发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

目的制备发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)核衣壳蛋白(NP)的单克隆抗体,并探讨其在该病诊断中的作用。方法克隆NP基因,构建原核表达载体pComb3XSS-NP,并转化大肠杆菌Top10F′,经诱导表达,纯化获得6HIS-NP融合蛋白。以该融合蛋白免疫Balb/c小鼠,经杂交瘤技术制备NP的鼠源单克隆抗体。经鉴定后,选择1株1C8-C6进行大量制备、纯化,并偶联辣根过氧化物酶(HRP),用该酶标抗体对SFTSV感染人的急性期血清进行Western blot检测。结果成功表达、纯化SFTSV重组的NP。经小鼠免疫、细胞融合和ELISA筛选后,共获得4株鼠源单克隆抗体。具较高滴度的1C8-C6酶标抗体能与SFTSV感染人的急性期血清中的NP在Western blot水平上结合,而与汉坦病毒、登革热病毒感染人急性期血清及正常人血清不反应。结论 SFTSV NP的表达及其单抗的制备为该病的实验室诊断奠定了基础。

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒Gn和Gc蛋白的分段表达

目的分段表达发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)Gn和Gc蛋白。方法采用PCR方法克隆了SFTSV Gn和Gc基因上三段相互重叠的基因片段Gn1、Gn2、Gn3、Gc1、Gc2、Gc3,将PCR产物分别连接到原核表达载体pET28a(+)上,经酶切、PCR、测序鉴定,获得重组质粒pET28a-Gn(Gn1)、pET28a-Gn(Gn2)、pET28a-Gn(Gn3)、pET28a-Gc(Gc1)、pET28a-Gc(Gc2)、pET28a-Gc(Gc3),将其分别转化感受态菌BL21,IPTG诱导表达,通过Western blot鉴定Gn1、Gn2、Gn3、Gc1、Gc2、Gc3蛋白的表达。结果成功构建重组质粒pET28a-Gn(Gn1)、pET28a-Gn(Gn2)、pET28a-Gn(Gn3)、pET28a-Gc(Gc1)、pET28a-Gc(Gc2)、pET28a-Gc(Gc3),Western blot可见Gn1、Gn2、Gn3、Gc1、Gc2和Gc3编码蛋白的成功表达。结论 Gn和Gc蛋白的分段表达成功,为进一步深入研究SFTSV的Gn和Gc蛋白结构与功能及精确定位其抗原表位奠定了基础。

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒核蛋白的原核表达与鉴定

目的:构建发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)核蛋白(NP)基因的原核表达载体,获得纯化并具有抗原性的重组表达蛋白。方法:提取病毒RNA,逆转录为cDNA后PCR扩增得到目的片段;通过连接pMD18-T构建克隆载体,测序正确后连接至原核表达载体pMAL-c2x中,转化大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达、纯化MBP-NP融合蛋白。采用SDS-PAGE、Western blot对融合蛋白进行分析;建立间接ELISA方法对SFTSV患者血清NP抗体进行检测。结果:成功构建了NP基因的原核表达载体pMAL-c2x-NP,通过优化表达条件获得了纯化的带MBP标签的融合蛋白,经免疫印迹杂交证实重组蛋白具有抗原性。用建立的ELISA方法检测96例SFTSV患者血清,阳性率为40.6%;实时荧光定量RT-PCR方法阳性率为55.2%,两者符合率为77.1%(Kappa=0.550,P<0.001)。结论:成功构建了SFTSV NP基因的原核表达系统,诱导表达了具有抗原性的MBP-NP融合蛋白,为进一步研发SFTSV的ELISA诊断试剂盒奠定了基础。

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒研究进展

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒是一种新型布尼亚病毒,其研究结果在《新英格兰医学杂志》上发表之后,引起了国内外学者的高度重视。从病原学、流行病学特征、临床表现、实验室诊断和治疗等方面重点介绍新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征。

