慢性HBV感染者外周血可诱导共刺激分子在CD8+ T淋巴细胞的表达及其临床意义

目的 探讨慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者外周血可诱导共刺激分子(ICOS)在CD8+T淋巴细胞的表达特点及临床意义。方法 选取2017年5月—2018年10月就诊的慢性乙型肝炎(CHB)100例、HBV-肝硬化(LC)25例和HBV-慢加急(或亚急)性肝衰竭(ACLF)26例分别纳入CHB组、HBV-LC组和HBV-ACLF组,健康对照(NC)组35例来自同期门诊体检健康者。采用流式细胞仪检测各组ICOS在CD8+T淋巴细胞的表达情况;分析CD8+T淋巴细胞ICOS表达水平与慢性HBV感染者疾病严重程度、HBV-ACLF预后及并发症的相关性;动态观察HBV-ACLF患者治疗过程中CD8+T淋巴细胞ICOS表达变化。结果 HBV-ACLF组外周血CD8+T淋巴细胞ICOS表达比率及平均荧光强度(MFI)均高于CHB组、HBV-LC组和NC组(P<0.05)。慢性HBV感染者ICOS的MFI与白蛋白、胆碱酯酶、总胆固醇、血红蛋白呈负相关(r=-0.263、-0.269、-0.273、-0.302,P=0.003、0.003、0.011、0.004);与直接胆红素、天冬氨酸转氨酶、凝血酶原时间、国际标准化比值呈正相关(r=0.248、0.208、0.331、0.315,P=0.005、0.020、0.003、0.009);与HBV-DNA、腹水及感染无明显相关性(P>0.05)。治疗过程中,HBV-ACLF患者ICOS的MFI无明显改变。但生存组ICOS的MFI在治疗第1周时较治疗前上升(P<0.05)。结论 HBV-ACLF患者外周血CD8+T淋巴细胞ICOS的表达水平明显升高,并与肝脏合成功能、炎症程度及预后相关,治疗早期ICOS水平变化有助于预测慢性HBV感染者的预后。

溶解素E1、可诱导共刺激分子、载脂蛋白A-IV在甲状腺功能减退症患者血清中的表达及相关性

目的探究甲状腺功能减退症(甲减)患者血清中溶解素E1(RvE1)、可诱导共刺激分子(ICOS)、载脂蛋白A-IV(Apo-AIV)表达水平,并分析其与疾病的相关性。方法选择2023年5月-2024年5月本院收治的234例甲减患者作为甲减组,另选同期240名甲状腺功能正常体检者作为对照组。依据垂体促甲状腺激素(TSH)及游离甲状腺素(FT4)水平将甲减组分为亚临床甲减组(103例)及临床甲减组(131例)。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清RvE1、ICOS、Apo-AIV水平,比较不同类型甲减患者甲状腺激素及血清RvE1、ICOS、Apo-AIV水平,采用Pearson法相关性分析血清RvE1、ICOS、Apo-AIV水平与甲状腺激素水平的相关性,采用多因素Logistic回归分析甲减发生的影响因素,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清RvE1、ICOS、Apo-AIV水平对甲减的诊断价值。结果甲减组血清RvE1水平及游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、FT4水平低于对照组,血清ICOS、Apo-AIV水平及TSH水平高于对照组(P<0.05);亚临床甲减组患者血清RvE1水平及FT3、FT4水平高于临床甲减组,血清ICOS、Apo-AIV水平及TSH水平低于临床甲减组(P<0.05);血清RvE1水平与FT3、FT4水平正相关,与TSH水平负相关,血清ICOS、Apo-AIV水平与FT3、FT4水平负相关,与TSH水平正相关(P<0.05);血清RvE1(95%CI=0.464~0.692)、ICOS(95%CI=2.772~35.012)、Apo-AIV(95%CI=2.977~13.154)水平及FT3(95%CI=0.623~0.966)、FT4(95%CI=0.448~0.921)、TSH(95%CI=1.827~14.701)水平是甲减发生的影响因素(P<0.05);血清RvE1、ICOS、Apo-AIV水平联合诊断甲减发生的曲线下面积(AUC)高于血清RvE1水平单独诊断的AUC(Z=2.601,P=0.009),高于血清ICOS水平单独诊断的AUC(Z=7.638,P<0.05),高于血清Apo-AIV水平单独诊断的AUC(Z=5.391,P<0.05)。结论甲减患者血清RvE1水平降低,血清ICOS、Apo-AIV水平升高,与甲状腺激素水平相关,联合诊断甲减的价值较高。

