茯苓多糖合成途径磷酸葡萄糖变位酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因鉴定

采用已报道的灵芝磷酸葡萄糖变位酶(PGM)和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGPP)基因序列对茯苓基因组进行搜索比对,获得茯苓WcPGM和WcUGPP候选基因序列;以茯苓的cDNA为模板,成功克隆获得WcPGM和WcUGPP基因;随后利用pPIC9K构建2个基因的表达载体,并转化至毕赤酵母进行异源表达。序列分析表明WcPGM和WcUGPP基因全长分别为2021 bp和2144 bp,其中WcPGM基因含有5个外显子和4个内含子,编码564个氨基酸;WcUGPP基因含有11个外显子和10个内含子,编码502个氨基酸。氨基酸序列比对表明,WcPGM和WcUGPP与来源于绣球菌的ScPGM和ScUGPP的同源性分别为87%和91%。酶活测定表明,重组酶WcPGM可转化葡萄糖-1-磷酸(G1P)为葡萄糖-6-磷酸(G6P),酶活达1540 U·mL^(-1);重组酶WcUGPP可催化G1P和尿苷三磷酸(UTP)合成UDP-葡萄糖(UDP-Glc),酶活达660 U·mL^(-1),表明从茯苓中筛选到的2个酶WcPGM和WcUGPP具有PGM和UGPP活性。分子模拟表明,WcPGM在催化可逆反应过程中S114为磷酸供体和受体,R24和K379作为催化酸和碱实现底物的磷酸化和去磷酸化,而E366和S368可实现底物的2种朝向,保障了中间产物葡萄糖-1,6-二磷酸的翻转,确保了WcPGM的可逆反应;而WcUGPP活性中心的核苷酸结合Loop和糖结合Loop保障了底物的正确朝向,K390作为催化碱实现了底物UTP/G1P与UDP-Glc的可逆反应。该研究为茯苓多糖合成途径的解析和代谢工程提升茯苓多糖产量奠定了基础。

宿主细胞磷酸甘油酸变位酶5调控A型流感病毒复制机制的研究

为探究宿主因子磷酸甘油酸变位酶5(PGAM5)调控A型流感病毒复制的机制,本研究设计并合成PGAM5 siRNA和阴性对照Scrambled siRNA(NC siRNA),将二者分别转染A549细胞后,采用荧光定量PCR(qPCR)和western blot(WB)检测该siRNA的干扰效果,利用细胞活力试剂盒检测下调PGAM5表达对细胞活力的影响。结果显示,与转染NC siRNA的阴性对照细胞相比,PGAM5 siRNA能够极显著抑制PGAM5在A549细胞中的转录及表达水平(P<0.001、P<0.01)且对细胞活力基本无影响。为探究PGAM5对流感病毒复制的影响,将PGAM5siRNA和NC siRNA分别转染A549细胞36 h后经流感病毒A/WSN/1933(WSN,H1N1)株感染,分别于感染后24 h、48 h及72 h收获上清经噬斑滴定测定各组细胞中的病毒滴度;分别于感染后3 h~5 h采用WB检测病毒各蛋白的表达水平。结果显示,与阴性对照细胞相比,随着感染时间的延长,转染PGAM5 siRNA细胞中的病毒滴度均极显著下降(P<0.001),尤其在转染后72 h病毒滴度下降最多;且该细胞中流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1和NS1蛋白的表达水平均呈下降趋势,以感染后3 h上述蛋白表达水平的降低最为显著。为探究PGAM5调控流感病毒复制的机制,将PGAM5 siRNA和NC siRNA分别转染A549细胞,36 h后以MOI 10 WSN株感染细胞,1 h后分别采用WB检测病毒NP蛋白的表达水平,分析PGAM5对流感病毒吸附和内吞的影响,并于感染后0、3 h、4 h及5 h通过激光共聚焦试验检测细胞内病毒NP蛋白的定位,以确定下调PGAM5对流感病毒vRNP复合体入核及出核的影响,采用Image J统计含病毒NP蛋白的细胞在v RNP复合体入核及出核中的比例。结果显示,与对照组相比,下调PGAM5基因的表达后,吸附在细胞表面或内吞进入各组细胞中的病毒粒子中NP蛋白的表达水平均无显著差异。激光共聚焦观察可见,在下调PGAM5表达的细胞中,病毒NP蛋白先定位于细胞表面,再向细胞核内聚集,而后完成出核、最后定位在细胞质中,与阴性对照细胞结果一致;但在该组细胞中,病毒NP蛋白趋向出核以及完成出核的细胞比例均显著低于阴性对照细胞(P<0.05)。将p CAGGS、pCAGGS-PGAM5及pCAGGS-PGAM5+pCAGGS-Importinα1/3/5/7-Flag/PGAM5和pCAGGS-PGAM5、pCAGGS-Importinβ1-Flag以及pCAGGS-PGAM5+pCAGGS-Importinβ1-Flag分别转染HEK293T细胞,24 h后利用Co-IP试验检测PGAM5与核输入蛋白的相互作用;将pCAGGS-PGAM5、pCAGGS-NS2-Flag及pCAGGS-PGAM5+pCAGGS-NS2-Flag和pCAGGS-PGAM5、pCAGGS-M1-Myc及pCAGGSPGAM5+pCAGGS-M1-Myc分别转染HEK293T细胞,24 h后经Co-IP试验检测PGAM5与核输出蛋白的相互作用。结果显示,PGAM5与核输入蛋白Importinα1/α3/α5/α7及Importinβ1及核输出蛋白M1/NS2均无相互作用。提示,宿主因子PGAM5可能并非通过与M1/NS2的互作调控流感病毒vRNP复合体的出核。本研究首次报道宿主因子PGAM5可以促进流感病毒的复制,且其主要参与调控流感病毒vRNP复合体的出核过程。本研究为深入了解PGAM5蛋白功能奠定了研究基础,也为流感的防控提供了新思路。

