低渗诱导合浦珠母贝的三倍体

为了探究不同盐度对诱导合浦珠母贝三倍体的效果,本研究首次利用低渗方法诱导合浦珠母贝三倍体,通过控制变量法从不同盐度、诱导时机以及诱导时间中探究最适诱导条件。同时对合浦珠母贝卵裂率、孵化率以及存活率、壳长、三倍体率的变化进行了探究。结果显示,在盐度14、50%受精卵释放第一极体(PBⅠ)及诱导15 min时D形幼虫的三倍体率最高,分别为64.16%±6.92%、65.87%±6.51%以及65.14%±1.93%。三倍体幼虫并未表现出明显优势;低渗对胚胎造成的影响使幼虫存活率和三倍体率有所下降。通过对卵裂率、孵化率和15日龄存活率、壳长及三倍体率进行主成分分析,在三种诱导条件中均保留了前两个主成分,且保留的主成分的累积方差贡献率均超过了85%。盐度14、50%受精卵释放PBⅠ及诱导15 min分别在各自实验中的综合评价得分分别为第6、第1和第1。该研究表明,合浦珠母贝三倍体幼虫在生长方面的优势不明显,50%受精卵释放PBⅠ及诱导15 min两个诱导条件适合合浦珠母贝三倍体诱导。本研究可为合浦珠母贝三倍体育种提供一种新的思路,有助于提高生产效益。

广西合浦珠母贝3个不同群体遗传关系分析

为探索广西合浦珠母贝群体内杂交组合方式,分别从北海野生群体(F_(1))、选育群体(F_(4))和养殖群体中随机挑选2龄种贝样本15个,进行简化基因组测序,通过单核苷酸多态标记解析3个群体的遗传关系。研究结果显示,获得超过585000个单核苷酸多态标记,野生群体、选育群体和养殖群体的观测杂合度分别为0.1975、0.1679和0.1783,期望杂合度分别为0.2545、0.2469和0.2732,平均近交系数分别为0.2075、0.3449和0.3465,多态信息含量分别为0.2032、0.2089和0.2241,选育群体近交系数与养殖群体相近,野生群体和养殖群体的群体遗传多态高于选育群体。系统进化树和主成分分析显示,选育群体与养殖群体部分样品亲缘关系较近。选育群体和养殖群体之间的遗传分化指数最低,部分亲本同源的可能性较大;野生群体、选育群体和养殖群体的平均长纯合片段数分别为59.1、49.5个和56.6个,长纯合片段平均长度分别为0.312、0.313Mb和0.311Mb,平均单核苷酸多态标记含量分别为59、50和73,近交系数FROH分别为0.0149~0.0240、0.0159~0.0201和0.0170~0.0246,反映3个群体的真实近交水平较低;野生群体、选育群体和养殖群体的整个染色体内连锁不平衡衰减距离分别为0.4、0.4kb和0.2kb(r2=0.2),衰减速度为养殖群体>野生群体>选育群体,选育群体衰减速度最慢,可能与人工选育有关。以上结果表明,广西合浦珠母贝可采用野生群体×选育群体或野生群体×养殖群体的杂交组合方式开展群体内杂交。本研究结果可为广西合浦珠母贝育种中的亲本选择提供参考。

高温胁迫对合浦珠母贝不同群体存活及免疫酶活性的影响

为比较合浦珠母贝(Pinctada fucata)不同群体在高温胁迫下的存活及免疫酶活性变化情况,本实验以“海优1号”(YY)、“海选1号”(XX)、“南科1号”(KK)和广西潜在耐高温养殖群体(TT)为实验材料,通过渐变升温的方式测定4组合浦珠母贝在35℃水温胁迫下的生理指标,研究不同胁迫时长对合浦珠母贝存活及其鳃组织内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)和碱性磷酸酶(AKP)活性的影响。研究显示,实验第8天开始出现个体死亡,TT组在实验12 d后存活率显著高于其余3组(P<0.05);4个群体的SOD、CAT和T-AOC活性随胁迫时间的延长大致呈上升-下降的趋势,在1~24 h内免疫酶活性呈上升趋势,在120 h后下降至对照水平以下;在高温胁迫下各组的AKP活性增加,KK、TT与XX、YY分别在12和24 h达到峰值,在120 h显著下降。本研究初步探明了高温胁迫下合浦珠母贝的免疫应答机制。