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒规模化生产培养工艺的建立

目的通过对发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（简称“新布尼亚病毒”）进行规模化生产培养工艺研究，为新布尼亚病毒规模化生产提供有力支持。方法采用细胞工厂培养Vero细胞，待其长成致密单层后，取工作种子批新布尼亚病毒毒种接种细胞，采用连续收获或细胞病变充分时收获培养液上清的方法收获病毒，并以病毒滴度、抗原含量作为评价指标选择基础培养基、培养基pH、人血白蛋白添加浓度、接种细胞日龄、接种病毒MOI以及病毒培养温度。结果按0．01-0．001MOI接种3-4日龄Vero细胞，病毒培养液选择含0．3％人血白蛋白pH7．6-7．8的DMEM溶液，35℃培养7d收获，病毒收获液病毒滴度7．87LgCCID50／mL、抗原含量170．1μ/mL。结论初步建立了新布尼亚病毒规模化生产培养工艺，为后续工业化生产提供了数据支持。

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒非结构蛋白NSs的原核表达及初步鉴定

目的克隆、表达发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)非结构蛋白NSs,对其功能初步鉴定。方法采用PCR法扩增经密码子优化后的SFTSV NSs基因,并克隆至PGEX-4T-2载体中,构建原核表达载体PGEX-4T-2-NSs,经酶切、测序鉴定后转化表达菌BL21(DE3),再经诱导、纯化得到谷胱甘肽S-转移酶(GST)-NSs融合蛋白,用Western Blot验证融合蛋白GST-NSs的抗原性。结果成功构建了GST-NSs融合蛋白原核表达载体,并在BL21细菌中获得高效表达;纯化后的融合蛋白具有良好的抗原性。结论实现了SFTSV重组NSs蛋白的原核高效表达,为进一步深入研究其结构与功能奠定了基础。

无血清细胞培养在发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒生长中的应用

目的建立无血清培养基培养Vero细胞制备发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV)的工艺。方法分别采用含10%牛血清的MEM(10%MEM培养基)和无血清M2培养基(SF-M2培养基)在方瓶中培养Vero细胞制备SFTSV,比较无血清与含血清培养基培养Vero细胞制备SFTSV在病毒滴度及病毒繁殖曲线之间的差异。在生物反应器里用无血清培养的方式进行工艺放大,收获病毒原液并进行检定。结果无血清培养的Vero细胞能够满足SFTSV培养需求,与含血清细胞培养相比,单位细胞病毒产量没有降低,达到30~60个活病毒/细胞。可以实现在生物反应器的工艺放大,病毒高峰时病毒滴度均在7.0lg PFU/m L以上。结论无血清细胞培养可以应用于SFTSV的培养,有利于降低疫苗生产过程中的纯化难度,提高疫苗安全性。

新型布尼亚病毒载量联合血小板计数、凝血酶时间对发热伴血小板减少综合征患者预后的临床价值研究

目的探讨新型布尼亚病毒(SFTSV)载量联合血小板计数(PLT)、凝血酶时间(TT)在发热伴血小板减少综合征(SFTS)患者预后中的临床价值。方法选取SFTS患者100例,根据预后情况分为生存组(n=77)和死亡组(n=23),比较生存组和死亡组患者临床一般资料、症状、PLT、凝血指标及SFTSV载量差异,并分析其对患者预后的影响。结果死亡组发热持续时间长于生存组,差异有统计学意义(P<0.05);死亡组发生消化道出血、神志改变、肾功能损害、心脏功能损害和弥散性血管内凝血(DIC)患者占比高于生存组,差异有统计学意义(P<0.05);死亡组PLT低于生存组,而TT和活化部分凝血活酶时间(APTT)长于生存组,差异有统计学意义(P<0.05);死亡组SFTSV载量的拷贝数对数值≥5的患者占比高于生存组,差异有统计学意义(P<0.05)。Logistic回归分析显示,消化道出血、肾功能损害、心脏功能损害、DIC、PLT、TT和SFTSV载量是患者死亡的影响因素(P<0.05),基于此构建的方程预测患者死亡的受试者工作特征(ROC)曲线的曲线下面积为0.919(95%CI:0.860~0.977),灵敏度和特异度分别为95.70%和81.80%。结论SFTS患者预后受消化道出血、肾功能损害、心脏功能损害、DIC、PLT、TT和病毒载量因素的影响,且基于影响因素构建的方程在预测患者预后方面有一定价值。

