共表达IL-7/CCL19的新抗原反应性T细胞对小鼠肺癌的抗肿瘤研究

背景与目的新抗原反应性T细胞(neoantigen reactive T cell,NRT)具有抑制表达特异性新抗原的肿瘤生长的能力。然而,由于免疫浸润困难和肿瘤微环境的抑制,NRT在实体瘤中的治疗效果有限。本研究针对小鼠肺癌细胞设计出可以同时表达白细胞介素7(interleukin 7,IL-7)和趋化因子19(chemokine C-C motif ligand 19,CCL19)的NRT细胞(7×19 NRT),并对7×19 NRT细胞和常规NRT细胞的抗肿瘤效果差异进行了评估。方法针对小鼠Lewis肺癌细胞(Lewis lung carcinoma,LLC)进行了新一代测序和新抗原预测,制备了RNA疫苗,培养了NRT细胞,构建了编码IL-7和CCL19的逆转录病毒载体,转导NRT细胞并成功表达IL-7和CCL19,成功获得了7×19 NRT,并在小鼠体内外对其抗肿瘤效果进行了评估。结果7×19 NRT细胞通过分泌IL-7和CCL19显著增强T细胞的增殖和侵袭能力,在小鼠肺癌中实现了显著的抑瘤作用,延长了小鼠的生存期。经7×19 NRT治疗后,T细胞浸润肿瘤组织及肿瘤组织坏死显著增加。此外,7×19 NRT治疗与常规NRT治疗均安全。结论通过IL-7和CCL19的表达,NRT细胞的抗实体瘤能力显著增强,这是一种对NRT安全有效的基因修饰。

肿瘤抗原肽的HLA限制性确认和诱导反应性T细胞杀瘤能力评估

目的了解肿瘤抗原肽的HLA限制性以及其诱导的T细胞能否杀伤肿瘤细胞,探索无关供者来源细胞用于过继性抗肿瘤T细胞治疗。方法使用16个肿瘤抗原肽诱导18名无关供者外周血单个核细胞(PBMC)分化为反应性T细胞,并分析HLA型别;利用NetMHC数据库预测肽和HLA分子亲和力;选择HLA-A2限制性的肿瘤抗原肽诱导第二组17名无关供者的PBMC进行杀瘤实验,反应性T细胞作为效应细胞,T2细胞及肿瘤抗原肽同源的肿瘤细胞作为靶细胞,测量LDH(乳酸脱氢酶)释放量或者RTCA(实时无标记细胞分析仪)检测效应细胞杀瘤效率,比较HLA-A2+和A2-T细胞杀瘤效率。结果筛出和HLA-A2具有高亲和力的肿瘤抗原肽LM7,可诱导5/11 HLA-A2+为反应性T细胞,其中HLA-A2+纯合子则为3/3,而HLA-A2-者则为2/7。LM7诱导反应性T细胞杀伤肿瘤百分比A2+组明显强于A2-组(60.72±11.28 vs 47.2±4.46,P=0.03)。结论本研究显示NetMHC预测对于纯合子样品更有帮助,肿瘤抗原肽LM7具有HLA-A2限制性,可诱导部分HLAA2+PBMC分化为反应性T细胞,可杀伤肿瘤,应对供者进行HLA筛选并分析其细胞功能,其诱导的反应性T细胞可作为过继性T细胞抗肿瘤治疗的细胞来源。

结直肠癌类器官的反应性T细胞受体筛选及功能鉴定

目的本研究通过建立基于结直肠癌(colorectal cancer,CRC)类器官模型以及CRC反应性肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)扩增和分离,筛选肿瘤特异性T细胞受体(T cell receptor,TCR)并进行功能验证,为结直肠癌个体化过继性T细胞免疫治疗的临床转化提供技术平台和研究基础。方法通过体外3D培养技术构建结肠癌患者组织来源的类器官模型,并利用HE染色和免疫组化进行形态学和特征分子表达检测。随后,将CRC类器官与TIL共培养,通过流式细胞技术分选反应性TIL,通过单个T细胞受体基因克隆技术分析反应性TCR克隆特征。进一步通过细胞毒性实验对TCR功能进行验证。结果通过形态学、代表性分子(CK20和CDX2)表达水平验证了结直肠癌类器官与患者肿瘤具有高度相似性。成功筛选到CD137表达上调和IFN-γ分泌增加的结直肠癌反应性T细胞,其中TCR2-T展现出较好的肿瘤反应性和体外肿瘤杀伤功能。结论建立了基于CRC-Org的反应性TCR筛选和功能验证平台,为结直肠癌个体化T细胞治疗转化应用提供技术平台。