合浦珠母贝2个野生种群的遗传多样性

用形态特征比较与同工酶电泳分析相结合的方法 ,对产于我国北部湾和大亚湾的野生合浦珠母贝 (Pincta damartensii)的遗传多样性进行研究。结果表明 ,在贝壳形态方面 ,北部湾种群的平均壳长与壳高都略大于大亚湾种群 ,壳高与壳长呈乘幂相关 ,壳宽与壳长呈对数相关。大亚湾种群的壳宽指数、壳重指数和肥满度指标都大于北部湾种群。用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳检测由 2 6个位点编码的 12种同工酶 ,2种群都显示出较高的多态性 ,北部湾种群多态位点的比率为 38.4 6 % ,大亚湾种群则为 4 6 .15 %。都表现出明显的杂合子缺失现象 ,北部湾种群的平均杂合度 (0 .0 999)小于大亚湾种群 (0 .12 4 3)。 2种群之间的遗传距离为 0 .0 15 9。本文还讨论了引起 2种群杂合子缺失现象的原因 ,并认为生化遗传分析的结果与 2个种群的形态特征是相关联的。

合浦珠母贝3个养殖群体的RAPD分析

利用RAPD标记技术检测了广西省北海市、海南省三亚市、广东省深圳市等 3个地理种群养殖合浦珠母贝(Pinctadamartensii)基因组DNA的多态性 ,并对其遗传结构进行了初步分析。从 4 0个随机引物中筛选出 13个10bp引物 ,它们在 3种群中共扩增出了 14 0条DNA片段 ,3种群共有片段 16条 ,DNA片段数分别为 5 8、91和 71条 ,多态性位点比例分别为 4 1 4 % ,6 5 0 %和 5 8 4 %。遗传距离分析表明 ,广西种群与广东种群的亲缘关系较近 ,而与海南种群亲缘关系较远。 13个引物中 ,引物S11和S3 58扩增出的 3种群指纹图谱差异显著 ,可作为 3种群鉴定的分子标记。

合浦珠母贝三倍体的卵诱导四倍体

将合浦珠母贝三倍体的卵与二倍体的精子授精 ,用 0 .5 μg/mL细胞松弛素B抑制受精卵第一极体的释放诱导四倍体。研究了处理起始时间及持续时间对胚胎孵化率和四倍体诱导率的影响及幼虫的生长及存活。实验结果表明 :持续时间与胚胎孵化率呈负相关 ,而与四倍体诱导率呈正相关 ,持续时间一般为1 5～ 1 8min ,处理起始时间一般在第一极体出现前 3～ 5min。在胚胎期 ,四倍体诱导率平均为 2 0 %。在幼虫培养阶段 ,幼虫死亡严重 ,收苗率极低 ,平均只有 0 .0 2 %。处理组与未处理组的生长差异不明显 (p >0 .0 5 ) ,但两组幼虫生长明显慢于二倍体组 (p <0 .0 5 )。

合浦珠母贝遗传连锁图谱的构建

用AFLP标记构建了印度合浦珠母贝(Pinctada fucata)全同胞家系的遗传图谱。用经过筛选的36对引物组合对父母本和62个子代个体进行遗传分析,共得到1 547个标记,包括581个1∶1分离标记。母本分离标记294个,其中178个符合1∶1孟德尔分离规律;父本分离标记287个,其中182个符合1∶1孟德尔分离规律。雌性框架图包括33个遗传标记,分布在14个连锁群中,标记间平均间隔24.3 cM,有2个3联体,11个连锁对,图谱总长度为488.5 cM。雄性框架图包括53个遗传标记,分布在19个连锁群中,标记间平均间隔30.5 cM,有4个3联体,10个连锁对,图谱总长度为1 035.5 cM。雌雄两个框架图中AFLP标记的分布都较均匀。雌雄基因组估算长度分别为1 168.4 cM和2 037.1 cM,图谱覆盖率分别为41.8%和50.8%。本研究为进一步构建高密度遗传连锁图谱及QTL定位分析奠定了基础。

合浦珠母贝碱性磷酸酶的分离纯化与性质研究

以合浦珠母贝 (Pinctadafucata)为提取酶的原料 ,经Tris HCl缓冲液 (pH7.5)抽提 ,正丁醇处理 ,硫酸铵分级沉淀分离 ,DEAE 纤维素离子交换树脂柱层析 ,DEAE A25离子交换分子筛柱层析纯化 ,得到一定纯度的碱性磷酸酶 ,比活力达到1444U/mg。酶学性质和动力学性质研究表明 ,该酶催化对硝基苯磷酸 (pNPP)的水解反应 ,最适 pH值为9.72,最适温度为45℃ ,水解反应的活化能为Ka=21.4kJ/mol,初速度为6.1μmol/L,米氏常数Km 值为2.86mmol/L,Vm 值为9.09μmol/L。产物类似物HPO2 - 4,WO3 - 4 对该酶均有明显的抑制作用 ,表现为竞争性抑制。金属离子对该酶的催化活力有不同的影响 ,正一价金属离子对该酶活性无影响 ,Mg2 +,Co2 +,Mn2 +对该酶有激活作用 ,Zn2 +对该酶有明显的抑制作用。

