用差异显示反转录PCR银染技术研究植物基因表达的差异

通过调整差异显示反转录PCR (DDRT PCR)中总RNA、锚定引物、随机引物、cDNA和dNTP等关键试剂的用量 ,优化了适用于银染检测的DDRT PCR方法 .PCR扩增产物经 6 %变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离后 ,银染能检测到多而清晰的条带 .泳道中的条带数最少为 40个 ,最多达 80个 ,平均为 6 0个 ,条带大小分布在 10 0～ 90 0bp范围 ,灵敏度为 5pg/mm2 .此方法操作简便快速 ,灵敏度高 ,重复性好 .采用这个改良的方法 ,分析了拟南芥野生型和ast突变型基因表达的差异 .从 16 0 0 0个cDNA扩增产物条带中筛选出 2 8个差异条带 .二次PCR扩增后 ,进一步筛选出 13个差异条带 ,其中 7个是野生型特异表达的 ,6个是突变型特异表达的 。

应用反转录PCR和实时荧光定量PCR技术判定现场物证生物属性

目的探寻分子生物学方法判定刑事案件现场物证的生物属性的可行性。方法取30份现场生物检材,其中血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)各10份,分别进行常规检验法和分子生物学方法,通过DNA-RNA共提取技术,将其中的mRNA运用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术反转录成cDNA,根据3种生物检材不同的目标基因设计3对特异性引物,进行实时荧光定量PCR扩增,通过熔解曲线测定不同的熔解温度(Tm)和不同长度的扩增片段来区分生物检材。结果血液(斑)的Tm值为(84.5±0.2)℃,片段长度177 bp;唾液(斑)的Tm值为(76.9±0.3)℃,片段长度134 bp;精液(斑)的Tm值为(88.5±0.2)℃,片段长度294 bp。结论与常规检验法比较,联合应用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术判定检材的生物属性特异性强、灵敏度高、结果稳定可靠,可应用于日常法医物证检验。

原位反转录PCR技术的应用

针对已有资料中对于以DNA为靶基因序列的原位 PCR介绍较多,而对于原位反转录PCR的介绍很少,但在实际研究工作中有很多检测的靶基因是 RNA(病毒的或基因组的 RNA)的实际情况,就原位反转录PCR技术的基本原理、影响试验结果的关键因素和步骤,如组织细胞的固定、引物和探针的选择、蛋白酶及DNA酶消化、假阳性及假阴性的产生等进行了概述,旨在通过探讨上述问题,对该技术的实际应用有所指导。

苏太猪肌内脂肪沉积相关基因SRC-1的差异显示反转录PCR鉴定

采取90头180日龄去势苏太猪的背最长肌组织测定肌内脂肪含量,从中选取肌内脂肪含量差异极显著(P<0.01)的最高和最低各6头组成RNA池,采用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)鉴定两组间差异表达的基因,结果共获得14条表达序列标签(expressed sequence tags),即EST序列,通过GenBank比对发现其中3条为已知序列。为进一步验证这3个已知基因与肌内脂肪之间的关系,从90个个体中选取肌内脂肪最高和最低各15个个体进行实时定量PCR检测。结果表明,细胞核受体共激活因子1基因(SRC-1)mRNA表达水平与肌内脂肪含量存在负相关关系(r=-0.38,P<0.05)。提示:SRC-1蛋白有可能参与了肌内脂肪沉积的调节。

液相原位反转录PCR:一种研究基因原位表达的有效方法

介绍了液相原位反转录PCR(in wellinsituRT PCR)的操作程序、存在的问题及改良方法 ,最后探讨了原位反转录PCR在研究RNA转录、加工、编辑和多聚腺苷酸化等方面的应用。

