miR-505-3p在小鼠胚胎成纤维细胞中抑制可变剪接因子以调控运动神经元存活基因可变剪接

目的探究微小RNA 505-3p(miR-505-3p)对于运动神经元存活基因(survival motor neuron gene,SMN)可变剪接的影响。方法利用生物信息学数据库预测miR-505-3p靶基因,构建双荧光素酶报告载体,在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)中验证靶基因为可变剪接因子(alternative splicing factor,ASF)基因,运用免疫印迹和免疫荧光染色验证miR-505-3p对ASF的抑制效果,利用实时定量PCR技术检测miR-505-3p对具有正常功能的全长SMN(SMN-FL)以及含有毒性的第7号外显子缺失的SMN(SMN-D7)表达量的影响及ASF在其中的作用。结果 miR-505-3P直接结合ASF3'端调控区并抑制ASF mRNA及蛋白表达量,抑制ASF蛋白在细胞核中的表达和分布。过表达miR-505-3p促进SMN-FL向SMND7的转化,而过表达靶基因ASF或者抑制miR-505-3p促进SMN-FL的保留。结论 ASF对SMN基因正常剪接形成SMNFL是必需的,miR-505-3p通过抑制ASF,从而干扰ASF对于SMN可变剪接的调控,导致正常的SMN-FL向毒性的SMN-D7转化。

Dyrk1A经ASF调控CaMKⅡδ可变剪接在肾血管性高血压大鼠心肌肥厚中的作用

目的:探讨双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(Dyrk1A)经可变剪接因子(ASF)对钙/钙调素依赖蛋白激酶Ⅱδ(CaMKⅡδ)可变剪接的调控在肾血管性高血压大鼠心肌肥厚中的作用。方法:制备两肾一夹肾血管性高血压大鼠模型,给予Dyrk1A抑制剂表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和哈尔碱(harmine)干预,观察大鼠血压及心肌肥厚程度变化,逆转录-多聚酶链反应法检测CaMKⅡδ可变剪接的改变,免疫印迹法检测大鼠心肌Dyrk1A和ASF蛋白质表达的变化。结果:两肾一夹术后8周,与假手术组相比,手术组大鼠血压显著升高(P<0.05),大鼠左室重、左室重/体重比值及心肌细胞面积均增高(P<0.05),同时该组大鼠心肌中Dyrk1A蛋白表达增加,ASF蛋白表达下降(P<0.05),CaMKⅡδ亚型可变剪接表现为CaMKⅡδA、δB mRNA表达升高,δC mRNA表达降低(P<0.05);与手术组相比,EGCG和哈尔碱组大鼠左室重、左室重/体重比值和心肌细胞面积下降,同时大鼠心肌中Dyrk1A蛋白表达降低,ASF蛋白表达上调,CaMKⅡδ亚型可变剪接逆转(均P<0.05)。结论:Dyrk1A可通过ASF调控CaMKⅡδ的可变剪接,从而参与肾血管性高血压大鼠心肌肥厚的发生。

玉米大斑病菌SC35同源基因表达规律与互作分析

【目的】获得玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)SC35类剪接因子的基因,并分析该基因家族之间的相互作用及在病菌不同生长发育时期与侵染过程中的表达规律,为明确剪接因子SC35家族与真菌生长发育的关系打下基础。【方法】以拟南芥(Arabidopsis thaliana)SC35编码的氨基酸序列为探针序列,在玉米大斑病菌全基因组数据库进行同源比对,获得玉米大斑病菌中潜在的SC35蛋白;利用生物信息学方法对其保守结构域、系统进化关系进行分析;分别收集接种在感病玉米叶片表面不同时间及玉米大斑病菌菌丝、分生孢子、芽管、附着胞及侵入丝等不同发育时期的材料,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析在对玉米叶片侵染不同时间及不同发育时期可变剪接因子的转录水平;利用酵母双杂交技术明确玉米大斑病菌可变剪接因子之间的相互作用。【结果】在玉米大斑病菌中获得了8个潜在的SC35类蛋白基因,其编码的氨基酸具有典型的SR蛋白(Ser-Arg rich protein)结构域,而StSC1 C端具有2个RRM基序。8个基因位于染色体组的不同物理位置,不具有连锁关系。系统进化分析表明8个剪接因子分布于不同进化支,同源性较低。在病菌侵染寄主叶片过程中,StSC1、StSC2、StSC3、StSC4、StSC5、StSC6、StSC8在侵染18 h时表现为表达上调趋势,StSC7呈下调趋势,StSC4在6—18 h表现出较高表达活性;不同生长时期中,StSC1在病菌附着胞及侵染丝形成时期表达水平极显著上调(P<0.001),是分生孢子时期的24.44、8.25倍,其余7个可变剪接因子在病菌的生长过程中表达水平均呈下调趋势。酵母双杂交结果表明StSC4与StSC6、StSC3与StSC8、StSC3与StSC4、StSC8与StSC4有体外互作关系。【结论】在玉米大斑病菌侵染过程中及不同发育时期可变剪接因子的表达模式不同,StSC4在病菌整个侵染过程均活跃表达;StSC1、StSC4和StSC6对病菌附着胞和侵入丝的形成发挥比较重要的调控作用;StSC4与StSC6、StSC3与StSC8、StSC3与StSC4、StSC8与StSC4通过互作,调控剪接复合体的形成。