肿瘤新抗原肽诱导献血者PBMC特异反应性T细胞

目的观察异基因献血者来源PBMC(peripheral blood mononuclear cells)是否可被来自于肿瘤患者测序来源的新抗原肽诱导为特异反应性T细胞。方法取健康献血者新鲜外周血白膜层,分离获得PBMC后,粘附获得单核细胞,同时冻存PBL(peripheral blood lymphocytes)。单核细胞以每三天加入细胞因子GM-CSF和IL-4进行细胞诱导培养,7天后收获成熟DC(dendritic cells),24孔铺板后分别装载16条肿瘤新抗原肽,其中13条为本项目组前期研究所得,5 h后加入4~10倍细胞数量已复苏的PBL共培养,每三天加入IL-2,对照为不加抗原肽(DC/PBL),加入PHA(Phytohemagglutinin,植物血凝素)PBL孔作为阳性对照;第14天、第21天分别再行新抗原肽脉冲刺激,第22天留取上清液用ELISA方法测量IFN-γ浓度,剩余细胞用流式细胞仪分析CD3^(+)IFN-γ^(+)/CD8^(+)IFN-γ^(+)T细胞占比。结果发现10/13中的每条多肽至少可诱导3份PBL分化为分泌IFN-γ反应性CD3^(+)或CD8^(+)T细胞,同步ELISA测得上清液中IFN-γ浓度也升高,以上结果具有一定的相关性(CD3^(+)或CD8^(+)T细胞r值分别为0.66、0.58,P<0.05)。结论我们成功地建立了用来自肿瘤患者的肿瘤新抗原肽诱导健康献血者的PBMC分化为肿瘤新抗原肽特异性的T细胞。

CⅡ诱导RA患者关节滑液中自身反应性T细胞的免疫学特性分析

目的 :探讨CⅡ诱导的RA患者关节滑液中自身反应性T细胞免疫学特性。方法 :分离RA患者关节滑液中SFMC ,用CⅡ刺激后分析反应性的T细胞频率 ;用ELISA方法检测CⅡ刺激SFMC后上清中的IFN γ和IL 4的含量及通过流式细胞检测SFMC表面标志的表达 ;应用半定量PCR分析外周血及滑膜液中TCRVβ基因表达格局。 结果 :SFMC中CⅡ反应性的T细胞频率高于PBL ;IFN γ的含量在CⅡ刺激SFMC后上清中较高 ,而在未刺激中较低 (P <0 0 1) ,在PBL中更低 (P <0 0 5 ) ;SFMC上CD8及CXCR3表达多于PBMC(P <0 0 5 ) ;外周血T细胞表达绝大多数Vβ基因 ,而滑膜液中TCRVβ基因取用呈现明显的不均衡性。结论 :CⅡ反应性T细胞在SFMC中占优势 。

自身反应性T细胞及共刺激分子CD28／CTLA-4／B7、CD40／CD40L和ITP

血小板抗原特异性自身反应性T细胞的活化在特发性血小板减少性紫癜(ITP)的发病机制中起着关键性作用,T细胞的活化除需要抗原递呈细胞表面MHCⅡ抗原复合物外还需要共刺激分子(第二信号),主要包括CD28／CTLA-4／B7和CD40／CD40L。本文就自身反应性T细胞和共刺激分子CD28／ CTLA-4／B7、CD40／CD40L在ITP中的作用机制及潜在的治疗价值作一综述。