可诱导共刺激分子参与自发性高血压大鼠肠系膜血管内皮-间质转化及硬化

目的 探究可诱导共刺激分子(ICOS)与自发性高血压大鼠(SHR)肠系膜血管内皮-间质转化(EndMT)及硬化的相关性。方法4周龄SHR大鼠(观察组)及同品系WKY大鼠(对照组)各20只,各组再随机分为4组,5只/组。无创血压测量仪动态监测各组大鼠血压情况,并于4、6、10、30周龄进行实验。采用流式细胞术检测大鼠脾脏CD4+T细胞的ICOS表达频数;RT-PCR法检测大鼠肠系膜中ICOS、VE-cad、α-SMA、Col3 m RNA表达;免疫组化技术检测大鼠肠系膜血管VE-cad、α-SMA、Col3及淋巴组织中ICOS、IL-17A、TGF-β的分布情况;ELISA法检测大鼠血浆中IL-17A、TGF-β含量水平;Masson染色观察大鼠肠系膜血管形态变化;Spearman和Pearson相关分析评价ICOS与VE-cad、α-SMA、Col3及胶原容积分数的相关性。结果 SHR大鼠自6周龄开始,与对照组相比收缩压增高(P<0.05);CD4+T细胞ICOS的表达频数高于同期对照组(P<0.05);肠系膜组织中ICOS、α-SMA、Col3、IL-17A和TGF-β的mRNA及蛋白表达相较于对照组均升高(P<0.05),VE-cad mRNA及蛋白则在10周龄时表达下降(P<0.05);自6周龄始SHR大鼠血浆中IL-17A、TGF-β含量水平提升(P<0.05);肠系膜血管硬化程度不断加剧(P<0.05);肠系膜组织中ICOS mRNA及蛋白表达水平与α-SMA、Col3表达水平和血管硬化程度自6周龄始均呈正相关(P<0.05),与VE-cad表达水平自10周龄始呈负相关(P<0.05)。结论 ICOS可能通过介导相关免疫反应在高血压肠系膜血管EndMT及硬化过程中发挥重要作用。

Th1/Th2平衡、分化簇抗原28、可诱导共刺激分子、程序性死亡受体-1和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4在急性冠脉综合征患者外周血中的表达

目的研究Th1/Th2及相关细胞因子、共信号分子分化簇抗原28(CD28)、可诱导共刺激分子(ICOS)、程序性死亡受体1(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)在急性冠脉综合征(ACS)患者外周血中的表达,并探讨其是否参与ACS的发病机制。方法前瞻性选取2021年7月至2022年4月经中山大学附属第三医院粤东医院心血管内科诊断为ACS的120例患者作为研究对象,采用ACS不同亚型的诊断标准将其分为不稳定型心绞痛(UA)组、ST段抬高型心肌梗死(STEMI)组、非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)组,每组各40例。选取同时间段行冠状动脉造影检查正常的40例住院患者作为对照组。采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清中的干扰素(IFN)-γ、白介素(IL)-2、IL-4和IL-10表达水平,采用流式细胞仪检测外周血互助性T细胞(Th)1、Th2细胞占CD4^(+)T细胞的比例以及共信号分子CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4在CD4^(+)T细胞表面的表达水平,通过冠脉造影手术采用SYNTAX评分法评估ACS患者冠脉病变严重程度,比较四组上述各指标之间的差异并进行各指标之间的相关性分析。结果ACS患者外周血中Th1/Th2比值、Th1数量及相关细胞因子IFN-γ和IL-2的血清表达量高于对照组,其外周血CD3^(+)CD4^(+)T细胞的CD28、ICOS和PD-1表达量也高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);另外,STEMI组和NSTEMI组的这些指标也均高于UA组,差异有统计学意义(P<0.05);SYNTAX评分与外周血Th1数量、Th1/Th2比值、血清IFN-γ及IL-2水平和外周血CD3^(+)CD4^(+)T细胞的CD28及ICOS表达量呈明显正相关(P<0.05);外周血CD3^(+)CD4^(+)T细胞的CD28及ICOS表达量均与Th1数量、Th1/Th2比值、血清IFN-γ及IL-2表达水平呈明显正相关(P<0.05)。结论ACS患者外周血中的Th1、相关细胞因子IFN-γ和IL-2以及其CD3^(+)CD4^(+)T细胞的CD28、ICOS和PD-1表达较健康体检者均明显上调,其均可能在ACS的发病机制中发挥了重要作用。

