丝状真菌表达分泌系统中受体菌的构建

黑曲霉糖化酶高产菌株T2 1经紫外诱变后 ,通过酪蛋白平板和蛋白酶活性测定筛选出胞外酸性蛋白酶活力仅为原株 0 76 %的菌株A .nigerT2 1 2 0 1,其生长特性和产糖化酶活力与原株基本一致。利用原生质体 PEG法将含有报告基因vhb的表达分泌质粒pGT10 vhb通过与选择标记质粒的共转化导入此蛋白酶部分缺陷株及其原株T2 1,检测在蛋白酶缺陷株AspergillusnigerT2 1 2 0 1和原株T2 1中VHb的分泌表达 ,结果表明在A .nigerT2 1 2 0 1中VHb表达水平显著高于原株 ,但Northernblot却显示在两菌株中vnb基因的转录水平近似 。

短小芽孢杆菌作为芽孢杆菌属基因工程受体菌的研究

以质粒pUB110 DNA转化B. pumilus 289原生质体,转化频率为10^(-3)—10^(-9)与B.tubtilis 168系统相当;但B.pumilus 289原生质体的再生频率(0.3—12.0％)略低于B.subtilis 168(1.53—24.16％);在无选择压力条件下质粒pUB110在B.pumilus 289中经过45个世代周期,自发丢失率小于3％,同于B.subtilis 168系统。外源基因在B.pumilus 289中经25个世代周期丢失率低于5％,而在B.subtilis 168系统中则高达24％;外源基因的表达水平亦高于B.subtilis 168系统。因此,B.pumilus 289是一个值得进一步开发的基因工程受体系统。

乳酸乳球菌作为基因工程受体菌研究进展

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是一种"公认安全"的革兰氏阳性细菌,广泛存在于人、畜的肠道中并发挥许多重要的生理功能。由于它兼具安全性与益生性,近几年来研究者们开始关注用乳酸乳球菌作为受体菌来表达外源蛋白。随着生物技术的发展,人们对乳酸乳球菌基因表达及调控过程的认识不断深入并构建了一系列表达,成功地表达了许多外源蛋白,初步展示出良好的应用前景。主要对近年来国内外将乳酸乳球菌作为外源蛋白表达受体菌方面的研究进展做简要综述。

乳酸菌受体菌株的筛选、鉴定及特性研究

从乳酸菌保健品中分离筛选到一株能作为受体菌的乳酸菌菌株COCC101,经鉴定为粪肠球菌(Enterococcusfaecali)。抗药性实验显示这株粪肠球菌对多数药物敏感或中度敏感;粪肠球菌中没有质粒存在,转化效率和电场强度有对应的正相关,最高达到2×104转化子/μgDNA,并且能广泛接受不同来源的质粒;在Nisin诱导下可表达外源的绿色荧光蛋白(GFP)。这些结果显示COCC101菌株在乳酸菌基因工程研究中有望成为受体菌。

有益芽胞杆菌受体菌研究

采用酸性茚三酮法测定了 30株有益芽胞杆菌的赖氨酸产量 ,然后在不同的溶菌酶浓度下 ,对赖氨酸产量超过 0 .0 7g/ L 的 2 1株菌进行原生质体转化质粒 p UB110 ,测定原生质体形成率、原生质体再生率及转化频率 ,结果 6 10 3,6 10 4,6 12 0 ,6 12 9四株菌的转化频率较高。然后 ,采用经典遗传学方法选育AEC抗性突变株 ,使赖氨酸积累提高。其中 ,B.licheniformis 6 10 4诱变菌株 6 10 40 1能积累赖氨酸 2 .91g/L,比出发菌株提高了 17倍左右 ,转化率也提高了一个数量级。通过质粒的再转化试验及传代稳定性试验 ,进一步证实 B.licheniformis 6 10 4及其突变菌株 6 10 40 1是较好的受体菌 ,尤其是用于赖氨酸合成酶基因的表达。