IL-12对自身反应性T细胞的诱导作用

据近期出版的《临床研究杂志》刊登的一项研究结果表明，IL-12在小鼠模型中可诱导心肌炎的CD8+细胞的分化。

胶质瘤CD133+肿瘤干细胞反应性T细胞株的建立及其杀伤功能的检测

目的:建立胶质瘤CD133+肿瘤干细胞反应性T细胞株,并对其细胞毒性杀伤功能进行检测。方法:诱导并培养胶质瘤肿瘤干细胞,磁珠分选方法获得胶质瘤CD133+肿瘤干细胞。分离获得外周血单个核细胞,磁珠分选获得CD3+T细胞。辐照过的胶质瘤CD133+肿瘤干细胞诱导并与CD3+T细胞共培养,反复诱导刺激,建立胶质瘤CD133+肿瘤干细胞反应性T细胞株。检测胶质瘤CD133+肿瘤干细胞反应性T细胞的杀伤功能。结果:胶质瘤CD133+肿瘤干细胞反应性T细胞表达IFN-γ和CD107a,也表达穿孔素和颗粒酶B。结论:成功建立胶质瘤CD133+肿瘤干细胞反应性T细胞株。胶质瘤CD133+肿瘤干细胞反应性T细胞对胶质瘤CD133+肿瘤干细胞具有杀伤功能,并通过穿孔素/颗粒酶通路介导。

雷公藤内酯醇对自身反应性T细胞的作用机制研究

通过体外实验观察雷公藤内酯醇(Triptolide,Tri)对自身反应性T细胞的作用,为以后将Tri用于体内治疗EAE的研究建立基础。采用CCK-8法检测不同浓度Tri对小鼠成纤维细胞株L929生长的影响;采用MOG35-55肽段免疫C57BL/6小鼠建立EAE疾病模型,获取MOG35-55特异性T细胞,3H掺入法检测Tri对其增殖的影响;ELISA方法检测培养上清中IL-17、IFNγ-、TNFα-、IL-4、TGF-β的含量;流式细胞术检测Tri对Th1和Th17细胞分化的影响。结果Tri浓度≤30nmol/L时,对L929细胞生长未见明显细胞毒性;Tri呈剂量依赖性地抑制MOG35-55特异性T细胞增殖,抑制炎症细胞因子IL-17、IFN-γ、TNF-α的表达,并增加IL-4、TGF-β的表达水平,同时抑制na ve T细胞向致病性Th1和Th17细胞的分化。结果表明,Tri可通过抑制MOG35-55特异性T细胞的增殖,改变MOG35-55特异性T细胞分泌细胞因子的格局及抑制Th1和Th17细胞分化的途径影响自身反应性T细胞,从而为Tri体内治疗EAE的研究提供依据,也为临床研究治疗MS药物提供实验基础。

脑梗塞髓鞘蛋白反应性T细胞的检测

在脑梗塞急性期,报道显示存在着亲神经病毒的B细胞的应答,脑脊液中可有T淋巴细胞的出现及增殖,提示急性脑梗塞病人体内存在着自身免疫应答,缺血所致 的脑组织的破坏可能导致髓鞘成分如髓鞘碱基蛋白(myelin basic protein,MBP)、髓鞘脂质蛋白(myelin proteolipid protein,MPLP)的释放,这些隐蔽抗原成为自身抗原可能被巨噬细胞及其他抗原提呈细胞所识别,在脑梗塞发生后。

通过Fas-FasL途径体外清除小鼠同种异体反应性T细胞

目的 通过Fas Fas配体 (FasL)途径清除小鼠同种异体反应性T细胞 (ARTC) ,为减轻异基因骨髓移植 (allo BMT)后的移植物抗宿主病探索新的手段。方法 用磁性细胞分离系统分离BALB c小鼠 (H 2 d)Sca 1+早期造血细胞 (HC) ,然后借助逆转录病毒基因转移技术对其转染外源小鼠FasL(mFasL)cDNA基因 ;扩增 1周后与异基因BAC小鼠 (H 2 d ×b)脾细胞进行单向混合淋巴细胞培养(OWMLC) 6d ,观察处理后的BAC小鼠脾细胞对Na251 CrO4标记的BALB c小鼠脾细胞的杀伤作用。结果 成功分离出BALB c小鼠Sca 1+HC ,纯度为 (89.0± 6 .1) %。BAC小鼠脾细胞与转染外源mFasL的BALB cHC以 1∶5比例共培养 6d后 ,对BALB c源脾细胞杀伤率在不同效、靶比例时均呈显著降低 (P<0 .0 1)。结论 体外反应中 ,转染外源mFasLcDNA并高表达的早期HC可清除针对自身MHC抗原的ARTC。