人参UDP-阿拉伯糖变位酶基因电子克隆及分析

UDP-阿拉伯糖变位酶是阿拉伯糖合成过程的关键酶,在植物形态建成和逆境胁迫响应过程中起着重要的作用.UDP-阿拉伯糖变位酶可使UDP-Araf和UDP-Arap相互转换,参与包括阿拉伯糖在内的多糖合成.以玉米UDP-阿拉伯糖变位酶氨基酸序列作为探针,通过电子克隆的方式,对人参EST数据库进行检索,获得具有高度同源性的cDNA序列,采用DNAMAN软件对其进行拼接和组装,最终获得一条长为1445 bp的cDNA序列.利用相关软件对人参UDP-阿拉伯糖变位酶基因进行生物信息学分析.结果表明:人参UDP-阿拉伯糖变位酶蛋白为稳定的亲水性蛋白,该蛋白上的磷酸化修饰有33处,无跨膜螺旋区,不存在信号肽,为非分泌蛋白.该蛋白含有无规则卷曲、α螺旋、延伸链、β折叠二级结构,其中无规则卷曲结构最多.人参UDP-阿拉伯糖变位酶的氨基酸序列与凤仙花同源性较高,与石榴花同源性较低.分析结果能为人参后续相关研究提供一定的参考依据.

五种海洋生物葡萄糖磷酸变位酶和磷酸葡萄糖异构酶的同工酶分析

采用水平淀粉凝胶电泳方法对虾夷马粪海胆(Strongylocentrotus intermedius)、刺参(Apostichopus japonicusSelenka)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、文蛤(Meretrix meretrix)和虾夷扇贝(Pecten yessoensis)不同组织中的葡萄糖磷酸变位酶(PGM)和磷酸葡萄糖异构酶(GPI)进行了检测分析。结果发现,虾夷马粪海胆肌肉组织和成熟性腺组织中的PGM有较强的表达活性和表达位点差异,两种组织中GPI活性稍差。刺参的肠道组织和肌肉组织只有PGM和GPI表达活性的差异,而无位点差异。半滑舌鳎肌肉组织检测到两个PGM位点,三个GPI位点。文蛤闭壳肌组织PGM表现出非常高的多态性,而GPI表现为单态。虾夷扇贝闭壳肌组织的PGM和GPI各只检测到一个位点,遗传变异程度比较低。以PGM和GPI为指标,对我国北方5种重要海水养殖品种的同工酶遗传变异水平和其它相关遗传参数进行了分析,对群体遗传结构可能的变化规律以及与某些性状的相关性进行了探讨,这些参数对它们的遗传选育有一定的指导作用。