可诱导共刺激分子信号介导的免疫应答对血吸虫性肝纤维化形成的影响

目的探讨可诱导共刺激分子（inducibleCO—stimulator，ICOS）信号介导的Th2极化对日本血吸虫所致肝纤维化的影响。方法建立ICOS转基因（ICOS—Tg）小鼠及野生型FVB／NJ小鼠日本血吸虫病模型，分别于感染前（0周）和感染后4、7、12、16和20周采集小鼠血清、脾淋巴细胞和肝脏。脾淋巴细胞用可溶性虫卵抗原（SEA）诱导培养72h后，应用ELISA法分别检测细胞培养上清中细胞因子1干扰素（IFN一1）、白细胞介素12（IL一12）、IL一4和IL．13水平．血清中SEA特异性抗体IgG及其亚类IgGl和IgG2a的水平．以及血清中透明质酸（HA）和羟脯氨酸（HYP）的含量。应用免疫组化法检测各期感染小鼠肝脏中α-平滑肌肌动蛋白（d．SMA）、转移生长因子B1（TGF—B1）和I型胶原蛋白（collagen—I）水平。分别应用苏木素．伊红（HE）染色法和胶原纤维Masson染色法动态观察感染小鼠肝脏虫卵肉芽肿病变及纤维化程度。结果ICOS．Tg小鼠Th2细胞因子IL一4和IL一13水平自感染后7～20周均显著高于野生型小鼠（P〈0．05），Thl细胞因子IFN-γ和IL-12两组之间差异均无统计学意义（P〉0．05）。ICOS—Tg小鼠的1’h2分化指数亦高于野生型小鼠．在感染后7～20周差异均有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。ICOS—Tg小鼠的SEA特异性抗体IgG、IgGl和IgG2a水平均显著高于野生型小鼠（P〈0．05或P〈0．01，感染后4～7周IgG水平除外），IgGl／IgG2a比值均高于野生型小鼠，其中感染后12和16周（ICOS．Tg小鼠为5．75±0．94和4．96±0．98，野生型小鼠为4．31±0．81和3．41±0．83）差异有统计学意义（P〈0．05）。ICOS—Tg小鼠血清中HA和HYP的水平均高于野生型小鼠，分别在感染后7～20周及12～20周两组差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。免疫组化结果显示，ICOS．Wg小鼠于感染后7～20周肝脏仪一SMA和TGF—B1蛋白表达水平均显著高于野生型小鼠（P〈0．05或P〈0．01）；collagen-I的表达水平亦高于野生型小鼠，但仅在感染后20周两组差异有统计学意义（P〈0．05）。肝组织HE染色结果显示，ICOS-Tg小鼠于感染后7、12和16周的单卵肉芽肿体积『分别为（28．72±6．68）×106、（20．47±5．09）×106和（12．77±4．86）×106μm3]，均显著大于同期野生型小鼠『分别为（18．04±6．21）x106、（15．28±4．87）×106和（11．24±4．38）×10^6μm3]（P〈0．05）。Masson染色结果显示．ICOS—Tg小鼠的肝脏纤维化程度较高．但两组的纤维化程度评分差异无统计学意义（P〉0．05）。结论感染日本血吸虫ICOS．Tg小鼠的Th2免疫应答显著上调．且其肝纤维化程度和相关指标均增强．表明ICOS信号介导的Th2极化与感染日本血吸虫导致的肝纤维化有关。