荧光定量反转录PCR检测新生儿脐血ζ珠蛋白mRNA的转录水平

目的运用荧光定量反转录PCR技术,检测新生儿脐血ζ珠蛋白mRNA的转录水平。方法以基因型为(αα/αα)的新生儿作为正常对照组,基因型为(--/αα)的新生儿为病例组。选择β肌动蛋白基因为校正基因,ζ珠蛋白基因为目的基因。运用双标准曲线法检测两组新生儿脐血的ζ珠蛋白mRNA的转录水平。结果病例组的ζ珠蛋白mRNA的平均转录水平明显增高。结论通过荧光定量反转录PCR技术能够检测出基因型为(--SEA/αα)的新生儿的ζ珠蛋白mRNA转录水平的增高,具有较好的诊断价值。

实时荧光反转录PCR检测呼吸道合胞病毒

目的建立快速、准确、特异的实时荧光反转录PCR方法检测呼吸道合胞病毒(RSV).方法根据RSV基因序列设计引物和探针并优化实时荧光反转录PCR反应体系,对686例临床标本进行检测,阳性结果测序验证.结果本实验所建立实时荧光反转录PCR方法可准确、特异地检测RSV;686名呼吸道感染患儿中RSV感染达到16.5%(113/686).结论本研究建立的RSV实时荧光反转录PCR方法快速、准确,结果可靠,可用于儿童RSV感染的临床诊断.

基因Ⅶ.2亚型新城疫病毒反转录数字PCR检测方法的建立与应用

基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)是严重危害我国家禽养殖业健康发展的主要病原之一。国家新城疫参考实验室监测表明,目前国内NDV流行毒株已由基因Ⅶ.1.1亚型转变为Ⅶ.2亚型。为实现基因Ⅶ.2亚型NDV的快速检测和精准定量,针对其国内流行毒株F基因保守区域设计了特异性引物和探针,建立了一种可快速检测基因Ⅶ.2亚型NDV的反转录数字PCR(RT-dPCR)方法,并评估了该方法的敏感性、特异性和重复性。结果显示:建立的RT-dPCR方法检测下限为1.30 copies/μL,敏感性较高;特异性强,与基因Ⅵ型、Ⅻ型NDV以及其他常见禽病病毒(禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒和禽腺病毒)无交叉反应;重复性试验变异系数为2.6%,小于3%,重复性好。利用本方法对从活禽市场采集的200份鸡口咽/泄殖腔拭子样品进行检测,发现检测结果与病毒分离鉴定结果一致。结果表明,本研究建立的RT-dPCR方法具有良好的敏感性、特异性、重复性和准确性,可用于基因Ⅶ.2亚型NDV的快速检测和精准定量,同时也为其核酸标准物质的研制奠定了基础。

反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒

目的探索SARS冠状病毒早期诊断的有效手段。方法对临床病例样品采用反转录巢式PCR方法鉴定SARS冠状病毒。提取样品RNA,用巢式PCR外侧下游引物进行反转录,以反转录产物为模板,进行巢式第一次、第二次PCR。PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行测序鉴定。结果被检样品扩增出特异片段,经测序验证确实来自SARS相关冠状病毒。Blast比较结果与SARS冠状病毒多伦多株相应片段只有一个碱基的差异。结论反转录巢式PCR方法验证在非典型肺炎患者标本中存在SARS相关冠状病毒的序列,证实该法不失为一种检测SARS冠状病毒的快速、简便、易行的方法。