1型糖尿病患者谷氨酸脱羧酶反应性T淋巴细胞的测定

目的 探讨糖尿病患者血清中谷氨酸脱羧酶反应性 T淋巴细胞的阳性反应及临床意义。 方法 应用对硝基苯 2酰氨基已糖 (NAG)微量酶反应比色法反映细胞增殖 ,检测 37例 1型糖尿病 (DM)患者外周血单核细胞对谷氨酸脱羧酶 (GAD)的反应性 ,并以 2型 DM、其他自身免疫性疾病患者及正常人各 30例作对照。 结果 1型 DM GAD反应性 T淋巴细胞的阳性率为 35 .1% (13/ 30 ) ,其他自身免疫性疾病 10 % (3/ 30 ) ,而 2型 DM和正常对照组无一例阳性 ;1型 DM阳性率高于对照组 (P<0 .0 1)。新发病的 1型 DM(病程≤ 1年 )阳性率为 6 1.1% (11/18) ,长病程 (1.5～ 2 0年 ) 1型 DM的阳性率为 10 .5 % ,1型、2型 DM差异有显著性 (P<0 .0 5 )。 结论 新发病 1型 DM存在 GAD反应性 T淋巴细胞 ,其检测有益于 1型

自身反应性T细胞系及克隆的建立与TCR使用情况分析

目的 体外建立可长期生长的自身反应性T细胞系及克隆 ,并分析其T细胞受体的使用情况。方法 用狼疮小鼠BXSB自身脾脏作为刺激细胞 ,在体外建立长期生长的自身反应T细胞系(ATL) ,通过有限稀释法进行克隆 ,应用锚定PCR方法分析其特异的T细胞受体应用。结果 建立了H 2 b 限制性的自身反应性T细胞系和 2个T细胞克隆。T细胞系主要应用TRBV2S1、TRAV5S1和TRAV10S1,而 2个T细胞克隆均为TRBV2S1和TRAV10S1。分析其表型为CD3+ CD4 + CD2 8+ 。结论 从狼疮小鼠获得了自身反应性T细胞系及克隆 。

类风湿关节炎患者自身反应性T细胞受体氨基酸序列研究

目的研究类风湿关节炎(RA)患者体内自身反应性T细胞的抗原互补区3(CDR3)的序列特性。方法采用实时定量聚合酶链反应(PCR)的方法扩增带有BV14和BV16的自身反应性T细胞抗原受体β链,用基因扫描的方法分析抗原互补区3的片断长度,用序列测定的方法分析CDR3的氨基酸序列。结果RA患者关节滑膜浸润T细胞呈寡克隆扩增,带有BV14和BV16的自身反应性T细胞分别取用不同VDJ片段组合,自身反应性T细胞CDR3长度有15bp、21bp和24bp三种形式,在不同患者自身反应性T细胞CDR3中发现相同氨基酸序列。结论RA患者自身反应性T细胞在病灶部位受到某些抗原的驱动而发生受体取用的偏移和CDR3的特异性扩增。

