水稻质核互作雄性不育系选育的反向杂交法研究

不同的部分保持系可能存在不同的微效恢复基因 ,通过有性杂交 ,产生基因重组 ,能够获得完全保持系类型 ,但只有在不育细胞质中才能观察得到微效恢复基因是否存在以及它们的作用大小。反向杂交法以不育细胞质为选择背景 ,在杂交后代植株中直接观察到微效恢复基因的表达 ,获得的完全不育株 ,在一定程度上排除微效恢复基因 ,不育株再通过高温处理转换为可育后自交 ,来自不育株的微效恢复基因可以进一步排除掉 ,从而产生出没有 (或很少 )微效恢复基因的“亲本”,利用该“亲本”高温处理后仍可转换为可育的特性 ,作为父本进行杂交或回交育种 ,在其后代中获得没有微效恢复基因的完全保持系。该研究为 Cp2 6不育细胞质源创造出了完全保持系。如果在田间鉴定出优异的完全不育株 ,对其进行单倍体育种 (诱导孤雌生殖或花培 ) ,选择到没有 (或很少 )微效恢复基因的纯合不育株。再对其进行花培 ,筛选可育的突变体 ;或者利用纯合不育株的原生质体与一个已破坏细胞核的可育系原生质体融合 ,都可能得到具有纯合不育株细胞核和可育细胞质的保持系 ,而能够完善和改进反向杂交法。反向杂交法不但能够为所谓不能保持的不育细胞质源创造出保持系 ,而且有利于加强新不育系选育的目标性和预见性 。

反向杂交法检测基因突变的研究进展

基因突变的检测是分子生物学、遗传学、诊断学、肿瘤学研究的热点，其检测方法也随着生命学科的发展而迅速发展。基因突变的检测技术种类繁多，如单链构象多态性（SSCP）、温度梯度凝胶电泳等。其中反向杂交法由于其具有操作简单、可重复性好、灵敏度高、一次可检测多个突变的特点．在临床诊断中具有很高的开发价值。本文对反向杂交法在基因突变检测方面的应用进行了总结。

聚合酶链反应顺序特异性寡聚核苷酸探针反向杂交法在HLA-DRB_1分型中的应用

目的:探讨聚合酶链反应顺序特异性寡聚核苷酸探针(polymerasechainreaction-sequencespe-cificoligonucleotideprobes,PCR-SSOP)反向杂交法应用于人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)-DRB1配型的可行性。方法:随机选取25例已行聚合酶链反应顺序特异性引物(polymerasechainreac-tion-sequencespecificprimers,PCR-SSP)法HLA-DRB1配型的肾移植受者的血标本,采用PCR-SSOP反向杂交法再次配型,并与PCR-SSP法的结果比较。结果:两法的一致性达92%。2例不一致的患者经再次PCR-SSOP反向杂交法配型后,其中1例与PCR-SSP结果一致,PCR-SSOP反向杂交法的平均操作时间为4小时30分。结论:PCR-SSOP反向杂交法是一种能以中等分辨度进行等位基因分型的方法,操作较简单,结果解读客观,适用于临床肾移植配型。

流式磁珠反向杂交法HLA基因分型中磁珠读数减少对结果的影响

目的分析流式磁珠反向杂交法HLA基因分型中磁珠读取数目减少对结果的影响。方法将正常杂交、读取、获得基因分型结果的样本溶液分别按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16的倍数稀释,进行再次读取、判定分型结果。结果所有样本稀释前后每种磁珠的荧光信号反应格局一致,分型结果完全相同。结论读取到的磁珠数目在一定范围内的减少,通过仔细分析,可保证分型结果准确可靠。