携带可诱导共刺激分子基因的重组腺病毒载体构建及其在小鼠间充质干细胞中的表达

目的阻断可诱导共刺激途径协同骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可能能增强急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease,aGVHD)的防治作用。文中旨在构建携带小鼠可诱导共刺激分子(inducible costimula-tor,ICOS)基因的重组腺病毒载体,转染小鼠骨髓MSCs,为转基因治疗提供实验基础。方法设计含有EcoRⅠ、SalⅠ酶切位点的引物,PCR扩增ICOS,将扩增产物克隆到穿梭质粒PDC318上,筛选阳性克隆,测序鉴定正确,将其与含有5型腺病毒右臂的质粒pPE3-F11B-EGFP在293细胞中同源重组,筛选获得含有ICOS基因的重组腺病毒质粒,行PCR鉴定。重组腺病毒质粒转染293细胞,扩增后用氯化铯密度梯度离心纯化病毒,用50%组织培养感染剂量法测定病毒滴度,并转染小鼠MSCs。结果重组腺病毒质粒经鉴定,证实含有ICOS基因,病毒滴度为6.54×109pfu/ml。转染小鼠MSCs,荧光显微镜下可见较多绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪检测ICOS表达率为90.16%。结论成功构建了携带小鼠ICOS基因的重组腺病毒载体,并获得高滴度的病毒,能高效转染小鼠MSCs,为后续研究奠定了基础。

可诱导的shRNAs表达系统对HeLa细胞SMYD3基因表达的抑制

目的:探讨可诱导的shRNAs表达载体介导的RNA干扰技术对HeLa细胞SMYD3基因的抑制作用。方法:设计和构建由强力霉素调控产生针对SMYD3基因的shRNAs表达质粒,转染至HeLa细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学变化,RT-PCR检测SMYD3基因的表达,MTT法检测对细胞增殖的影响。结果:酶切鉴定、测序分析证实shRNAs表达质粒构建成功。转染HeLa细胞后,在强力霉素诱导下,受到特异SMYD3 shRNAs干扰的HeLa细胞发生了典型的凋亡形态学改变。同时SMYD3 mRNA表达下调,细胞生长受抑制。而阴性对照组和空白对照组无明显变化。结论:针对SMYD3基因的可诱导的shRNAs表达质粒转染HeLa细胞后,在强力霉素的作用下,可阻断SMYD3基因的表达,抑制HeLa细胞的增殖,并能诱导HeLa细胞凋亡。

小麦TaWRKY46-1基因克隆及建立在Gateway技术上的可诱导表达载体的构建

以小麦品种扬麦158为材料,根据NCBI中小麦TaWRKY46基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从小麦总RNA中分离了大小为870 bp的cDNA片段。测序表明,该片段与NCBI中已克隆的小麦TaWRKY46基因高度同源,包含完整的读码框,值得注意的是此蛋白保守氨基酸序列WRKYGQK突变为WRKYGEK,为TaWRKY46的新等位基因,命名为TaWRKY46-1。采用Gateway克隆技术构建了该基因的可诱导型超量表达载体,并转化农杆菌,为接下来转基因验证TaWRKY46-1的功能奠定了基础。

