重组可溶性补体1型受体在酵母SMD1168中表达纯化及鉴定

目的在酵母细胞SMD1168中表达人可溶性补体1型受体(sCR1),并对其重组蛋白进行纯化以探讨较为接近人体天然蛋白的表达方式,从而为临床诊断及治疗提供方便。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPIC9K,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9K-sCR1);经测序鉴定正确后,将重组质粒转化入毕赤酵母菌细胞SMD1168中,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,并通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果经甲醇诱导的含pPIC9K-sCR1的酵母细胞表达出重组人sCR1的融合蛋白,48-72hsCR1融合蛋白表达量最高。此蛋白在凝胶上表现为大于31kD的蛋白区带,在Western blot实验中可被sCR1的CD35单克隆抗体识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原活性。

重组人可溶性补体受体1型SCR15-18片段表达纯化及生物活性鉴定

目的获得高表达、高纯度和高活性的可溶性补体受体1型SCR15-18(sCR1-SCR15-18)蛋白。方法重组原核表达载体pET32a-sCR1-SCR15-18在大肠杆菌BL21中经不同IPTG浓度、诱导时间和温度诱导表达,超声破菌,提取包含体,经Ni2+-NTA亲和层析后,选择不同氧化还原条件进行复性,进而检测其生物学活性。结果得到了有较高表达量、较高纯度和较好生物学活性的sCR1-SCR-15-18蛋白。结论优化了sCR1-SCR15-18蛋白的表达、纯化和复性的参数,所获结果为进一步动物体内保护实验研究奠定了基础。

肝硬化患者可溶性补体受体1型水平的变化及意义

目的研究肝硬化患者可溶性补体受体1型(sCR1)水平的变化,探讨其在肝硬化发展过程中的意义。方法采用双抗体夹心(ELISA)法,测定Child-Pugh肝功能分级A(31例)、B(26例)、C(29例)三级的肝硬化患者sCR1水平,将其与Child-Pugh得分进行比较。同时测定30例肝细胞癌,8例胰腺癌,15例乳腺癌,8例肺癌患者以及30例正常献血员sCR1水平并进行组间比较。结果肝硬化患者sCR1的水平显著高于正常献血员,差异有统计学意义(P<0.01),肝细胞癌患者与肝硬化患者间差异无统计学意义(P>0.05),其他恶性肿瘤患者与正常献血员差异无统计学意义(P>0.05)。Child-Pugh得分与sCR1水平存在正相关关系(r=0.86)。结论sCR1水平与肝功能状况密切相关,有可能作为抗炎症分子在阻止肝脏硬化过程中起一定作用。

人可溶性补体受体1型双抗体夹心ELISA法的建立及初步应用

目的建立定量检测人血清可溶性补体受体1型(sCR1)双抗体ELISA夹心法。方法用鼠抗人CD35单克隆抗体(mAb)包被反应板,以兔抗人sCR1抗体(PcAb)为夹心抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG为检测抗体,纯化后的人sCR1蛋白为标准品,建立定量检测人血清sCR1双抗体夹心ELISA法,并检测50例体检健康者和32例肝硬化患者血清样本中sCR1水平。结果建立的双抗体夹心ELISA法检测人血清sCR1的线性范围为15.6～250 ng/mL。低、高浓度批内变异系数(CV)分别为9.3%、7.1%;批间CV分别为11.2%和9.82%;回收率分别为89.5%和92.5%。50例健康人和32例肝硬化患者血清sCR1水平分别为(33.82±5.88)ng/mL和(152.99±9.51)ng/mL,两者比较有统计学差异(t=70.18,P<0.001)。结论成功建立了检测人血清sCR1的双抗体夹心ELISA法,重复性和准确性较好。初步发现肝硬化患者血清sCR1水平显著升高。

sCR1-SCR15-18蛋白减轻补体介导的大鼠脑缺血/再灌注损伤

目的:探讨补体在大鼠大脑缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤中的作用及重组人可溶性补体受体Ⅰ型SCR15-18蛋白(sCR1-SCR15-18)的保护作用。方法:75只雄性SD大鼠,随机分为假手术组、I/R组和sCR1-SCR15-18保护组。采用线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型(middle cerebral artery occlusion MCAO),缺血2h,再灌注24h后,进行神经功能学评分,测定脑梗死体积、大脑皮质髓过氧化物酶(myeloperoxi-dase,MPO)活性,观察大脑皮质区补体C3b沉积和病理改变。结果:缺血/再灌注24h后,sCR1-SCR15-18保护组神经功能学评分,脑梗死体积及脑皮质MPO活性明显低于I/R组(P<0.05);sCR1-SCR15-18保护组缺血脑组织补体C3b沉积明显减少,病理损伤减轻。结论:补体在脑I/R损伤中起一定作用,sCR1-SCR15-18蛋白对大鼠I/R损伤脑具有保护作用。

人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选

目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性。

慢性肝病患者血清sCR1及HA水平变化及其临床意义

对72例慢性肝病及22例肝硬化患者采用双抗体夹心ELISA法测定血清sCR1浓度、放射免疫法测定血清透明质酸(HA)水平。结果慢性肝病患者血清sCR1浓度显著高于正常人(P<0.01),肝硬化患者血清sCR1浓度显著高于慢性肝病患者(P<0.01);血清sCR1与HA密切相关(r=0.83)。提示血清sCR1与肝脏损伤严重程度密切相关,可作为反映肝脏代偿功能的重要指标。