三角褐指藻磷酸甘油酸变位酶基因可能侧翼序列的筛选、克隆以及序列测定

采用RT PCR的方法从酵母中成功地得到了磷酸甘油酸变位酶的cDNA基因 ,分别用32 P和地高辛 ddUTP标记以用作探针。以32 P标记的探针筛选三角褐指藻基因组文库 ,获得了 4kb的阳性DNA片段 ;进一步分析发现 ,该 4kb片段的真正阳性区域是位于片段端部的30 6bp的序列 ,因此认为该序列为三角褐指藻磷酸甘油酸变位酶基因的侧翼部分。克隆该30 6bp的DNA片段 ,并且测定其序列。结果表明 ,该 30 6bp的DNA片段包含两个同向重复序列 ,每个重复序列的大小为 1 1 6bp ,在每个重复序列中均含有GGTTCAATGT区域 ,这与一般常见的真核基因 5′端的CAATbox有相似之处。

转磷酸甘露糖变位酶基因提高水稻维生素C含量

维生素C（VC）是人体健康所必需的营养元素。人类由于缺乏VC合成途径中的最后一种酶（L-古洛糖酸内酯氧化酶）,自身不能合成VC。水稻是重要的粮食作物,增加水稻种子中VC含量,能够提高其营养价值。磷酸甘露糖变位酶（PMM）是VC合成通路中一种重要的酶,催化甘露糖-6-磷酸到甘露糖-1-磷酸的转变。将水稻PMM基因（OsPMM）构建在双右边界双元载体pMNDRBBin6上,并用种子特异表达的启动子BX14驱动其表达。通过农杆菌介导的转化系统,OsPMM基因被转入粳型三系恢复系C418中。通过分子检测,在T2代筛选到了无选择标记的转基因植株。对OsPMM基因在转基因植株中的表达进行分析,发现OsPMM基因在转基因水稻种子内的表达水平明显提高,相应地,转基因系种子中的VC含量也提高了25%-50%。

刚地弓形虫磷酸甘油酸变位酶2基因片段克隆、表达及抗原性分析

目的克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)磷酸甘油酸变位酶2(TgPGAM2)基因片段,并分析其抗原性。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。PCR扩增TgPGAM2基因。扩增产物经双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将测序正确的重组质粒pET30a(+)-TgPGAM2转化至E.coli BL21并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。以兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的抗原性。结果PCR扩增产物约为750 bp。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-TgPGAM2构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)约30 000的可溶性重组蛋白。Western blotting分析证实其能被兔抗弓形虫血清识别。结论刚地弓形虫RH株TgPGAM2基因片段可在原核表达系统中表达,且该可溶性重组蛋白具有抗原性。

冷诱导下民猪磷酸葡萄变位酶基因的表达变化

磷酸葡萄变位酶(PGM)是糖代谢过程中的一个关键酶,为了研究其表达变化,研究采用RT-PCR和Real-time PCR方法,对PGM在大肠、腿肌、肺脏、脂肪、心脏、脾脏和肝脏组织的表达水平以及冷诱导前后民猪骨骼肌内PGM mRNA的表达变化进行了研究。结果表明:在所检测的7个组织中除大肠外其余组织PGM均高水平表达,而且冷诱导后PGM mRNA的水平出现了明显的下降。