PCR-微孔板反向杂交法在结核分枝杆菌检测中的应用

目的 评价PCR 微孔板反向杂交法检测临床标本中结核分枝杆菌 (MTB)的应用价值。方法 应用集菌涂片镜检法、培养法、PCR法、PCR 微孔板反向杂交法分别对 5 5份肺结核病患者和 30份非结核呼吸系统病患者痰标本平行检测。结果 涂片法对结核病患者临床标本中MTB检出率为 2 1.82 % ,培养法检出率为2 5 .4 6 % ,PCR法检出率 36 .36 % ,PCR 微孔板反向杂交法检出率 4 7.2 7%。对 30例非结核呼吸系统疾病患者检测MTB ,PCR法出现 2例假阳性 ,其余 3种方法均阴性 ,PCR 微孔板反向杂交法比单纯PCR法灵敏度高、特异性强。结论 PCR 微孔板反向杂交法具有简便、快速、抗污染、灵敏度高、特异性强的优点 ,缺点是存在假阴性 ,应改进标本前处理方法 ,在对结核病的辅助诊断中应与细菌学方法相结合 。

Gap-LCR-ELISA法与PCR-反向杂交法对沙眼衣原体检测的对比研究

目的比较质粒缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附试验测定(Gap-LCR-ELISA)法及聚合酶链式反应(PCR)-反向杂交法对沙眼衣原体(CT)的检测效果。方法对我院眼科送检临床标本167份进行CT检测,其中采用Gap-LCR-ELISA法检测80份,采用PCR-反向杂交法检测87份。并对2种方法检出阳性率及其敏感度与特异度进行比较。结果Gap-LCR-ELISA法检出阳性率为26.2%,PCR-反向杂交法检出率为34.5%,差异无统计学意义(P>0.05);两法的敏感度和特异度均为100.0%和98.0%。结论Gap-LCR-ELISA法和PCR-反向杂交法均可作为CT的检测方法,值得临床推广应用。

PCR反向杂交法在乙肝耐药突变及分型检测中的应用

目的通过PCR 反向点杂交法快速检测临床样品中乙型肝炎病毒的耐药突变情况.方法：PCR 反向点杂交法检测56 例慢性乙肝患者样品,对乙型肝炎患者病毒载量为104-107进行分析.结果：在56 例临床病例中,共检出耐药突变病例55 例,检出率为98.2%.发现3 种基因亚型,其中B 型2 例,占3.5%;C 型52 例,占92.8%;B、C 混合感染1 例,占1.8%;型别未分1 例,占1.8%.结论：PCR 膜芯片杂交技术可检测乙型肝炎病毒基因亚型及耐药突变类型,并具有快速、高通量、敏感的特点,适合各临床医院开展应用.

Gap-LCR-ELISA法与PCR-反向杂交法对沙眼衣原体的检测的对比研究

沙眼是由沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，CT）感染引起的一种感染性眼病，是全球因感染而致盲的主要病因，集中在非洲和亚洲。本研究对167份标本用质粒缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附测定（Gap—LCR—ELISA）法及PCR-反向杂交法进行检测，并与传统的培养法比较，结果报道如下。

反向杂交法检测HPV基因分型质控品

目的:反向杂交法检测HPV基因分型质控品。方法:采用我室建立的HPV基因分型质控品,以单一型质粒DNA和混合质粒DNA为模板扩增,将扩增好的PCR产物进行导流杂交。结果:以单一型质粒DNA为模板扩增时,HPV基因分型结果正确的亚型有18种,该方法的试剂盒对HPV39,52,53亚型的质粒DNA有漏检。以相同百分比的混合质粒DNA为模板扩增时,试剂盒对HPV35,39,42,68亚型的质粒DNA有漏检;以不同百分比的混合质粒DNA为模板扩增时,试剂盒对混合质粒中百分比低(5%或者2%)的质粒DNA存在着漏检现象。结论:建立的HPV基因分型质控品能够对反向杂交法的试剂盒性能指标进行有效评价,能够满足国内诊断试剂质量监督管理的需要。