4种壳色合浦珠母贝贝壳棱柱层和珍珠质层7种金属元素质量分数的比较分析

利用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-AES)对合浦珠母贝(Pinctada fucata)黑、金、红、白F5代选育群体贝壳棱柱层和珍珠质层的7种金属元素质量分数进行比较分析。结果显示,合浦珠母贝贝壳棱柱层中铁(Fe)、钾(K)、镁(Mg)和锰(Mn)的质量分数明显高于珍珠质层,而钠(Na)、Sr(锶)和锌(Zn)的质量分数则低于珍珠质层。4种壳色棱柱层和珍珠质层中的金属元素质量分数均存在差异:Mg、Sr、K、Zn在黑壳合浦珠母贝棱柱层中质量分数最低,Mn、Fe在金壳棱柱层中最低,而Na却在红壳棱柱层中最低;单因素方差分析显示,Fe、Mg、Zn可能分别会影响合浦珠母贝红壳、金壳、白壳的形成。白壳贝珍珠质层的6种金属元素(Mg除外)质量分数都最少,更有可能培育出优质珍珠。

合浦珠母贝双列杂交家系的建立与遗传分析

以采自广西北海(B)、广东徐闻(X)、海南三亚(S)的3个不同养殖群体的合浦珠母贝为亲贝,按照完全双列杂交的方式,建立了9个交配组合,每个组合10个家系,共90个家系。出苗经60d养殖后,比较各家系的育种值,并对家系进行综合评价。结果表明:壳长的Kung育种值大于20的家系有8个,分别为BX2(表示北海♂×徐闻♀的2号家系,余依此类推)、BX9、BB4、BB5、BB8、BS9、XS3、SB8,其中XS3的壳长及壳宽的Kung育种值和综合评定值均最大,XX3最小。BB4和XS3的综合评定值大于1。壳长的一般配合力为三亚群体17.40,徐闻17.45,北海18.27;壳高为三亚14.74,徐闻14.79,北海15.54。壳长的特殊配合力为三亚—徐闻17.75,三亚—北海18.27,徐闻—北海18.12;壳高为三亚—徐闻14.98,三亚—北海15.51,徐闻—北海15.46。壳长的平均杂种优势为三亚—徐闻1.41,三亚—北海0.96,徐闻—北海0.67;壳高为三亚—徐闻1.13,三亚—北海1.60,徐闻—北海1.19。表明北海的亲本较好。

合浦珠母贝肉短肽的分离及其抗氧化活性研究

为制备具有抗氧化能力的合浦珠母贝肉活性肽,本文采用Sephadex G-25分子筛层析法对合浦珠母贝肉酶解产物进行分离,测定分离到的各活性组分分子量及其总抗氧化活性、DPPH自由基清除能力及羟自由基清除能力。结果表明,合浦珠母贝肉酶解产物经Sephadex G-25分离得到6个主要活性组分,相对分子量分别为1437.5、833.7、421.9、244.7、89.0、17.4u,其中功能短肽F1(1437.5u)、F2(833.7u)、F4(244.7u)的抗氧化效果较强,特别是F2(833.7u)短肽具有最强的总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力及羟自由基清除能力。该研究为合浦珠母贝肉抗氧化活性肽的开发提供理论技术依据。

基于FIASCO技术的合浦珠母贝微卫星标记分离与筛选研究

用FIASCO(Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing Repeats)技术开展了合浦珠母贝Pinctada fucata基因组微卫星标记的分离与筛选研究。合浦珠母贝基因组DNA经限制性内切酶MseI酶切后与接头连接,用生物素标记的(CA)15探针与其杂交,然后用磁珠富集、洗脱获得单链目的片段,经PCR扩增后形成双链,最后进行克隆转化,构建微卫星富集文库。挑选克隆用探针引物(CA)15和载体引物进行第2次筛选,获得阳性克隆357个,测序结果表明,297个克隆(83.2%)含有微卫星序列,包括479个微卫星DNA结构域。其中完美型微卫星有370个(77.3%),非完美型95个(19.8%),复合型14个(2.9%)。合成引物49对,有31对(63%)扩增出目的产物,其中9对在种群中(n=32)具有扩增多态性,其多态信息含量PIC值在0.375―0.809之间,平均为0.536;等位基因数在2―9个之间,平均为4.889个;观测杂合度介于0.200―0.600之间,平均为0.415;期望杂合度的变化范围为0.454―0.844,平均为0.598。表明FIASCO技术适合于合浦珠母贝微卫星标记的分离与筛选。