变形链球菌UA159磷酸蔗糖变位酶基因功能丧失菌株的构建

目的:构建变形链球菌UA159磷酸蔗糖变位酶基因(phospho-sugar mutasegene,psm)功能丧失菌株,为进一步研究变形链球菌psm功能做准备。方法:将变形链球菌UA159 psm内部上、下游2段序列分别克隆至自杀质粒pFW5的2个多克隆位点(MCS-I和MCS-II),构建重组质粒,并经酶切和测序证实。利用同源重组(homologous recombination)原理,采用自然转化的方法,实现重组自杀质粒和变形链球菌UA159同源序列的等位交换(allelic exchange)。结果:经过PCR和测序分析,证实变形链球菌UA159基因组中的psm被重组质粒的基因(含有壮观霉素抗性)取代。结论:成功构建了变形链球菌UA159psm功能丧失菌株。

Streptomyces maritimus苯丙氨酸变位酶的制备、表征及催化合成β-芳香丙氨酸

克隆Streptomyces maritimus来源的苯丙氨酸变位酶(Sm PAM)基因,并进行异源表达,制备了重组Sm PAM,用于一步合成高附加值的β-芳香丙氨酸.提取S.maritimus的基因组,设计1对特异性引物,采用PCR扩增编码Sm PAM的结构基因pam,与表达载体p ET28a连接,构建重组表达质粒p ET28a-pam,转入E.coli BL21中表达,采用亲和层析柱分离纯化重组酶Sm PAM.结果表明,克隆得到编码523个氨基酸长度的Sm PAM基因pam,并在大肠杆菌中实现了高效表达,制得电泳纯的重组Sm PAM.该酶在最适温度30℃,p H=9.0条件下活力达到2.5 U/mg,具有较高的热稳定性和p H稳定性,在60~70℃下保持3 h未见活性下降,在p H=9~11保持24 h,残余酶活力达到98%.Sm PAM具有较宽的底物谱,可催化苯环上携带不同基团的3-芳香丙烯酸合成β-芳香丙氨酸,当苯环上携带吸电子基团时催化反应更易完成,其中2-硝基-β-苯丙氨酸的产率最高,达到93%.

重组弓形虫磷酸甘油酸变位酶2联合IL-2、IFN-γ佐剂鼻内免疫小鼠诱导的小肠黏膜免疫应答

为探讨IL-2和IFN-γ的佐剂效应，本研究观察了重组弓形虫磷酸甘油酸变位酶2（rTgPGAM2）联合IL-2或IFN-γ滴鼻免疫小鼠诱导小肠黏膜IgA抗体分泌细胞（IgA—ASCs）和小肠冲洗液sIgA的免疫应答。将48只6周龄雌性BALB／c小鼠随机均分为6组，免疫组分别用500IUIL-2、1000UIFN-γ、30μgrTgPGAM2、30μgrTgPGAM2＋500IUIL-2或30μgrTgPGAM24-1000UIFN-1滴鼻免疫小鼠，抗原和佐剂溶于20μLPBS中，对照组用20μLPBS滴鼻。免疫3次，一免和二免间隔2周，二免后1周三免。三免后第14天，颈椎脱臼处死小鼠，免疫组化检测小鼠十二指肠、空肠和回肠黏膜中IgA-ASCs，计算阳性率，ELISA测定小肠冲洗液sIgA水平。结果表明，免疫组十二指肠、空肠和回肠黏膜中IgA—ASCs阳性率高于PBS组，其中rTgPGAM2、rTgPGAM2联合IL-2或IFN-γ佐剂组差异显著（P〈0．05或P〈0．01）。rTgPGAM2联合IL-2或IFN-γ佐剂组小肠冲洗液sIgA水平显著高于PBS组（P〈0．01）。rTgPGAM2、TgPGAM2＋IL-2和TgPGAM2＋IFN-γ滴鼻免疫小鼠均可有效诱导肠黏膜免疫应答，IL-2和IFN-γ可显著增强抗原的免疫效应，IL-2的佐剂效应优于IFN-γ。