PCR-反向点杂交法在外阴阴道念珠菌病诊断及白念珠菌耐药基因突变检测中的应用

目的评价PCR-反向点杂交法用于念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测的应用价值。方法收集念珠菌性阴道炎患者及体检健康妇女分泌物各285份和50份。用生物梅里埃酵母菌鉴定卡进行菌种鉴定,用最低抑菌浓度(MIC)法(郑州安图真菌快速培养鉴定药敏试剂)进行药敏试验;采用PCR-反向点杂交法(深圳亚能念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测试剂)进行菌种鉴定和耐药基因突变检测;采用PCR及测序方法进行耐药基因的检测。分别以培养鉴定法、MIC法、核酸序列测定法为对比方法,评价PCR-反向点杂交法念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测的敏感性、特异性及准确性。结果与培养鉴定法相比,PCR-反向点杂交法检测6种念珠菌菌种的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和总符合率分别为95%、96%、96%、98%、97%以上,2种方法检测6种念珠菌(白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和季也蒙念珠菌)结果的差异无统计学意义(χ~2值分别为0.44、0、0、0、0和0,P均>0.05),一致性较好(Kappa均>0.9)。与MIC法相比,PCR-反向点杂交法检测白念珠菌耐药的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和总符合率分别为98%、88%、98%、88%和96%,2种方法检测结果的差异无统计学意义(χ~2=0.17,P>0.05),一致性较好(Kappa>0.8)。PCR-反向点杂交法与核酸序列测定法相比,对6种白念珠菌耐药基因突变位点的检测结果完全一致。结论PCR-反向点杂交法在念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测上与培养鉴定法以及核酸序列测定法的一致性高,比传统检测方法更早期更快速,可应用于外阴阴道念珠菌病(VVC)的辅助诊断。

PCR-反向点杂交法检测乙型肝炎病毒的基因耐药变异与基因分型

目的探讨PCR-反向点杂交法用于检测HBV基因耐药变异与基因分型的可行性。方法采用PCR-反向点杂交法对89例慢性乙型肝炎患者的血清标本进行HBV基因耐药变异和基因分型检测;用DNA测序法对患者的HBV DNA进行测序,确定HBV的耐药变异与基因分型情况,评价PCR-反向点杂交法的准确性、灵敏度及临床应用价值。结果 89例标本经PCR-反向点杂交法检出变异株31例,其中rtL180M+rtM204V联合突变株15例,rtN236T突变株4例,rtM204I突变株9例,rtA181V突变株3例;野生株55例,阴性标本3例;HBV基因型中C基因型72例,B基因型14例。经测序确定PCR-反向点杂交法检测准确度、特异度均为100%。结论采用PCR-反向点杂交法检测HBV基因耐药变异与基因分型可靠、简便、经济、高效,适宜临床推广。

反向点杂交法检测中国人N-乙酰化酶基因型

目的 建立快速方便的反向点杂交法 (RDB)检测中国人N 乙酰化酶 (NAT2 )基因型。方法 采用PCR法扩增生物素标记的DNA片段 ,与固定在尼龙膜上的等位基因特异性寡核苷酸探针进行杂交 ,通过非同位素法显色检测杂交结果 ,分析NAT2 5种主要突变位点。用本法对 4 8名肺结核患者NAT2基因型进行了分析。结果 RDB法与等位基因特异扩增法结果完全一致。 4 8名肺结核患者NAT2 5、 6、 73种突变型等位基因的基因频率分别为 1 0 4 %、2 2 9%和 15 6 %。野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子分别为 33 3%、5 4 2 %和 12 5 %。结论 RDB法检测NAT2基因型准确、方便 ,适用于指导临床合理用药。

PCR反向点杂交技术与DNA测序法检测HPV的对比研究

目的通过PCR反向点杂交技术检测人乳头瘤病毒(HPV),并采用DNA测序法对此方法进行验证,比较两种检测方法的一致性,为临床使用PCR反向点杂交技术进行HPV DNA检测提供准确依据。方法采用PCR反向点杂交技术和DNA测序法对喀什地区第一人民医院妇科门诊收集的27例HPV感染患者进行检测,将两种检测方法得到的检测结果进行比对。结果采用PCR反向点杂交技术和DNA测序法得到的检测结果一致,27例样本中阳性检出率100.0%,其中高危型检出率为85.2%,低危型检出率为14.8%,多重型别感染率为25.9%。结论两种HPV检测方法的结果符合率100.0%,PCR-反向点杂交技术检测结果准确度高,可以为临床诊断提供准确可靠的依据。