稳定表达可诱导共刺激分子CHO细胞株的筛选及其生物学活性鉴定

目的:构建携带人可诱导共刺激分子(inducible costimulator molecule,ICOS)基因的重组逆转录病毒载体,筛选稳定表达ICOS蛋白的CHO细胞株,并对其生物学活性进行鉴定。方法:RT-PCR法从人PBMC中获取ICOScDNA,定向克隆到逆转录病毒载体上,制备逆转录病毒重组体pMSCV-ICOS;经病毒包装细胞包装后抗性筛选出产高滴度病毒的细胞株,用高滴度病毒上清感染CHO细胞,抗性筛选出稳定表达细胞株。将CHO-ICOS细胞和PBMC以不同比例(1:1、1:2、1:5、1:10)共培养,加入亚刺激剂量(200ng/ml)的抗人CD3抗体,采用3H-TdR掺入法检测PBMC的增殖,流式细胞仪检测T细胞表面活化分子CD25表达情况,并以CHO-pMSCV细胞和PBMC以1:1比例共培养作为阴性对照以及未处理的PBMC作为空白对照。结果:成功构建逆转录病毒重组体pMSCV-ICOS,筛选出稳定表达ICOS蛋白的CHO细胞株。3H-TdR掺入法和流式细胞仪检测结果表明,与阴性对照及空白对照相比,CHO-ICOS细胞与PBMC共培养能抑制CD3抗体诱导的PBMC增殖及活化(P<0.05或P<0.01),细胞比例为1:1时抑制率最大,分别为(68±5.9)%、(44.08±3.26)%。结论:成功建立具有生物学活性的膜稳定表达人ICOS蛋白的CHO细胞株,为今后研究奠定了基础。

异位性皮炎患者外周血T淋巴细胞CD_(28)和可诱导共刺激分子的表达

目的探讨CD28和可诱导共刺激分子(ICOS)在异位性皮炎(AD)患者外周血T淋巴细胞的表达。方法采用免疫荧光双标记流式细胞术检测25例AD患者外周血T淋巴细胞CD28和ICOS的表达,参照欧洲AD评分标准(SCO-RAD)对病情严重程度进行评分,分析CD28和ICOS的表达水平与病情严重程度的相关性。结果AD患者组外周血T淋巴细胞CD28和ICOS的表达水平高于正常对照组(P<0.01),ICOS的表达水平与SCORAD评分呈正相关(r=0.68,P<0.01)。结论AD患者外周血T淋巴细胞CD28和ICOS表达增高,ICOS的表达水平可作为反映病情严重程度的一个指标。

日本血吸虫感染可诱导共刺激分子配体基因敲除小鼠CD154和CD40动态变化及对Th1/Th2偏移的影响

目的:探讨可诱导共刺激分子(inducible costimulator,ICOS)-ICOS配体(ICOS ligand,ICOSL)信号通路对感染日本血吸虫小鼠的CD154、CD40表达及Th1/Th2偏移的影响。方法:建立ICOSL基因敲除(ICOSL knockout,ICOSL-KO)小鼠及野生型C57BL/6J小鼠感染日本血吸虫疾病模型,于感染前和感染后4、7、12、16、20周,应用流式细胞术、免疫组织化学法分别检测小鼠脾细胞与肝虫卵肉芽肿周围炎性浸润细胞CD154、CD40的水平;应用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠脾细胞经可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen,SEA)诱导72 h后培养的上清液中γ-干扰素(interferon gamma,IFN-γ)、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)水平及小鼠血清中SEA特异性抗体Ig G、Ig G1、Ig G2a的水平;应用HE染色观察小鼠肝虫卵肉芽肿病变动态变化。结果:感染后4、7、12、16、20周,ICOSL-KO小鼠脾细胞CD154、CD40水平与野生型小鼠相比,显著降低[CD154为(18.62±4.76)%vs.(27.91±3.94)%、(22.44±4.67)%vs.(40.86±5.21)%、(25.50±6.81)%vs.(43.81±8.41)%、(20.22±5.28)%vs.(40.95±7.34)%、(17.87±4.59)%vs.(33.16±6.31)%,皆P<0.01;CD40为(19.43±3.26)%vs.(24.37±3.59)%、(23.00±4.47)%vs.(31.80±5.86)%、(24.46±5.01)%vs.(35.85±5.32)%、(23.42±4.69)%vs.(33.30±6.14)%、(22.85±3.78)%vs.(30.88±5.94)%,皆P<0.05]。感染后7、12、16、20周,ICOSL-KO小鼠肝虫卵肉芽肿炎性浸润细胞CD154、CD40水平与野生型小鼠相比,亦显著降低[CD154为(0.319±0.066)vs.(0.488±0.086)、(0.389±0.067)vs.(0.596±0.082)、(0.378±0.064)vs.(0.543±0.072)、(0.348±0.069)vs.(0.523±0.076),皆P<0.01;CD40为(0.398±0.066)vs.(0.546±0.079)、(0.461±0.085)vs.(0.618±0.076)、(0.453±0.087)vs.(0.587±0.074)、(0.449±0.065)vs.(0.565±0.082),皆P<0.05]。感染后,ICOSL-KO小鼠IFN-γ表达显著高于野生型小鼠(P<0.05),而IL-4表达水平则显著低于野生型小鼠(P<0.05),其Th2分化指数亦显著低于野生型小鼠(P<0.01)。ICOSL-KO小鼠血清SEA特异性抗体Ig G、Ig G1、Ig G2a的水平与Ig G1/Ig G2a的比值亦显著低于野生型小鼠(P<0.01),且ICOSL-KO小鼠的肝虫卵肉芽肿体积显著小于野生型小鼠(P<0.01)。结论:ICOS-ICOSL信号通路在血吸虫病免疫病理中起重要调控作用,其对Th1/Th2偏移的影响可能是通过调控CD154-CD40信号通路来实现的。