同种异体反应性细胞与调节性T细胞在新生期诱导的小鼠移植耐受中的作用探讨

目的:初步探讨同种异体反应性T细胞克隆清除与调节性T细胞在小鼠移植耐受中的作用。方法:雌性BALB/c小鼠与雄性C57BL/6小鼠杂交一代获得F1小鼠,不同剂量的F1小鼠脾脏细胞经眶静脉输注给新生24 h C57BL/6小鼠体内诱导耐受,成年后移植F1小鼠来源的皮肤,建立不同耐受程度的小鼠移植耐受模型;耐受小鼠脾脏细胞经CFSE标记后注射到F1小鼠体内,分析耐受小鼠来源的T细胞在体内对F1抗原的增殖能力;流式细胞术、过继转移实验分析CD4+Foxp3+调节性T细胞在移植耐受和移植排斥过程中的表达。结果:C57BL/6小鼠在新生期输注F1小鼠脾脏细胞可诱导移植耐受,耐受程度与输注的脾脏细胞剂量有关,3×107个F1小鼠脾脏细胞可诱导C57BL/76小鼠长期皮肤移植耐受,1×107个细胞诱导可使移植皮肤生存时间显著延长,但在50 d内完全排斥;体内混合淋巴细胞反应实验证明,长期耐受小鼠体内的同种异体反应性T细胞被完全克隆清除,但低剂量组小鼠体内仍存在一定数量的反应性T细胞;流式细胞分析发现,高剂量和低剂量组小鼠体内的CD4+Foxp3+调节性T细胞表达与初始小鼠相比没有显著差异;同种异体反应性T细胞过继转移给耐受小鼠,移植耐受的皮肤发生排斥反应,小鼠体内的调节性T细胞表达升高。结论:小鼠的移植耐受程度与小鼠体内的同种异体反应性T细胞的克隆清除程度有关,与CD4+Foxp3+调节性T细胞的表达没有直接关系;调节细胞在移植排斥过程中表达升高,可能作为一种反馈机制参与耐受的形成。

IL-35抑制炎症反应和T细胞反应性减轻变应性鼻炎的机制研究

目的:探讨IL-35在变应性鼻炎中对炎症反应和T细胞反应性的作用及其机制。方法:选取2012年1月至2016年1月间本院收治的37例变应性鼻炎患者(观察组)及35例行变应性鼻炎过敏原检测后排除变应性鼻炎的健康志愿者(对照组)为研究对象,采集观察组和对照组的外周血液,ELISA检测患者血清中IL-35水平。建立小鼠变应性鼻炎动物模型,收集小鼠外周血液,ELISA检测小鼠血清中IL-35及Ig E水平。小鼠鼻切片后组织染色检测嗜酸性粒细胞;分离小鼠脾脏细胞后加入卵清蛋白抗原,加入或不加入IL-35至培养基中,检测卵清蛋白特异性T细胞反应性;ELISA检测T细胞培养上清中细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13,IL-17、IL-23、IL-27以及TNF-α含量;荧光定量PCR(Real-time PCR)检测培养T细胞中IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IL-23、IL-27以及TNF-αmRNA表达水平;Western blot检测培养T细胞JNK、Erk1/2及p38信号途径的激活水平。结果:观察组血清IL-35水平显著低于对照组(P<0.05);变应性鼻炎组小鼠组织染色结果显示嗜酸性粒细胞浸润数量显著高于正常组(P<0.05),而血清IL-35水平则显著低于正常小鼠(P<0.05);卵清蛋白特异性T细胞反应性检测显示IL-35能显著抑制其反应性;ELISA及Real-time PCR结果均显示,IL-35能够显著下调IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-23及TNF-α的表达,上调IL-2、IL-10及IL-27的表达。Western blot结果显示,IL-35能够显著抑制卵清蛋白特异性T细胞中JNK、Erk1/2及p38信号途径的激活水平。结论:IL-35能够调控炎症反应中的炎症因子表达和T细胞的反应性,从而减轻变应性鼻炎,其机制可能是通过调控JNK、Erk1/2及p38信号途径的激活水平。

自身反应性T细胞系免疫生物学活性研究

目的 探讨自身反应性T细胞系过继转移对受体小鼠免疫应答的影响 ,为在BXSB小鼠探索T细胞疫苗的可行性奠定基础。方法 应用体外扩增的自身反应性T细胞过继转移给同系小鼠体内 ;3H TdR掺入法检测细胞增殖 ;ELISA检测抗体和细胞因子水平。结果 将自身反应性T细胞系过继转移到年轻未发病的同系小鼠体内可以诱导血清中自身抗体和外来抗原反应性抗体以及细胞因子IFN γ水平显著升高 ,可以降低受体小鼠对外来抗原 (OVA)体液免疫应答能力。结论 自身反应性T细胞的过继转移可以影响机体自身免疫应答和对外来抗原的体液免疫应答能力。