PCR反向膜杂交法在CT、UU、NG三种性病筛查中的应用价值

目的:探讨PCR反向膜杂交法在CT、UU、NG三种性病筛查中的应用价值。方法:对1486例疑为泌尿生殖道感染患者分别采用PCR反向膜杂交法及荧光定量PCR(FQ-PCR)检测,并将检测结果与培养结果比较。结果:FQ-PCR检测CT、UU、NG阳性率高于培养法,比较差异有统计学意义(P<0.01);PCR反向膜杂交法与培养法及FQ-PCR检测阳性率比较差异均无统计学意义;PCR反向膜杂交法、FQ-PCR检测敏感性比较差异无统计学意义,但PCR反向膜杂交法检测特异性高于FQ-PCR,比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:PCR反向膜杂交法筛查CT、UU、NG准确,快速,且筛查特异性高于FQ-PCR,值得临床推广适用。

反向斑点杂交法快速检测肺炎支原体

目的:探讨早期、快速检测肺炎支原体的方法。方法:根据肺炎支原体特异的P1基因设计引物,通过聚合酶链反应合成一段特异的162bp长链DNA探针,采用反向斑点杂交法检测生物素标记支原体DNA,并应用于痰标本的检测。结果:所合成的162bpDNA探针具有高度特异性,只和肺炎支原体杂交,与其它细菌、真菌、病毒无交叉反应,该探针最低可检测出1ng的DNA。杂交法和培养法分别检测100份痰标本,两者的阳性率分别为12%和2%。结论:该方法快速、特异,对肺炎支原体的早期诊断具有较高的应用价值。

膜反向斑点杂交法检测广东人G6PD基因6种常见突变

【目的】探讨膜反向斑点杂交法在广东人G6PD基因6种常见突变同步检测中的应用。【方法】用高铁血红蛋白还原试验和G6PD/6-PGD酶活性比值法进行G6PD缺乏症筛查。应用多重PCR方法扩增G6PD基因目的片段。用Premier Primer6.0软件设计和优化针对广东人常见6种G6PD基因突变型的特异性寡核甘酸探针,用乙基-3-二甲氨基丙碳二亚胺(EDC)法处理尼龙膜并固定探针,制成G6PD基因突变检测用膜条。多重PCR扩增产物与固定在膜条上寡核苷酸探针进行杂交,通过显色反应判读结果。以G6PD基因测序为金标准,对膜反向斑点杂交法进行评价。【结果】26例标本中膜反向斑点杂交法检测结果:95A→G突变型5例,1024C→T突变型3例,1376G→T突变型8例,1388G→A突变型7例,392G→T突变型1例,未发现1311C→T突变型,有两例检测为阴性。膜反向斑点杂交法未能测出的2例标本经基因测序证实存在392G→T突变,其余24例膜反向斑点法与基因测序法的结果完全一致,符合率为92.3%(24/26)。【结论】在优化探针设计和杂交条件前提下,膜反向斑点杂交法可用于广东人G6PD基因6种常见突变型的同步检测。

建立反向斑点杂交法快速诊断HBV拉米夫定耐药位点

目的:基于多重PCR和反向线性杂交原理,建立乙肝病毒(HBV)耐药突变检测的新方法,探讨HBV与药物应答的关系。方法:通过序列分析,设计生物素标记的引物,扩增HBV聚合酶逆转录区基因。同时设计能检测出拉米夫定(LAM)常见耐药突变位点的特异性探针。样本经PCR扩增后与固定至尼龙膜条上的探针杂交,用BCIP/NBT系统显色,观察结果。结果:实验建立的反向线性杂交法显色后斑点出现的耐药位点与测序结果相一致。结论:检测结果与测序结果具备良好一致性,用反向线性杂交法建立的测定HBV耐药位点的具有操作简便,快速、敏感、高通量的特点。