瑞氏木霉外源基因表达系统中受体菌株的改造

将解除了葡萄糖阻遏的纤维素酶高产菌株瑞氏木霉TrichodermareeseiRutC30经EMS诱变后,在酪蛋白平板上筛选出部分蛋白酶缺陷突变菌株T.reeseiRutC30M3。RutC30M3的胞外蛋白酶活力比亲本株降低约74%,但生长特性、产纤维素酶活力等性状与亲本株相同。用携带潮霉素磷酸转移酶基因(hph)的表达质粒pAN7-1分别转化瑞氏木霉RutC30和RutC30M3原生质体,转化结果显示RutC30M3(pAN7-1)对潮霉素的抗性比RutC30(pAN7-1)提高约20%,而Northernblot分析结果显示在两菌株中潮霉素基因转录水平相似,由此证明宿主菌蛋白酶缺陷对保护重组蛋白免于降解有明显作用。蛋白酶缺陷菌株RutC30M3适于作为瑞氏木霉外源基因表达系统中的受体菌株用于大量生产同源与异源蛋白。

益生菌作为基因工程受体菌的研究

1.前言 20世纪90年代后期,国内外学者开始应用基因工程技术有目的、有选择地研制新一代微生态制剂.换句话说,就是正常菌群作为外源基因表达受体,尤为双歧杆菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌、酵母菌作为工程菌的受体,通过分子克隆、基因重组技术,将外源基因(某种营养因子基因、抗性基因、酶基因等)转入构建的新菌株,使其表达外源蛋白,直接添加到饲料中或者让构建的新菌株再回到肠道内,在肠道内生长繁殖,除发挥原有的益生功能,还能发挥特殊基因的功能,达到一种制剂多种功能的目的.

酵母基因克隆受体菌的构建

近年来,一些国家的实验室采用酵母菌重组DNA技术将外源淀粉酶基因引入酿酒酵母中,构建成具有分解淀粉能力的工程菌株,其中酵母糖化酶基因是重要的来源之一。大部分酿酒酵母携带糖化酶基因的抑制基因(INH1),为了在酿酒酵母中克隆和表达糖化酵母糖化酶基因(STA),需要构建适宜的受体菌,其遗传标记应为trp1/leu2 sta°inh°。

基于大肠杆菌受体菌DH5α △asd缺失株的构建及作为基因转化、表达操作系统的评估

基于大肠杆菌(E.coli)染色体上asd基因的已知序列,利用λ噬菌体的Red同源重组系统一步法构建E.coliDH5α的asd基因缺失突变株DH5α△asd::cat,在二次重组中利用携带能够表达FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20介导二次同源重组,以去除上述缺失突变株中氯霉素抗性筛选基因。结合PCR扩增和测序结果,证明DH5α△asd缺失突变株的正确构建。该缺失突变株失去了在普通LB培养基上生长的能力,只有添加DAP或导入表达asd基因的质粒(asd基因互补试验)才能在LB培养基上生长,与原型DH5α比较,其生长速度和生长对数期、接受不同拷贝数质粒的转化效率几乎相一致。基于该缺失突变株构建出以asd营养基因为标志的大肠杆菌染色体-质粒平衡致死系统。体外培养连续传代50代次,pnirBMisL-fedF-asd质粒不丢失,并功能性表达F18大肠杆菌黏附素FedF。

强力霉素抗性基因目标供体菌、受体菌和接合子的筛选及鉴定

目的为进一步研究环境中病原微生物目标供体菌强力霉素抗性基因(Dox)水平传播机制奠定基础。方法以强力霉素抗性基因为筛选指标,通过药敏试验从7个菌株中筛选出遗传型分别为Dox^RX^S的候选供体菌和Dox^SX^R的候选受体菌(X代表不是强力霉素的抗生素),将供、受体菌共培养后筛选出遗传型为Dox^RX^R的接合子。分别测定X对目标供体菌、Dox对目标受体菌的最小抑菌浓度。对目标供、受体菌从形态学、生理生化、分子生物学和BIOLOG方面进行鉴定。结果研究的7个病原菌均为多重耐药,最多能耐受15种抗生素,对链霉素、萘啶酮酸和磺胺二甲嘧啶的耐药率最高(100%),对庆大霉素、诺氟沙星和环丙沙星的耐药率最低(0%)。目标供体菌、受体菌和接合子Con-Ⅱ基因型分别为Dox^RKan^S、Dox^SKan^R和Dox^RKan^R。Kan对目标供体菌的最小抑菌浓度为0.310 0μg/mL,Dox对目标受体菌的最小抑菌浓度为0.048 8μg/mL。目标供体菌(Dox^RKan^S)鉴定为Escherichia coli O157:H7(E.coli O157:H7),目标受体菌TR-M30-1(Dox^SKan^R)鉴定为产酸克雷伯菌。结论目标供体菌为E.coli O157:H7(Dox^RKan^S),目标受体菌为TR-M30-1(Dox^SKan^R),接合子为Con-Ⅱ(Dox^RKan^R)。