可诱导慢病毒载体的优化策略及应用

以1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)为基础构建的慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、免疫反应小、携带的基因片段容量大和可整合进宿主基因组而长期表达等优点,因而成为最理想的基因转移载体之一。可诱导慢病毒载体介导的可诱导基因表达系统能够有效控制目的基因表达,扩大了慢病毒载体的临床应用潜能,成为很有前景的基因治疗载体。主要介绍带有四环素和其他几种诱导系统的可调控性慢病毒载体及其改进,以及可诱导慢病毒载体在RNA干扰中的应用。

可诱导高拷贝的正交琥珀抑制性tRNA筛选质粒的构建

为筛选获得对大肠杆菌氨酰合成酶具有高度正交性的琥珀抑制tRNA,建立了一种基于可诱导高拷贝质粒的筛选系统。利用乳糖操纵子对oriL复制子进行调控,有IPTG存在时使其携带的琥珀抑制性tRNA大量转录。正交性不高的琥珀抑制性tRNA大量转录时导致宿主菌死亡,只有携带高正交性的琥珀抑制性tRNA的克隆可以存活,从而达到筛选目的。利用这一筛选质粒,构建了琥珀抑制性tRNA突变文库,并进行了筛选,获得了与大肠杆菌氨酰tRNA合成酶具有高度正交性的突变体,并利用含琥珀抑制突变的半乳糖苷酶突变体进行了验证,证实利用可诱导高拷贝的筛选质粒可筛选出高正交性的琥珀抑制性tRNA突变体。

可诱导共刺激分子在BXSB狼疮小鼠肾脏中的表达

目的观察可诱导共刺激分子(ICOS)在BXSB狼疮小鼠肾脏中的表达,探讨ICOS在狼疮肾炎发病机制中的潜在作用。方法选取8周龄及16周龄雄性BXSB小鼠各6只,并以8周龄C57BL/6雄性小鼠6只为正常对照,用免疫组织化学及实时荧光定量PCR方法,检测ICOS在小鼠肾脏中的表达水平。结果正常对照组C57BL/6小鼠肾组织ICOS染色少许肾小管细胞呈浅棕色;8周龄及16周龄BXSB小鼠肾脏组织ICOS强阳性表达,细胞呈深棕色着色,分布于肾小管。8、16周龄BXSB组小鼠肾组织内ICOS mRNA表达水平[(6.43±0.92),(9.48±1.30)]均较正常对照组(4.58±0.63)增加,差异有统计学意义(均P<0.01);16周龄BXSB组小鼠的ICOS mRNA表达水平较8周龄BXSB组增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论肾组织ICOS的分布及表达增加可能是BXSB小鼠狼疮肾炎发病的重要机制之一。