合浦珠母贝热休克蛋白hsp70基因的克隆与表达分析

采用同源克隆和RT-PCR技术对合浦珠母贝(Pinctada fucata)热休克蛋白hsp70基因进行了克隆和表达分析。获得cDNA全长序列2 365 bp,其中3’非编码区域(UTR)为318 bp,5’UTR为88 bp,开放阅读框(ORF)为1 959 bp,编码652个氨基酸,分子量约为71.39 kD,理论等电点为5.22,并含有3个HSP70家族的签名序列IDLGTTYS、DLGGGTFD和EEVD。同源性分析表明,合浦珠母贝HSP70的氨基酸序列与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)等双壳贝类的相似性高达86%以上,基于氨基酸序列的聚类分析表明,合浦珠母贝与牡蛎属种类亲缘关系最近。高温、高盐刺激后,半定量RT-PCR检测发现hsp70基因的表达明显增加,高温刺激的表达量高于高盐刺激,高温刺激组不同组织的表达量由大到小依次为鳃、消化腺、外套膜、肌肉、性腺,高盐刺激组不同组织的表达量由大到小依次为鳃、外套膜、肌肉、消化腺、性腺,表明HSP70参与了机体对刺激的应答过程。该基因的克隆为进一步深入研究合浦珠母贝的抗逆机理及其遗传改良奠定了重要基础。

合浦珠母贝同工酶的电泳分析

采用聚丙烯酰胺梯度凝胶垂直板电泳技术和特异性染色方法 ,对合浦珠母贝外套膜、闭壳肌、肝脏和鳃组织中的 15种同工酶系统进行分析 ,结果表明 :a GPDH、ADH在 4种组织中均未见表达 ;AK、AMY、PGM、ALP、GDH和LDH只在肝脏中表达 ,而ME、SOD、EST、MDH、G6PD、6PGD和AAT则有较广泛的组织分布 ,其中 12个座位 (Aat 1、Aat 2、Sod 1、Sod 2、Sod 3、Sod 4、m Mdh c、G6pd 2、6Pgd 2、Ak 1、Gdh 1、Me 2 )具有多态性 ,多态位点比例为 4 6.1% ,平均杂合度 0 .112 2± 0 .0 576。

响应面法优化超声波辅助蛋白酶水解合浦珠母贝肉的条件研究

利用响应面法优化超声波辅助酶解合浦珠母贝肉的工艺条件。单因素试验研究超声波功率、温度、超声时间对水解度的影响,在此基础上,应用Box-Behnken中心组合设计建立数学模型,以水解度(DH)作为响应值,进行三因素三水平的响应面分析(Minitab)。结果表明,超声波辅助酶解合浦珠母贝肉的最佳工艺条件为:超声波功率160W、处理温度50℃、处理17min后,水解1h后产物水解度为31%,平均肽链长度3.2,与预测值的相对误差为0.5%。

合浦珠母贝对不同种类及浓度的单胞藻摄食与消化效果研究

从单胞藻粒径大小、表面结构、生化组成及饵料浓度等角度开展了合浦珠母贝(Pinctada fucata)对不同种类及浓度的单胞藻摄食与消化效果研究。投喂粒径大小相近的牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)和湛江叉鞭金藻(Dicrateria zhanjiangensis)混合藻,粒径大小不同的亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)和海水小球藻(Marine chlorella)混合藻,用细胞计数法检测剩余混合藻中各单胞藻浓度。分别投喂以上4种不同浓度梯度的单胞藻,观察比较粪便中单胞藻消化状况。结果显示,合浦珠母贝对粒径大小相近的单胞藻没有表现出明显的选择性摄食(P>0.05),对粒径较大的单胞藻摄食率明显高于粒径较小的单胞藻(P<0.05);随着投喂单胞藻浓度的升高,合浦珠母贝对单胞藻的消化程度降低。