苏云金芽胞杆菌受体菌株的筛选及电转条件的优化

利用电脉冲法转化法,从150株苏云金芽胞杆菌野生菌中筛选出转化效率较高的编号为2331的野生菌,并对其最优的电转条件进行了研究。结果表明,用SG作为电脉冲缓冲液,在一次电脉冲条件下3.8ms,用7KV/cm脉冲场强以及采用对数前期(OD600nm为0.2～0.3)收获的受体菌,可以达到最高转化频率1.12x104。

苏云金芽孢杆菌无晶体突变株的逐级升温筛选及其转化性能

逐级从４２ ℃到４４ ℃和４６ ℃升温培养、并用０－０５ ％ ＳＤＳ 处理苏云金芽孢杆菌ＹＢＴ１４６３ ，获得了一系列内生质粒被部分或完全消除的无晶体（Ｃｒｙ －） 突变株，对４ 种Ｃｒｙ － 突变株的转化性能及导入的外源质粒的稳定性进行了研究。用限量培养基和４２ ℃培养筛选到Ｃｒｙ － 突变株后，升温至４４ ℃，从Ｃｒｙ － 突变株得到内生质粒被进一步消除的突变株；然后升温至４６ ℃来培养其中突变株ＢＭＢ１７０ ，并用０－０５ ％ 的ＳＤＳ进行处理，最终筛选到１ 株无质粒突变株ＢＭＢ１７１ 。用ｐＨＴ３１０１ 、ｐＢＭＢ１７３６ 、ｐＢＴＬ１ 和ｐＨＶ１２４９ 等４ 种外源质粒进行的转化及稳定性研究表明，转化频率的大小及导入质粒的稳定性与用作受体菌的Ｃｒｙ － 突变株携有的内生质粒数之间呈现一定的相关性，Ｃｒｙ－ 突变株的转化频率显著高于出发菌株，其中ＢＭＢ１７１ 的转化频率最高达１０７ 转化子／μｇ ＤＮＡ，且所导入的外源质粒的稳定性也高于其它Ｃｒｙ － 突变株及出发菌株ＹＢＴ１４６３ 。

与HEp-2细胞粘附现象相关的大肠杆菌O157基因的发现

将产志贺毒素大肠杆菌O157∶H7菌株97094培养于含有不同质量浓度的萘啶酮酸(nalidixicacid,NA)的麦康凯(MacConkey)琼脂平板上,获得对NA有抗性的菌株。用含有自杀性质粒pRT733的供体菌SM10λpir(携带转座子TnphoA)和抗萘啶酮酸的97094菌株做接合试验,使转座子TnphoA转入受体菌97094,经过约200个接合试验,有503个菌株在含有Km、NA、XP的LB琼脂平板上形成蓝色菌落,说明在这些菌株中形成了phoA融合基因,并能表达phoA基因。在这503个Kmr,NAr变异体中,有6株完全失去了对HEp-2细胞的局灶型粘附(localadherence,LA)现象。对构建的6株大肠杆菌O157TnphoA变异体,克隆TnphoA及其两侧的大肠杆菌O157DNA序列,用根据TnphoA融合接点处的phoA的DNA序列设计合成的寡核苷酸引物,对各克隆中TnphoA上游的大肠杆菌O157的DNA片段部分进行测序,测序结果做BLAST搜索,发现有4个变异体的TnphoA插入到已知的大肠杆菌O157紧密素基因eae中,有2个变异体的TnphoA分别插入到eae之外的核苷酸序列中,分别插入到一个功能未知的菌毛分子伴侣基因和一个功能未知的Z4182基因的上游。这项研究表明,除紧密素外,大肠杆菌O157尚有其他因子参与对真核细胞的粘附。