可诱导共刺激分子和小鼠免疫球蛋白融合基因的分泌表达及生物学活性

目的：为获得重组可诱导共刺激分子胞外段与小鼠免疫球蛋白的融合蛋白（ICOS-Ig）并研究其生物学活性，以探讨它作为免疫拮抗剂阻断ICOS／B7RP-1共刺激通路的作用。方法：克隆编码人可诱导共刺激分子（ICOS）胞外片段，与编码小鼠免疫球蛋白IgG恒定片段（Ig）的基因融合，构建ICOS-Ig融合基因及其分泌型真核表达载体pSecTag2／Hygro A-ICOS-Ig；构建融合蛋白的稳定真核表达细胞株，用Western blot和ELISA法检测其表达、流式细胞仪（FACS）检测其配体结合活性、混合淋巴细胞反应（MLR）及细胞因子检测测定其生物学活性。结果：核苷酸序列测定显示克隆基因的核苷酸与Genebank序列一致：ELISA和Western blot检测表明转染细胞有分泌型重组蛋白的表达，其含量可达5～25μg／ml；该重组蛋白有配体结合活性，可体外抑制淋巴细胞增殖、减少IL-2、IFN-γ的分泌。结论：重组ICOS-Ig融合基因及其真核表达载体的构建完成并获得高效表达，该重组蛋白具有配体结合活性，可在体外通过抑制ICOS／B7RP-1共刺激通路抑制淋巴细胞增殖及细胞因子分泌。

T细胞可诱导共刺激分子配体胞外段基因的克隆与表达

目的:克隆T细胞可诱导共刺激分子配体胞外段(ICOSL-N)基因,构建pET22b-ICOSL-N-Ig原核表达载体,实现ICOSL-N与IgG4体外融合表达。方法:设计并合成T细胞ICOSL-N和IgG4基因特异性引物,RT-PCR法从小鼠脾脏中克隆出ICOSL-N,PCR重叠延伸技术将ICOSL-N与IgG4基因融合,构建原核表达载体pET22b-ICOSL-N-Ig,转化E.coli BL21(DE3)工程菌,筛选鉴定阳性克隆,IPTG诱导阳性重组子,SDS-PAGE法鉴定融合蛋白ICOSL-N-Ig的表达。结果:融合基因ICOSL-N-Ig的PCR扩增产物大小约1425 bp,符合理论值;原核表达载体pET22b-ICOSL-N-Ig经酶切、PCR和测序鉴定结果符合预期;在诱导后的菌体中检测出大小为53800的蛋白诱导条带,且与目标蛋白的大小一致。结论:成功克隆ICOSL-N基因,实现ICOSL-N在E.coli BL21(DE3)工程菌中与IgG4的融合表达。

可诱导共刺激分子在川崎病患儿外周血T淋巴细胞的表达

目的探讨可诱导共刺激分子(ICOS)在川崎病(KD)及KD伴有冠状动脉损害,IVIG非敏感型KD发病机制中的作用。方法应用荧光定量PCR检测48例KD组和30例KD IVIG治疗组ICOSmRNA表达的变化。同时以25例同龄健康儿童和20例急性支气管肺炎患儿作为对照。结果 KD组与对照相比,ICOSmRNA表达显著升高(17.97±7.22对8.01±5.15,P<0.01)。其中冠状动脉损害组较无冠状动脉损害组ICOS表达异常升高(29.09±10.55对11.68±5.11,P<0.01)。KD IVIG组与KD组比较,ICOSmRNA表达降低(13.03±5.15对17.97±7.22,P<0.05)。其中IVIG不敏感组与IVIG敏感组比较,ICOS表达显著升高(21.57±6.22对9.85±5.89,P<0.05)。结论 B7/CD28家族分子中正性调节因子ICOS过度表达可能是导致KD免疫失衡的原因之一,正性调节因子过度表达可能与KD冠状动脉损害有关。IVIG治疗在纠正KD淋巴细胞过度活化中发挥作用,同时可能有下调正性调控因子表达的作用。