一步反转录PCR技术在检测4种人疟原虫中的初步应用

目的 探讨应用一步反转录PCR（RT-PCR）技术检测4种人疟原虫的可行性和特异性。 方法 取恶性疟（1例）、间日疟（1例）、卵形疟（1例）和三日疟（5例）患者全血，提取疟原虫总RNA和基因组DNA。应用一步RT-PCR和一步实时荧光RT-PCR分别扩增经脱氧核糖核酸酶（DNase）消化的疟原虫RNA样品中的18S rRNA序列，应用普通PCR和一步RT-PCR技术分别扩增不同稀释浓度的疟原虫RNA（未经DNase消化和经DNase消化）和DNA样品中的疟原虫18S rRNA序列和18S rDNA序列，比较2种检测技术可检测到目标序列的样品最低稀释浓度。 结果 患者全血基因组DNA经一步RT-PCR分别扩增出310、394和323 bp条带，测序结果显示分别为恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）、卵形疟原虫（P. ovale）和间日疟原虫（P. vivax）的18S rRNA序列特异性条带，但未扩增出三日疟原虫（P. malariare）特异条带。一步实时荧光RT-PCR结果显示，4种人疟原虫RNA样品均出现相应的荧光信号，除三日疟原虫样品外，各溶解曲线均仅有单一的扩增峰。因4种人疟原虫DNA和RNA原液样品中模板量的差异，一步RT-PCR可检测到的最低稀释浓度从1至10-4不等，但可检测到的DNA样品的最低稀释浓度与未经DNase消化的RNA样品相同或较后者低一个数量级，且两者最低稀释浓度均低于经DNase消化的RNA样品。与普通PCR的检测结果比较发现，同一样品均以一步RT-PCR可检测到的稀释浓度最低，较普通PCR的敏感性提高10～1 000倍。 结论 一步RT-PCR技术可检测出人血液样品中的恶性疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫DNA，但在检测三日疟原虫样品中的适用性有待进一步分析。

反转录PCR技术检测贝类中诺瓦克样病毒的研究

目的:从病毒富集和核酸提取两方面进行探索,旨在建立一个反转录(RT)PCR技术检测贝类中诺瓦克样病毒(NLVs)的方法。方法:利用脊髓灰质炎病毒作为参照毒株,优化甘氨酸缓冲液-聚乙二醇(PEG)病毒浓缩方法;同时比较异硫氰酸胍法、SDS-蛋白酶K法、Trizol-异丙醇法、试剂盒法4种RNA提取方法;对市售贝类样品进行了检测,并利用基因测序对阳性样品进行验证。结果:采用pH9.5甘氨酸缓冲液-16%聚乙二醇病毒浓缩法,病毒的回收率为16.8%;利用Trizol-异丙醇法提取RNA,检出限为8.1×102RT-PCR50/5g贝肉;实际检测贝类样品25件,其中3件样品为阳性,基因测序结果亦证实为阳性。结论:建立了一个灵敏度较高的RT-PCR检测贝类中诺瓦克样病毒的方法。

直接免疫荧光与实时荧光定量反转录PCR检测常见呼吸道病毒抗原比较

目的观察病毒抗原直接免疫荧光检测(direct fluorescence assay,DFA)和实时荧光定量反转录PCR(real-time reverse-transcription PCR,rt-RT-PCR)检测住院儿童鼻咽分泌物呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)和流感病毒(influenza virus,FLU)的一致性。方法应用DFA、rt-RT-PCR方法检测92例呼吸科住院患儿鼻咽分泌物RSV,应用DFA、rt-RT-PCR方法检测162例呼吸科住院患儿鼻咽分泌物FLU-A和FLU-B,比较2种方法检测的阳性率,Kappa检验分析2种检测方法的一致性。结果 DFA检测RSV的阳性率56.5%低于rt-RT-PCR检测RSV的阳性率70.7%(P<0.05),一致性良好(Kappa=0.517);DFA检测FLU-A、FLU-B的阳性率分别为3.7%和7.4%,rtRT-PCR检测FLU-A、FLU-B的阳性率分别为8.0%和15.4%,2种方法检测FLU-A阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05),一致性较差(Kappa=0.168),检测FLU-B阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05),一致性良好(Kappa=0.489)。结论 rt-RT-PCR检测呼吸道病毒的阳性率明显高于DFA,但2种方法的一致性良好,DFA因设备简单适合用于呼吸道病毒的早期诊断。

新城疫强毒特异性反转录荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种敏感性高、特异性强、成本更低的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)特异性反转录荧光定量PCR(reverse transcription fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测方法,基于对所有已知NDVF基因序列特征的分析,设计了一对强毒特异性引物,以体外转录制备的RNA标准品为阳性模板,构建了标准曲线,并对该方法的敏感性、特异性和准确性进行了验证。结果表明,基于SYBRGreenⅠ嵌合荧光技术建立的检测方法能够特异性扩增NDV强毒,最低可检测1拷贝/μL的RNA,用于临床毒株的检测结果与序列测定一致,可作为适合大规模监测NDV强毒的方法和工具。