从A型产气荚膜梭菌C57-1中发现β2毒素基因

为了进一步研究A型产气荚膜梭菌C571株的遗传学背景,应用聚合酶链式反应(PCR)技术,从该菌株中扩增出大小为726bp的β2毒素基因(cpb2基因)的部分序列,并将其克隆入pMD18-T载体中。转化至受体菌DH5α后,经Amp/IPTG/X-Gal选择培养,提取质粒,筛选阳性重组克隆。核苷酸序列分析证实,该基因片段与文献报道的β2毒素基因序列一致。

3株致病性鸡大肠杆菌P型菌毛结构基因的克隆、序列测定及同源性分析

用鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的基因组DNA做为模板,PCR分别扩增出了0.55kb的P型菌毛结构基因(papA)。将扩增得到的3个papA基因片段分别克隆进pGEM-T○R载体中,转化至受体菌JM109中,用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选法,得到含阳性重组子的菌株,提取质粒后用BamH和Sal双酶切进行鉴定。所得阳性重组子进行DNA序列测定,测序结果经DNAStar核酸分析软件包分析比较,结果表明,所构建的克隆质粒中均含有相应完整papA基因,其开放式阅读框架大小为549bp,编码182个氨基酸。此3株菌的P型菌毛结构基因的同源性为98.9%～100%,其中O1株和O78株的P型菌毛基因的ORF序列100%相同,O2株有2个碱基与前两者不同。

焦化废水中细菌质粒的研究

细菌质粒中常带有一些可编码降解特殊有毒物质酶的基因,为了研究质粒对有毒物质CN-的降解的意义,主要调查了焦化废水中好氧异养菌的质粒分布特点。从山西省焦化企业公司生化站、太原煤气公司焦化厂生化站中筛选出53株细菌,利用琼脂糖凝胶电泳法,采用GDS8000型凝胶电泳分析仪进行拍照,同时测定各菌株降氰、降酚能力,CN-采用异烟酸吡唑啉酮法,酚采用4氨基安替比林法测定。结果表明,质粒的存在与降氰力有一定的关系,但对降酚力的影响差异不显著。同时,通过对其中11#号菌株进行了质粒转化和消除实验,证明质粒稳定,不可用十二烷基磺酸钠(SDS)消除掉,用E.ColiDHI作受体菌,用11#菌株作供体菌,作转化实验,但由于种种原因,没有筛选到转化子。

栗疫菌弱毒力的转化及转化菌株的毒力测定

采用配对转化和室内、大田接种的方法研究栗疫菌低毒力的传递和生防潜力。从12个配对菌株中得到了6个转化菌株,不同的dsRNA供体菌和受体菌配对转化的效率不同,转化率从0到100%不等。室内枝段接种和大田接种测定的毒力表明,6个转化菌株、12个供体菌株、6个不能转化的受体菌+供体菌、6个转化菌株+供体野生型菌株处理的相对毒力都在80%以下,4者之间没有显著性差异,比12个受体菌和12个供体野生型菌株的毒力都低,表现弱毒力或中等毒力。前4者与后2者的差异都达到极显著水平,而供体野生型菌株的毒力(相对毒力72.73%-108.69%)与受体菌的毒力差异不显著。实验表明低毒力菌株的生防潜力比预期的高。

酵母α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达

酵母编码α-半乳糖苷酶的基因MEL1被扩增并克隆到表达载体pRSET中.重组质粒pRSET Gal转化至相应的受体菌BL21(DE3)PlysS,阳性克隆经液体培养和IPTG诱导表达.通过SDS PAGE分析,在50kD处有一目的分子大小的亮带.裂解细菌后经X α Gal的显色底物反应,液体变蓝.试验表明:α-半乳糖苷酶基因MEL1在大肠杆菌中得到了表达,糖基化对于维持此酶的生物活性不是必须的.

利用细胞内基因重组方法选育氨基酸生产菌株

一、前言微生物不合成对于生长必需量以上的作为菌体组成成份的氨基酸,其代谢调节机制主要是通过反馈调节——反馈抑制和反馈阻遏来调节生物合成的。因此,在以糖类和铵盐为主要原料的培养基中培养微生物,为了过量生成、积累特定的氨基酸,即所谓建立氨基酸发酵,通过某种手段解除其调节机制是必要的。