产β-苯丙氨酸变位酶基因工程菌的构建及其发酵条件优化

构建β-苯丙氨酸变位酶基因表达重组质粒pET-28apam,并转化大肠杆菌BL21,获得β-苯丙氨酸变位酶基因重组菌。考察培养基初始pH、摇床转速、种龄、发酵时间以及装液量5个因素对β-苯丙氨酸变位酶基因工程菌产酶活性的影响,确定较佳发酵条件为:培养基初始pH 7.0、摇床转速200r/min、发酵时间24h、装液量50mL/500mL、种龄10h。采用Box-Behnken试验设计,选择了种龄、初始pH、发酵时间3个对β-苯丙氨酸变位酶活力影响较大的因素进行响应面优化。优化结果为:在种龄12.8h、初始pH 6.7、发酵时间25.2h条件下,PAM活力达到11.15 U/mL,比优化前酶活4.87U/mL提高了128.9%。

地中海拟无枝酸杆菌甲基丙二酰CoA变位酶和消旋酶的纯化及性质

采用原生质体裂解方法确定甲基丙二酰CoA变位酶(MCM)和消旋酶(MCR)均是胞浆内酶。各经过四步纯化得到电泳纯酶。纯化MCM酶的比活力为12.84u/mg,纯化倍数为528,酶活回收为60％,纯化的MCM酶服从典型的米氏底物饱和曲线,对琥珀酰CoA和辅酶B_(12)的K_m值分别为9.723#mol/L和0.1277#mol/L。经SephadexG-150测定MCM分子量约为134.000±2000,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示两条分子量分别为67000和65000的蛋白带,说明该酶由两个大小不等亚基组成。吸收光谱测定每摩尔纯化全酶含两摩尔辅酶B_(12)。纯化MCR酶比活力为2.305u/mg,纯化倍数96,酶活回收46.7％。MCR酶由两个分子量均为17500的亚基组成。MCR酶活性能被二价金属离子Cu^(2+)、Co^(2+)、Mg^(2+)、Mn^(2+)和Fe^(2+)所促进。两酶的酶学性质和其他生物来源的MCM、MCR酶明显相似。

磷酸甘油酸变位酶-1在不同分型前列腺炎患者睾丸组织中的表达及临床意义

目的:观察磷酸甘油酸变位酶-1(PGAM1)在不同分型前列腺炎患者睾丸组织中的表达差异,并分析PGAM1表达检测的临床意义。方法:收集Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型前列腺炎患者和健康体检人群的睾丸组织标本,采用免疫组化检测PGAM1表达水平,分析不同分型前列腺炎患者PGAM1表达差异,并分析PGAM1表达与生精功能指标卵泡刺激素、黄体生成素、睾酮水平的关系。结果:Ⅰ型前列腺炎患者睾丸组织标本PGAM1表达与健康体检人群比较无显著差异性(P>0.05),Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型前列腺炎患者睾丸组织标本PGAM1表达与健康体检人群比较有显著差异性(P<0.05);Ⅰ型前列腺炎患者中PGAM1低表达者的卵泡刺激素、黄体生成素、T激素水平与健康体检人群比较无显著差异性(P>0.05),但Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型前列腺炎患者中PGAM1低表达者的卵泡刺激素、黄体生成素、睾酮水平与健康体检人群比较有显著差异性(P<0.05)。结论:除Ⅰ型前列腺炎患者外,Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型前列腺炎患者PGAM1呈异常的低表达,而PGAM1呈异常的低表达对患者睾丸组织生精功能产生影响,因此PGAM1检测在前列腺炎患者病情及生精功能障碍诊断中具有一定的临床价值。

我国几个民族中毛发根葡糖磷酸变位酶—1的亚型分布

本文报道了利用等电聚焦的方法,从毛发根鞘细胞分析了我国汉、苗、土家、撒拉、土、达斡尔和赫哲等民族的葡糖磷酸变位酶-1(PGM_1)10亚型的分布,并且与其他人群的基因频率作了比较。