响应面法优化合浦珠母贝糖胺聚糖提取工艺

以合浦珠母贝全脏器为原材料,经解冻匀浆和热水浸提后,采用枯草杆菌中性蛋白酶和胰蛋白酶双酶酶解,sevage法除蛋白2次,清液醇沉得糖胺聚糖粗制品(GAG),粗制品经DEAE-52离子交换柱纯化后得精制品。在单因素试验基础上,以粗制品得率与糖胺聚糖含量的乘积Y/(×10-4)为响应值,加酶量、液料比、酶解时间为影响因子,利用响应面试验分析法优化GAG的粗提工艺,得最佳提取工艺:加酶量为1.14%(枯草杆菌中性蛋白酶与胰酶质量的比为7∶8);液料比为3∶1(m L∶g)酶解时间为4.1 h。在此条件下,糖胺聚糖粗制品得率为0.518%,糖胺聚糖含量为10.9%,经DEAE-52柱纯化后的糖胺聚糖含量为89%。

合浦珠母贝选育家系的遗传多样性分析

该研究选取具有多态性的6对微卫星引物对构建的2批合浦珠母贝（Pinctada fucata）完全双列杂交家系的遗传多样性进行了分析。6个微卫星标记在9个家系360个个体中共检测到32个等位基因,有效等位基因（Ne）为1.758 7-3.586 5,观测杂合度（Ho）为0.144 4-0.488 9,期望杂合度（He）为0.432 0-0.722 2,Shannon指数（I）为0.691 9-1.507 4。9个家系都有单态位点,平均Ho为0.129 2-0.466 7,平均He为0.155 0-0.439 6,平均I为0.248 5-0.712 2。有19个位点（占35.19%）极显著地偏离Hardy-Weinberg平衡。各家系之间的遗传距离为0.109 0-1.137 2,遗传相似性系数为0.320 7-0.896 8。家系L4B46与L4B48的遗传距离最大,与D3D313的遗传距离最小。UPGMA法聚类分析显示,9个家系分为3支,L4B48单独成一支,B4D426、B4D427与D4B445聚成一支,其余家系聚成一支。该研究结果为合浦珠母贝家系选择育种的亲本选择与交配设计提供了科学依据。

合浦珠母贝组织蛋白酶L2基因的特征与组织表达分析

为了研究合浦珠母贝(Pincatada fucata)的先天免疫调控机制,利用cDNA文库筛选和重测序技术克隆了1个合浦珠母贝组织蛋白酶L的全长cDNA序列(命名为poCL2)。poCL2cDNA全长1094bp,5′-非编码区(Untranslated region,UTR)长21bp,3′-UTR长80bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)为993bp,编码330个氨基酸组成的多肽链,分子量为37.1kD,理论等电点为6.9。poCL2蛋白由信号肽(Met1-Ala16)、前体域(Arg17-Asp113)和成熟域(Leu114-Val330)三部分组成,存在一个潜在的糖基化位点(Asn97),6个底物结合位点(Leu182,Met183,Ala249,Leu275,Gly278和Ser324),1个由半胱氨酸(Cys138)、组氨酸(His277)和天冬酰胺(Asn297)残基构成的催化位点和2个组织蛋白酶L签名序列(E42X3RX3WX2NX3IX3N61和G74X1NX1YX1D80)。同源性分析表明,poCL2氨基酸序列与其他物种高度保守,相似性在61.5%～73.9%之间,同源性在44.4%～59.8%之间。进化分析显示,poCL2与其他无脊椎动物的组织蛋白酶L聚为一支,和淡水螺(Radix peregra)亲缘关系最近。组织表达分析表明poCL2mRNA在消化腺、外套膜、性腺、闭壳肌、肠、血淋巴和鳃组织中均表达,外套膜表达量最高。应激实验表明,经溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)或脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激后,poCL2mRNA在消化腺中的表达量显著上调,说明poCL2参与了合浦珠母贝的先天免疫应答反应,暗示其在合浦珠母贝先天免疫调控中发挥重要作用。

合浦珠母贝4种壳色选育系主要性状的比较分析

为评估合浦珠母贝(Pinctada fucata)白壳、黑壳、红壳和金壳色选育系F6代的育种性能,对养殖达18个月龄4种壳色合浦珠母贝的形态、质量、闭壳肌拉力和抗才女虫寄生病等12个性状指标进行了方差分析和多重比较。结果显示,4种壳色选育系间壳高、绞合线长、壳宽、体质量、壳质量、软体部质量、闭壳肌质量、闭壳肌拉力、右壳感染率和贝壳感染率均存在显著差异(P<0.05)。综合相关分析表明,白壳色选育系可作为壳高和低才女虫感染率同时选育的最优育种群体,金壳色选育系可作为壳宽、体质量和闭壳肌拉力复合选育的最优育种群体。该研究结果为开展合浦珠母贝多性状复合选择育种工作提供了科学根据。