检测感染鸡体内传染性支气管炎病毒反转录套式PCR方法的建立

根据先前克隆并测定的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(NP)基因序列,设计了2对引物,通过对IBV各毒株(M41,H52,H120,Aust-T以及野毒株等)攻毒鸡的组织中的IBV进行反转录套式PCR检测,结果均为阳性,而对鸡的其他传染病病毒(IBDV,AIV,NDV)进行检测,结果均为阴性。结果表明所建立的反转录套式PCR方法可用于感染鸡体内IBV各血清型毒株的检测。

基因Ⅵ型新城疫病毒反转录数字PCR检测方法的建立与应用

基因Ⅵ型新城疫病毒(NDV)是导致我国当前鸽新城疫流行的主要基因型。国家新城疫参考实验室监测数据表明,鸽NDV分离率近年来有上升趋势。为了实现基因Ⅵ型NDV快速检测和精确定量,针对国内流行的基因Ⅵ型NDV F基因保守区域设计特异性引物和探针,建立了反转录数字PCR(RT-dPCR)方法,并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行了评估。结果显示,建立的RT-dPCR方法线性关系良好,灵敏度高,最低检测限为1.97 copies/μL;特异性强,与其他基因型NDV强毒株和常见禽病病毒无交叉反应;重复性好,变异系数为2.2%。利用本方法对临床采集的180份鸽口咽/泄殖腔拭子样品进行检测,检测结果与病毒分离结果一致。以上结果表明,本研究建立的RT-dPCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于基因Ⅵ型NDV的快速检测和精准定量,同时也为基因Ⅵ型NDV核酸标准物质研制奠定了基础。

反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒

目的 探索SARS冠状病毒早期诊断的有效手段。方法 对临床病例样品采用反转录巢式PCR方法鉴定SARS冠状病毒。提取样品RNA,用巢式PCR外侧下游引物进行反转录,以反转录产物为模板,进行巢式第1次、第2次PCR。PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行测序鉴定。结果 被检样品扩增出特异片段,经测序验证确实来自SARS相关冠状病毒。Blast比较结果与SARS冠状病毒多伦多株相应片段只有一个碱基的差异。结论 反转录巢式PCR方法验证在非典型肺炎患者标本中存在SARS相关冠状病毒的序列,证实该法不失为一种检测SARS冠状病毒的快速、简便、易行的方法。

Taq plusⅠ DNA聚合酶的反转录活性

选择具有高保真性的Taq plusⅠ DNA聚合酶,以小鼠表皮生长因子mRNA为模板研究其反转录性能。对cD-NA的检验结果表明,Taq plusⅠ DNA聚合酶在72℃下有良好的反转录活性,且由于其高保真性,故在进行反转录时既可避免碱基错配,又可避免在低温下用AMV反转录酶或Mulv反转录酶进行反转录时可能造成的cDNA序列缺失。

半巢式反转录实时荧光PCR检测马铃薯黑环斑病毒

本研究根据基因组中RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)保守序列,设计合成了3条巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针,建立了半巢式反转录实时荧光PCR检测PBRSV的新方法。该方法采用E.Z.N.ATM快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR和TaqMAN探针检测技术。第二步半巢式反转录实时荧光PCR既是对第一步信号的进一步放大,也是对第一步PCR产物的确认,因此,检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Realtime PCR等方法高。实验结果表明,该方法检测灵敏度可达300fg/μL植物总RNA。

反转录-PCR扩增鸡免疫球蛋白可变区基因的研究

用异硫氰酸胍与 β -巯基乙醇联合变性的方法 ,从鸡脾脏中提取总RNA。各选用一对引物 ,通过反转录—PCR的方法 ,扩增鸡重链可变区和轻链可变区基因 ,扩增产物分别显示了约 36 0bp。