自身免疫性肾炎模型中自身反应性T细胞的克隆诱导及免疫学行为分析

目的 了解自身反应性T淋巴细胞(ART)在自身免疫性肾小球肾炎中的可能致病作用,探讨肾脏自身免疫性损伤与致肾炎性ART存在的相关性。方法建立Brown-Norway(BN)大鼠氯化汞(Hgcl)自身免疫性肾炎模型。在此基础上,对该模型体内的致肾炎性ART进行克隆诱导以及分离、活化、增殖等处理,并采用动物转输试验、噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术及ELISA法对所获ART的致病性、抗原性以及免疫学行为进行详细分析。结果 (1)成功建立了BN大鼠自身免疫性肾炎模型;(2)在BN大鼠自身免疫性肾炎模型中诱导、分离、获得了自身反应性T细胞克隆;(3)发现所获ART克隆对大鼠自身基底膜抗原成分层粘蛋白(laminin)有明显的增殖活性;(4)将所获ART细胞克隆转输至同种正常BN大鼠后,后者出现与原模型鼠相类似的临床、病理改变;(5)细胞表型分析发现所获ART细胞克隆多具有CD3+/CD4+的免疫学特征;(6)与对照组相比,所获ART细胞克隆的培养上清中,主要含有细胞因子IL-4[(455.0±85.1)ng/L比(139.0±46.7)ng/L,P<0.01)]。IFN-γ的分泌量与对照组细胞无明显差异[(124.0±34.6)ng/L比(147±50.3)ng/L,P>0.05)。结论 在氯化汞致自身免疫性肾小球肾炎模型中,经定向诱导、分离所获的ART细胞克隆,可呈现明显的抗原特异性及转输致病性。

类风湿性关节炎患者抗胶原蛋白Ⅱ抗体及其自身反应性T淋巴细胞的检测

目的:分析类风湿性关节炎(RA)患者T淋巴细胞免疫应答及抗胶原蛋白Ⅱ(CⅡ)抗体的异常表现。方法:应用流式细胞仪分析22例RA及6例骨关节炎(OA)患者外周血和关节滑膜液(SF)中T淋巴细胞免疫表型和趋化因子受体的表达。选用HSP-65和胶原蛋白Ⅱ(CⅡ)抗原诱导和分析患者自身反应性T淋巴细胞克隆频率,采用经典的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测患者外周血和SF中抗CⅡ抗体以及IFN-γ、IL-10、IL-4和IL-12的含量。结果:RA患者关节SF中CD4+/CD8+T淋巴细胞的比值为1.09,显著低于外周血中CD4+/CD8+T淋巴细胞比值(2.02);SF中CD3+/CD25+双阳性的活化T淋巴细胞占(15.9±9.6)%。SF中T淋巴细胞表面趋化因子受体CCR5表达较低,与外周血相比无统计学意义,但趋化因子受体CD25+/CXCR3+表达量较高,为(16.0±4.0)%,远远高于外周血T淋巴细胞[仅为(0.5±0.3)%](P<0.01)。ELISA检测结果表明RA患者关节SF中抗CⅡ抗体阳性率明显高于其血清以及OA患者SF和血清;RA患者SF中IFN-γ、IL-12的含量高于外周血。来自RA患者病灶关节SF单个核细胞(SFMC)较外周血单个核细胞(PBMC)对HSP-65抗原和CⅡ的诱导具有更高的自身反应性T淋巴细胞应答频率(分别为8.5×10-6和11.5×10-6)。结论:RA患者关节SF中存在高活化状态的T淋巴细胞,其对CⅡ的高克隆反应频率以及SF中高表达抗CⅡ抗体,均提示自身反应性T淋巴细胞的浸润是造成患者病灶区组织损伤的关键因素。