家养动物体表蜱中发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒分离及鉴定

为了解发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)的传播机制,采集了山东疫区家养牛、羊和狗等动物体表蜱,分类鉴定后,通过Real-time PCR筛查、病毒分离培养和基因组序列分析等方法分离鉴定蜱中的病毒。所采集的蜱,以长角血蜱为主,占91.4%。其中3头SFTSV核酸检测阳性,阳性率为2.14%,并在其中一份羊体表蜱标本中分离到SFTSV病毒,命名为SDLZTick12。序列分析显示与我国在不同省份患者标本中分离的病毒全基因序列具有高度同源性,且病毒的抗原性和生长特性与人源病毒相同。本研究首次在山东疫区蜱中分离到新型布尼亚病毒,并与人源病毒进行了系统比较研究,提示蜱可能为该新病原体的传播媒介,对疾病的防控具有重要的指导意义。

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒结构和非结构蛋白表达研究

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)是我国2010年新发现的新布尼亚病毒,可导致人类严重发热伴血小板减少综合征。SFTS新布尼亚病毒全基因组已解析,但病毒分子生物学结构蛋白特征及功能尚需更多研究。本文通过蔗糖密度梯度离心确定发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(HB29株)病毒颗粒的沉降密度及超离纯化条件,得出该病毒颗粒在蔗糖中的沉降密度为1.135g/mL。利用PCR方法扩增SFTSV病毒株HB29株病毒RNA聚合酶(RdRp)、糖蛋白前体蛋白(M)、包膜糖蛋白(Gn)、包膜糖蛋白(Gc)、核蛋白(NP)及非结构蛋白(NSs)的编码区基因片段,分别克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT或VR1012,在293T细胞上获得上述基因表达。通过SDS-PAGE分析纯化病毒颗粒和重组蛋白,并通过免疫印迹(Western blotting)和间接免疫荧光(IFA)确定蛋白活性和分子量。本研究结果将有利于对新布尼亚病毒分子生物学特征的认识,为后期研究提供基础。

江苏省发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒血清流行病学调查

目的调查江苏省人与动物发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)血清流行病学情况,为控制疫情提供流行病学线索。方法 2010年7-11月在江苏省南京江宁区、溧水县,常州溧阳市,无锡宜兴市,淮安盱眙县和连云港东海县共采集2853份血清,其中人血清1922份、动物(犬、羊、猪、牛、鹅、鼠和鸡)血清931份,运用双抗原夹心ELISA法检测血清中SFTSV总抗体,并进行不同地区SFTSV总抗体阳性率比较。结果本次调查2853份血清样本中SFTSV总抗体阳性血清121份,阳性率为4.24%,提示江苏省存在SFTSV的流行。在7种被调查的动物样本中,5种动物(犬、羊、牛、猪、鸡)血清样本SFTSV总抗体阳性,阳性率分别为6.40%、57.14%、31.82%、5.33%和0.98%;人血清中SFTSV总抗体阳性率为0.94%。血清中SFTSV总抗体阳性率存在地区差异。人群与动物SFTSV血清总抗体阳性率存在正相关关系。结论江苏省是SFTSV的流行区域,需加强SFTSV的预防意识及诊断能力。

浙江省发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒的宿主媒介调查

目的调查浙江省发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)传播媒介蜱和宿主鼠形动物的种群分布、季节消长及其带病毒情况。方法 2013年分4个季度在浙江省7个市(县)采取人工布旗法和动物体表采集法采集游离蜱和寄生蜱;用鼠笼法捕获鼠形动物,取肝、脾标本;用RT-PCR方法检测SFTSV核酸。结果共捕蜱751只,隶属于1科6属10种,其中长角血蜱为优势蜱种,占58.5%(439/751),不同县(区)蜱种类分布不完全相同(χ2=1198.409,P<0.05)。3-10月为蜱的活动期,第二季度为蜱的活动高峰期。共捕获鼠形动物1078只,其中啮齿动物3科7属13种,食虫目动物2科2属2种;黑线姬鼠和黑腹绒鼠分别占捕获总数的32.9%(355/1078)和30.2%(326/1078),不同地区的鼠种构成不同(χ2=1623.480,P<0.05)。蜱及鼠形动物标本新布尼亚病毒核酸检测均为阴性。结论浙江省具有SFTSV媒介蜱及宿主鼠形动物的分布,但其传播媒介和可能宿主需要进一步调查研究。