可诱导T细胞共刺激分子在结肠癌组织中的表达情况及其与远期生存的相关性研究

目的探讨分析可诱导T细胞共刺激分子(inducible T-cell co-stimulator,ICOS)在结肠癌组织中的表达情况及其与远期生存的相关性。方法选取2018年5月至2019年5月期间在大连大学附属新华医院进行手术切除结肠组织的206例结肠癌患者作为研究对象,取其结肠癌组织及癌旁组织标本,使用荧光定量PCR检测结肠癌组织及癌旁组织中可诱导T细胞共刺激分子表达水平,分析其表达与临床病理特征的关系及远期生存的相关性。结果结肠癌组织中ICOS表达水平(8.73±2.25)显著低于癌旁组织的(18.54±3.26),差异有统计学意义(P<0.05);结肠癌组织中ICOS表达水平与肿瘤直径、远处转移、临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05),与年龄、性别、肿瘤部位、分化程度差异无统计学意义(P>0.05);ICOS表达在206例结肠癌组织的中低表达117例,高表达89例;ICOS高表达和低表达与临床病理因素进行Logistic二次回归分析结果显示,ICOS表达与肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移、远处转移有关(P<0.05),与年龄、性别、肿瘤位置、分化程度无关(P>0.05);随访截止至2021年9月30日,206例结肠癌患者存活率83.01%(171/206),死亡率16.99%(35/206),中位生存时间为(23.5±3.3)个月。ICOS高表达的89例结肠癌患者的中位生存期为(27.4±3.2)个月,95%CI为2.234~6.147;ICOS低表达的117例结肠癌患者的中位生存期为(16.3±4.3)个月,95%CI为1.458~5.237,ICOS高表达结肠癌患者中位生存期显著高于ICOS低表达者(P<0.05)。结论ICOS在结肠癌组织中呈较低表达,其表达水平与患者远期生存呈正相关关系,其水平可作为结肠癌患者预后生存的重要评估指标。

可诱导共刺激因子在调节免疫反应中的作用

在T细胞表面受体中 ,除TCR外 ,CD2 8和CTLA - 4在调节T细胞的免疫反应中起关键性作用 ,它们均为共刺激信号 ,在调节T细胞活化中起重要作用。CD2 8在抗原特异性免疫反应中起加强T细胞功能的作用。而CD2 8的类似物CTLA - 4与CD2 8的作用则刚好相反 ,在防止免疫系统的过度活化中起负调节作用。由于CD2 8和CTLA - 4的相互作用 ,而使免疫系统处于动态平衡中。最近人们发现了可诱导共刺激因子 (ICOS) ,它也是CD2 8的类似物 ,在调节T细胞对外来抗原反应中起重要作用。

可诱导共刺激分子诱导骨髓来源不成熟树突状细胞特异性分泌IL-6

目的:分析可诱导共刺激分子(ICOS)可溶性融合蛋白(ICOSIg)能否向不成熟DCs传递逆向信号及其性质。方法:以流式细胞仪结合特异性抗体检测DCs表型分子改变;以ELISA检测培养上清细胞因子变化;以RT-PCR检测各组DCs细胞内细胞因子及受体、趋化因子等mRNA表达水平。结果:ICOSIg或膜锚定ICOS作用于不成熟DCs,均可诱导其高表达MHC-Ⅱ、CD80、CD86和CD83等表型分子;促进DCs特异性分泌IL-6。结论:ICOS作用于不成熟DCs表面的ICOSL可以向DCs细胞传递逆向信号,诱导DCs细胞高分泌IL-6,同时其表面重要的表型分子也上调,可能参与了DCs细胞免疫功能的调节,其信号转导机制可能涉及p38-MAPK通路。