .0 1 ) ,流式细胞仪检测该细胞系G1期细胞数明显增加 ,出现G1期阻滞的表现。MTT检测PEGFP p53(AS) 80 1D对顺铂比母系更为敏感。结论 有p53基因 2 4 8密码点?

反义RNA技术及其在农业领域的应用

介绍了反义RNA的概念及作用机理,对反义RNA技术及其在农业领域的应用进行了概述.反义RNA技术是借助基因重组技术,根据碱基互补原理,用人工合成或生物体合成的特定RNA片段(或其化学修饰物)抑制或封闭基因表达的技术.在农业领域反义RNA技术主要应用于果实性状及品质的调控,对观赏植物性状的调控,植物抗病,控制油料种子中脂肪酸的合成,控制雄性不育,降低或去除食物中有害化学成分等方面其功能获得可靠的成效.

番茄ACC合成酶基因的反义RNA-核酶嵌合基因植物表达载体的构建及对番茄的转化

将克隆的番茄 ACC合成酶基因的反义 RNA-核酶嵌合的 DNA序列用 Hind 和 Kpn I切割后重组于植物表达载体 p GA643中 ,用三亲融合法导入农杆菌 LBA4 40 4中 ,采用叶盘法转化番茄子叶 ,诱导出再生小植株 ,获得了卡那霉素的抗性植株 .提取植物总 DNA,用p GA643作探针 ,通过斑点杂交 ,已筛选出整合有外源基因的工程植株 .为进一步研究该嵌合基因对 ACC合成酶基因表达的影响及获得商品化的转基因番茄奠定了基础 .

人ODC基因第三外显子反义RNA腺病毒载体的构建

目的:构建人鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因第三外显子反义RNA的腺病毒载体。方法:RT-PCR方法克隆出人ODC基因第三外显子的片段,插入pMD18-T载体中,经SalⅠ、BglⅡ酶切,插入穿梭质粒pAd-Track-CMV形成重组质粒pAdTrack-CMV-ODCr。经PmeⅠ酶切线性化后,转入pAdesy-1细菌中与含腺病毒基因骨架的质粒pAdesy-1同源重组。将重组质粒pAdesy-ODCr经PacⅠ酶切后,转染293细胞包装成腺病毒颗粒,经荧光显微镜和PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。结果:用RT-PCR方法从人前列腺癌组织中扩增出120bp的cDNA片段,经测序证实为ODC基因第三外显子的片段。重组质粒pAdTrack-CMV-ODCr转入pAdesy-1细菌中获得多个阳性克隆。重组质粒pAdesy-ODCr转染293细胞进行包装,经荧光显微镜观察可见其在293细胞中表达。进一步通过PCR法证实其含有目的基因。结论:成功地构建了ODC基因第三外显子反义RNA重组腺病毒载体,为研究其抗肿瘤的作用奠定了基础。

腺病毒介导的cox-2反义RNA对食管癌细胞株生长的影响

目的 :构建表达人环氧化酶 2 (cyclooxygenase 2 ,cox 2 )反义RNA的腺病毒载体 ,研究其对人食管癌细胞生长的影响。方法 :把人cox 2基因的cDNA片段反向克隆于穿梭质粒 pHCMVSP1A的CMV启动子之下 ,获得 pAd AShcox 2 ,通过脂质体与pJM17共转染 2 93细胞 ,经同源重组产生编码cox 2反义RNA的重组腺病毒———Ad AShcox 2。PCR鉴定为阳性克隆并大量扩增 ,转染食管癌细胞EC970 6 ,用生长细胞计数 ,3 H TdR掺入及免疫细胞化学的方法 ,研究对食管癌细胞生长、cox 2表达、DNA合成的影响。结果 :成功构建编码cox 2反义RNA的重组腺病毒Ad AShcox 2 ,病毒感染EC970 6后 ,cox 2表达降低 ,3 H TdR掺入量减少 ,与对照组比较P <0 .0 0 1;同时发现食管癌细胞的生长受抑制。结论 :减少cox 2的表达可能是治疗食管癌的一种新途经。