浙江省一株发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒分离株全基因组测序及分子进化分析

目的 对一株发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（SFTSV）浙江分离株进行全基因组测序和分子进化分析.方法 从浙江省CDC采集1例SFTSV感染疑似病例的急性期全血标本,提取标本的病毒RNA并用荧光定量RT-PCR方法检测,分离得到SFTSV分离株.RT-PCR扩增覆盖全基因组的17个重叠基因片段,使用Geneious基因分析软件对测序结果进行剪辑和拼接.从GenBank 数据库中获取各地SFTSV全基因组序列,采用RAxML软件及MEGA软件对分离株基因组核苷酸序列与GenBank已经公布的SFTSV核苷酸序列和白蛉病毒属部分其他病毒进行比对,并构建进化树,进行同源性分析.结果 荧光定量RT-PCR鉴定该疑似病例为阳性,并成功分离获得SFTSV毒株,命名为Zhejiang/01/2011株.对Zhejiang/01/2011株进行RT-PCR扩增并测序拼接得到全基因组cDNA序列,Zhejiang/01/2011株基因组核苷酸序列共有S、M、L3个片段.其中S片段为1 745个核苷酸,M片段为3 378个核苷酸,L片段为6 368个核苷酸.分子进化分析结果显示,Zhejiang/01/2011株与Japan/SPL004A/2013株相似性最高,其中S片段相似性为98％,M片段为97％,L片段为98％.白蛉病毒属基于3个片段分子系统进化树均显示,Zhejiang/01/2011株与白蛉病毒属部分病毒株中所有的SFTSV病毒株聚集在一起.结论 笔者成功对Zhejiang/01/2011株进行了测序和分子进化分析.Zhejiang/01/2011株是SFTSV,属白蛉病毒属,且其与日本分离株在同一分支,相似性较大,与国内其他地区分离株不在同一分支,差异较大.

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒核衣壳蛋白优势线性B细胞抗原决定簇的预测与确定

为了确定发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)核衣壳蛋白(N蛋白)的优势线性B细胞抗原决定簇位点,本文根据线性B细胞抗原表位拥有较强的抗原性、亲水性以及表面性等特点,运用生物信息学软件分析SFTSV N蛋白的氨基酸序列,预测潜在的线性B细胞抗原决定簇位点。根据已解析的SFTSV N蛋白晶体结构,使用PyMOL软件分析预测出的线性B细胞抗原决定簇位点的柔性及其在整个SFTSV N蛋白中的分布情况。人工合成相应多肽片段并以其为抗原,与SFTSV临床感染者的血清反应,采用多肽-酶联免疫吸附检测法检验多肽片段的免疫原性。结果共预测出六个可能的线性B细胞抗原决定簇位点,即A(40-KKLKETGGDDWVKDTK-55)、B(71-ASGKMSNSGSKRL-83)、C(94-ERAETRL-100)、D(135-LKVENYPP-142)、E(157-GVSEATT-163)和F(184-KMRGASKTEVYNSFRDP-200),均位于N蛋白表面且含有柔性较大的loop区。相应的六段人工合成多肽都与SFTSV临床病例血清呈阳性反应,确定它们均为优势线性B细胞抗原决定簇位点,其各自检测结果与商品化N蛋白抗体检测试剂盒相应检测结果进行线性回归分析表明呈正相关。综合运用上述多种方法,本研究成功地预测并确定了SFTSV N蛋白的线性B细胞抗原决定簇位点,为该病毒抗原特异性的分子基础研究以及相关疾病的诊断和治疗奠定了基础。