人sCR1转化克隆菌的快速筛选和鉴定

目的用G418快速筛选及鉴定重组人可溶性补体受体1型(sCR1)高拷贝转化克隆菌。方法采用的sCR1重组质粒,经电转化将其克隆入酵母SMD1168细胞株中,利用G418的抗性,快速筛选转化克隆菌,并对克隆菌株提取基因组DNA进行聚合酶链反应(PCR)鉴定;该克隆菌经甲醇诱导培养后,对其表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot鉴定分析。结果从G418快速筛选的毕赤酵母克隆菌株中提取的基因组DNA进行PCR鉴定,获得了高拷贝整合的重组毕赤酵母克隆菌株,经诱导培养后,对其表达产物进行SDS-PAGE及Western blot鉴定分析,该表达蛋白在SDS-PAGE上表现为相对分子质量大于30 000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别,成功获得高拷贝整合的重组毕赤酵母细胞株,可表达出重组人sCR1融合蛋白。结论经高浓度G418药物快速筛选的高拷贝毕赤酵母SMD1168细胞株,用于表达人sCR1融合蛋白。

重组人sCR1蛋白对大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的探讨可溶性补体受体1型(sCR1)蛋白对大鼠肢体缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用。方法制作大鼠肢体I/R模型;采用解放军153中心医院检验中心制备的重组人sCR1蛋白对大鼠模型进行早期干预,观察0、4、8 h时间点sCR1蛋白干预组与生理氯化钠溶液对照组I/R损伤肌组织细胞形态学、髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)表达水平变化。结果 sCR1蛋白干预组的MDA、MPO、LDH表达水平明显低于对照组,以I/R 4 h组相差最为显著(P<0.01)。组织细胞形态学变化:sCR1蛋白干预组在相同时间点均较对照组肌组织结构变性明显减轻。结论对大鼠肢体I/R模型进行sCR1蛋白早期干预可明显减轻大鼠后肢骨骼肌I/R损伤。

人血清微量sCR1蛋白双抗体夹心ELISA试剂盒的评价与应用

目的对研制的人血清微量sCR1蛋白双抗体夹心ELISA试剂盒的重复性、稳定性进行评价,并了解其实际应用效果。方法选取中、晚期肝硬化患者50例和健康体检者50例分别作为肝病组和正常对照组,以鼠抗人CD35单克隆抗体、兔抗人sCR1多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG为包被抗体、夹心抗体和检测抗体,以纯化后的重组人sCR1蛋白为标准品,建立人血清微量sCR1蛋白双抗体夹心ELISA试剂盒,进行试剂盒重复性和稳定性检验,并应用该试剂盒检测两组血清sCR1蛋白水平。结果双抗体夹心ELISA法检测人血清微量sCR1蛋白的线性范围是15.60~250.00ng/mL;血清sCR1蛋白水平对吸光度值的回归方程为Y=112.10 X2+18.21 X+1.694(r2=0.998);重复性检测中,高、低水平标准品检测值的批内相对标准偏差(RSD)分别为6.20%、7.40%,批间RSD分别为6.70%和7.90%;试剂盒稳定性检测中,RSD均不大于0.01;肝病组血清sCR1表达水平显著高于正常对照组(P<0.01)。结论人血清微量sCR1蛋白双抗体夹心ELISA试剂盒线性范围广、重复性好、易于保存,适合于临床和科研检测工作。

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。

系统性红斑狼疮患者血清sCR1含量及临床意义

目的探讨可溶性补体受体1型(sCR1)在人血清中的含量与系统性红斑狼疮(SLE)免疫球蛋白(Ig)和补体(C)之间的相关性。方法采用本中心建立的检测人血清微量sCR1双抗体ELISA夹心法,检测了48例活动期、12例缓解期SLE患者和50例健康对照者血清中sCR1含量,同时测定了血清中IgG、IgA、IgM、C3、C4和抗核抗体谱(IgG)含量,并对所有SLE患者做活动性测量(SLAM)评分。结果活动期SLE患者血清中的sCR1含量为(57.68±5.67)ng·ml-1,明显高于健康对照组(32.54±3.28)ng·ml-1及缓解期SLE患者(37.0±2.93)ng·ml-1;健康人和活动期SLE患者比较有统计学差异(P<0.05)。活动期SLE患者血清中的sCR1与IgG呈正相关(P<0.05),与C3呈负相关(P<0.05),与SLAM呈线性正相关(P<0.01)。结论 SLE患者血清sCR1的含量升高和C3的降低均与SLE活动程度及病情加重有关,血清sCR1的含量对了解SLE病情和判定治疗效果具有一定的临床意义。

重组人sCR1蛋白对大鼠肢体缺血再灌注损伤的保护作用

[目的]探讨重组人可溶性补体受体1型(Soluble complement receptor type 1,sCR1)对大鼠肢体缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用。[方法]采用无创血管夹夹闭左侧股动脉制作大鼠肢体缺血再灌注(Ischemiareperfusion,I/R)损伤模型,观察0、4、8 h时间点sCR1蛋白干预组(B组)与生理盐水(NS)对照组(A组)I/R损伤肌组织细胞形态学变化、测定肌肉湿干重比(W/D)、髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)的表达水平。[结果]sCR1蛋白干预后的B组各时间点腓肠肌组织的W/D均低于NS对照A组,以I/R 4 h组最为显著(P<0.01);B组的MDA、MPO、LDH表达水平明显低于A组,以I/R 4 h组最为显著(P<0.01)。[结论]重组人sCR1蛋白对大鼠模型进行sCR1蛋白早期干预后,可明显减轻大鼠后肢骨骼肌I/R的损伤。