肝癌细胞特异性IL-1β反义RNA对小鼠移植肝癌的抑制

目的:构建肝癌细胞特异性小鼠IL-1β反义RNA表达载体,观察其对H22肝癌细胞小鼠移植瘤生长的影响及其相关机制。方法:构建由AFP最小启动子和CMV增强子嵌合序列调控的携IL-1β反义RNA表达载体pafpIRES2-antiIL-1β1和pafpIRES2-antiIL-1β2,经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定进行鉴定。反义RNA表达载体转染小鼠H22肝癌细胞,分H22/mock组、H22/antiIL-1β1组、H22/antiIL-1β2三组,RT-PCR检测IL-1β的表达水平。以转染后的H22细胞皮下接种建立荷肝癌小鼠模型,观察移植瘤体积和重量,MTT法检测荷瘤小鼠脾脏中分离的NK细胞对H22细胞的杀伤活性。结果:经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定证实成功构建能够在肝癌细胞中特异性表达IL-1β反义RNA的表达载体pafpIRES2-anti-IL-1β1和pafpIRES2-antiIL-1β2,转染H22细胞后细胞中IL-1β表达水平明显下降,以pafpIRES2-antiIL-1β2更为显著。成功建立荷肝癌小鼠模型,与H22/mock组小鼠相比,H22/antiIL-1β2组小鼠移植瘤体积较小,生长显著减慢(P<0.05)。H22/anti-IL-1β1、H22/antiIL-1β2组荷瘤小鼠的NK细胞对H22细胞的杀伤活性明显增强(P<0.05或P<0.01)。结论:成功构建的肝癌细胞特异性IL-1β反义RNA表达载体可有效抑制小鼠移植肝癌的生长,其机制与靶向阻断IL-1β表达、上调NK细胞的杀伤活性有关。

鸟氨酸脱羧酶基因反义RNA对前列腺癌细胞生长的抑制作用

为研究鸟氨酸脱羧酶 (ODC)基因反义RNA对前列腺癌细胞的生长抑制作用 ,将表达ODC第 3外显子反义RNA的重组腺病毒rAd ODC Ex3as分别感染前列腺癌细胞株PC 3和LNCap .通过MTT法观察其对前列腺癌细胞增殖的影响 ,并确定不同细胞合适的感染滴度 ,再采用Western印迹和流式细胞术检测rAd ODC Ex3as对细胞中ODC表达的抑制作用、对细胞周期和凋亡的影响以及与CDK抑制物p2 1的关系 .实验显示 ,rAd ODC Ex3as分别以 5 0MOI、2 5MOI感染PC 3和LNCap细胞可明显抑制其生长增殖 ,而不引起细胞毒性作用 ;其对两种细胞中ODC表达的抑制作用分别为4 5 %和 5 9% .流式细胞DNA含量分析证实 ,rAd ODC Ex3as可引起PC 3和LNCap细胞周期G1期阻滞 ,但并未引起凋亡 .通过Western印迹发现 ,细胞中ODC表达的降低可诱导p2 1蛋白的过表达 .结果表明 ,rAd ODC Ex3as在体外能有效地干扰ODC基因的表达 ,并通过诱导p2 1的过表达使其细胞周期停于G1期 ,从而抑制前列腺癌细胞PC 3和LNCap的增殖 ,为其进一步基因治疗的研究打下基础 .

腺病毒介导的cox-2反义RNA对食管癌细胞株DNA和蛋白质合成的影响

目的:构建表达人cox-2反义RNA的腺病毒载体,研究其对人食管癌细胞株DNA和蛋白质合成的影响.方法:把人cox-2的cDNA片段反向克隆于穿梭质粒pHCMVSP1A的CMV启动子之下,获得pAd-AShcox-2,通过脂质体与pJM17共转染293细胞,经同源重组产生编码cox-2反义RNA的重组腺病毒--Ad-AShcox-2.经PCR的方法鉴定为阳性克隆并大量扩增、纯化,转染食管癌细胞EC9706,采用生长细胞计数,免疫细胞化学、3H-TdR、3H-Leucine掺入法,研究对食管癌细胞生长、DNA及蛋白质合成的影响.结果:成功构建并扩增、纯化得到编码cox-2反义RNA的重组腺病毒Ad-AShcox-2,滴度达0.86×1012PFU/ml;Ad-AShcox-2感染肿瘤细胞后,cox-2表达水平明显降低,3H-TdR、3H-Leucine掺入量明显减少,与对照组在48h、72h、96h比较有显著性差异(q48h=16.36及16.36,q72h=39.07及19.90,q96h=54.80及30.33;P<0.001);同时发现食管癌细胞的生长明显受抑制.结论:表达cox-2反义RNA重组腺病毒感染人食管癌细胞后可降低cox-2表达水平,使DNA合成降低、蛋白质合成减少,且抑制食管癌细胞生长、增生,提示抑制cox-2的表达可能是治疗食管癌的一种新途经.

雄激素受体反义RNA抑制前列腺癌细胞LNCaP致瘤性的研究

目的 观察雄激素受体 (Androgenreceptor ,AR)反义RNA对前列腺癌细胞LNCaP致瘤性的影响。方法 分别用细胞平板克隆形成试验及裸鼠接种实验观察前列腺癌细胞LNCaP、LNCaPNeo和LNCaPas AR 细胞致瘤性的变化。结果 LNCaPas AR细胞的克隆形成效率显著低于LNCaPNeo细胞 (P <0 .0 1)。LNCaPas AR细胞在雄性裸鼠体内形成的瘤体体积明显小于LNCaPNeo细胞并且形成瘤体的时间延长。结论 雄激素受体反义RNA可抑制前列腺癌细胞LNCaP成瘤能力。