葡萄果实分支酸变位酶基因的克隆与表达分析

莽草酸途径是连接糖代谢和次生代谢的主要桥梁,分支酸变位酶(Chorismate Mutase,CM)是控制碳同化物由莽草酸途径进入苯丙烷代谢途径的入口酶,在葡萄果实酚类物质积累中起着重要作用。本研究以赤霞珠葡萄(Vitis vinifera cv.Cabernet Sauvignon)果实为试材,采用电子克隆和分子克隆相结合技术,获得两个编码分支酸变位酶同源基因,分别命名为VvCM1和VvCM2。这两个基因分别定位于4号和14号染色体上,其编码区全长分别为741 bp和963bp,编码蛋白含246和320个氨基酸。VvCM1和VvCM2与其他植物中的同类酶在氨基酸水平上具有广泛的同源性。Real-time PCR分析显示,VvCM1和VvCM2基因在葡萄的各器官和组织中均有表达,VvCM1在果实中表达丰度最高,而VvCM2在茎中表达丰度最高。

重叠延伸PCR法构建华支睾吸虫磷酸甘油酸变位酶突变体CsPGM-H190Q

为了研究华支睾吸虫磷酸甘油酸变位酶的活性位点,试验通过生物信息学分析和重叠延伸PCR的方法,对该酶的底物结合位点进行突变,得到突变体基因CsP GM-H190Q,将其克隆至表达载体pET-24b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达。结果表明:华支睾吸虫磷酸甘油酸变位酶突变体蛋白(CsP GM-H190Q)的分子质量为29.0 ku,Ni-NTA HisTrap柱纯化后得到纯度较高的蛋白。

成团泛菌依赖型磷酸甘油酸变位酶基因的克隆、序列分析及产氢中的差异表达

为研究高效产氢菌株成团泛菌(Pantoea agglomerans)BH-18中依赖型磷酸甘油酸变位酶(cofactor-dependent phosphoglycerate mutase,dPGM)与产氢之间的关系,本研究根据GenBank上已登录的肠杆菌中编码dPGM的基因序列设计一对引物,从细菌基因组DNA中克隆得到编码dPGM基因的完整开放阅读框,其长度为753 bp,编码250 aa。采用BLAST对其与NCBI GenBank中的核苷酸序列进行比较分析,结果表明该基因保守性相对较高,与肠杆菌科众多菌株中的dPGM基因相似性达100%。采用Bioedit和Mega4软件构建NJ系统进化树,结果表明成团泛菌BH-18的dPGM氨基酸序列与Enterobacter asburiae的dPGM聚为一类,而与成团泛菌属中其他菌株的该蛋白关系较远,dPGM的氨基酸序列在属内不保守。最后,根据已获得的基因序列设计引物,采用RT-PCR的方法分析了成团泛菌BH-18产氢过程中dPGM基因的转录情况,结果表明dPGM基因的转录与产氢呈正相关,依赖型磷酸甘油酸变位酶是产氢过程中的关键酶。

内蒙古鄂伦春人红细胞酯酶D和磷酸葡萄糖变位酶Ⅰ表型分布及基因频率的研究

人类红细胞酪酶D(EsD)和磷酸葡萄糖变位酶Ⅰ(PGM_1)的表型及基因定位已有报道。作为重要的基因标志用于法医学亲子鉴定和个体识别;在群体遗传学中分析种族,民族差异;人类学中探讨民族融合、族源、迁移;在临床器官移植方面也有应用价值。不同种族和民族间EsD和PGM_1表型分布和基因频率不同,为了解内蒙古鄂伦春人EsD和PGM_1的分布和基因频率情况,我们进行了调查研究。

磷酸甘油酸变位酶活性测定方法建立

目的建立一种适用于生化自动分析仪动力学测定磷酸甘油酸变位酶(phosphoglyceromutase,PGAM)的方法并评价此方法的可靠性。为进一步探讨人体血清PGAM活性在急性心肌梗死和脑出血等疾病中的早期作用建立良好的方法基础。方法PGAM活性测定采用3-磷酸甘油酸为底物,经烯醇化酶等一系列偶联,以340nm波长在自动分析仪上测定,根据NADH吸光度变化可求出PGAM总活性。结果通过一系列参数的测定建立了良好的能适应生化自动分析仪的PGAM活性测定方法。结论全自动酶偶联法操作简单、测定快速、稳定性好,灵敏度和精确度高,抗干扰性强,可在全自动生化分析仪上应用。