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒微复制子的建立

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)是我国新发现的一种布尼亚病毒,可引起人类严重发热伴血小板减少综合征。我们利用RNA聚合酶Ⅰ体系,分别构建SFTSV三个片段L、M、S微复制子,研究其非编码区调控功能。将报告基因绿色荧光蛋白(GFP)或荧光素酶(Luciferase)分别插入SFTSV三个片段5′和3′非编码区之间,所形成的嵌合cDNA反向插入含RNA聚合酶I的表达载体pHH21中,获得SFTSV微复制子重组质粒L-GFP-pHH21、M-GFP-pHH21、S-GFP-pHH21、L-Luc-pHH21、M-Luc-pHH21和S-Luc-pHH21,分别与成功表达SFTSV聚合酶蛋白(L蛋白)和结构蛋白(N蛋白)的质粒VR1012-L和VR-1012-NP共同转染293T细胞,24～48h后观察GFP表达情况或检测萤光素酶表达量。L、M、S片段GFP微复制子均可观察到特异性绿色荧光。荧光素酶定量结果显示其在不同节段非编码区中的表达量不同,提示SFTSV三个节段的非编码区启动微复制子转录和复制的强度不同。

中国发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒致病性研究进展

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)隶属于布尼亚病毒科白蛉病毒属,近年来已在中国十余省市发生了蜱叮咬感染该病毒病例,至数十人死亡。SFTSV病毒颗粒呈球形,主要分布在感染细胞的微粒体,表面有棘突,其基因组由大、中、小3个单股负链RNA片段组成,分别编码RNA聚合酶,病毒膜蛋白和非结构蛋白。感染后临床表现为发热、恶心呕吐,多数患者很快出现外周血血小板减少,肝肾等器官功能受损等症状。本文综述了新型布尼亚病毒病原学、所致疾病、感染和免疫应答以及检测的国内外研究进展,为该病毒感染的早期快速诊断、对症治疗和疾病预防等工作提供参考。

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒研究进展

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV）是2006年以来在中国中东部农村地区引起出血热疾病的新病毒性病原体，直至2010年，我国学者对其进行分离培养，电镜观察和基因组测序分析后最终确定其为布尼亚病毒科白蛉病毒属的一个新成员。迄今为止，其传播宿主和动物宿主尚不明确，蜱被认为是最有可能的传播宿主，家养动物包括羊、牛、狗等是SFTSV可能的扩大宿主。

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒的研究进展

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)是一种新发现的布尼亚病毒,人类感染后表现为发热、白细胞及血小板减少、多器官功能衰竭等临床症状。本文就SFTSV病原学特征、发病机制及机理、流行特征、传播媒介等方面展开综述。

一株发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒的分离鉴定及其生长特性研究

目的探索疑似发热伴血小板减少综合征病例中病原体的分离鉴定,了解病毒生长特性。方法利用非洲绿猴肾细胞Vero E6从患者抗凝血标本中分离发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV),并通过血清学、形态学等方法对病毒进行鉴定;将分离的病毒接种不同细胞,利用荧光定量PCR检测不同时间细胞上清中病毒载量的变化。结果从患者抗凝血标本中分离出SFTSV;免疫荧光显示感染病毒的细胞培养物能与患者血清发生阳性反应;在透射电镜下能观察到布尼亚病毒样颗粒。SFTSV可感染Vero E6、Hep G2、THP-1等多种细胞,但病毒在不同细胞中的复制水平差异明显。其中Vero E6细胞对SFTSV较易感,病毒可增殖至4.89×109copy/ml。而Hep-2和HT29细胞不能被SFTSV感染。结论从疑似发热伴血小板减少综合征病例血液标本中成功分离出SFTSV。该病毒具有较广泛的细胞嗜性,对肾来源的细胞更易感。这些研究将为后续研究SFTSV的相关基础研究提供重要的线索。

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒研究进展

发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)是一种急性传染性疾病,由布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV)感染所致,该新病毒隶属于布尼亚病毒科白蛉病毒属,2009年在中国首次被发现,近年来已在大半个中国地区流行传播,致数千人患病甚至死亡,平均病死率约10%,陆续地在韩国、日本和美国也有类似疫情报道。该疾病主要临床症状表现为高热、厌食、肌肉痛、寒战、淋巴结肿大、白细胞降低、血小板减少和多器官功能衰竭等。SFTSV的基因组由大(L)、中(M)、小(S)3个单股负链RNA片段组成。为更详细地了解SFTSV,本文针对其病原学特征、流行病学特征、早期检测方法和临床诊断以及疾病预防等方面对近年来的有关研究进行了整理和综述,以期对发热伴血小板减少综合征(SFTS)的预防和治疗提供理论依据。