甘蔗CIPK基因的同源克隆与表达

CIPK （calcineurin B-like-interacting protein kinase）是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫（干旱、高盐、ABA等）的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因（EU957447.1,2247 bp）核酸序列保守区域设计1对同源克隆PCR引物,以甘蔗品种崖城05-179的cDNA为模板,通过RT-PCR扩增得到甘蔗CIPK基因的一条全长cDNA序列（GenBank登录号为 KM114052）。序列分析结果表明,甘蔗ScCIPK基因全长1782 bp,具有完整的开放阅读框（ORF,91~1631 bp）,编码513个氨基酸,该基因具有CIPK基因的2个特征结构域（Kc-like superfamily和AMPKA-C-like superfamily）。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要参与中间代谢。实时定量PCR表达分析表明,该基因表达具有组织特异性,虽在甘蔗各组织中均有表达,但在芽中的表达量最高。该基因在PEG、NaCl、ABA、SA和MeJA的胁迫诱导过程中,受ABA胁迫后表达量最高,约为对照的5.3倍,推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关。

湿地松左旋β-蒎烯合成酶基因PeTPS-(-)BPin的同源克隆及生物信息学分析

通过火炬松等松属树种的c DNA序列同源克隆了湿地松的左旋β-蒎烯合成酶基因（Pe TPS-（-）BPin）,分析表明该基因与其他松属植物之间的同源性在90%以上,与松科其他属植物之间的同源性在80%以上。裸子植物不同萜烯合成酶基因（TPS）之间的同源性在70%以上。被子植物与裸子植物的TPS基因亲缘关系较远。左旋β-蒎烯合成酶的蛋白质分子式为C3197H4972N862O957S32,分子量为71.74 ku,带弱正电,为不稳定蛋白,易分解,含37个磷酸化位点,定位在叶绿体。蛋白质二级结构含有4个不规则卷曲,24个α-螺旋,三级结构中含有一个cd00684保守域。ELM中找到7个可能的功能域,包括一个NDR切割位点、两个磷酸肽配体、一个PDZ配体、一个SH2配体、两个磷酸化位点。在68、69位存在一个RR保守结构,猜测能够在第二个R的N末端断裂并与底物结合,从而参与底物异构化。在380-384位出现了DDxx D保守域,但未能在该区搜到可能的功能位点。预测的两个磷酸化位点位于302、623位氨基酸。

结缕草CBF基因的同源克隆及其转基因拟南芥的抗寒性验证

结缕草是优良的暖季型草坪草之一,主要用于亚热带和热带地区的草坪种植。抗冷性是结缕草栽培范围的限制因子。本研究以日本最北部原产的结缕草品系为材料,根据其他植物的已知的抗寒基因CBF序列,通过同源克隆的方法获得结缕草中相对应的同源基因ZjCBF;根据和其他已报告的CBF序列的比对结果,确定ZjCBF基因属于CBF转录因子家族基因中CBF1型基因。利用半定量PCR和实时定量PCR分析该基因在寒冷条件下的表达情况,发现ZjCBF基因受冷胁迫的诱导,在4℃处理6 h时表达量最高。在此基础上,本研究构建了该基因的过表达载体,并将其转化到拟南芥中,通过低温冷处理实验发现,不论是否经过冷驯化,转ZjCBF基因植株由于ZjCBF的过量表达均比野生型植株抗寒性强。

小麦铁结合蛋白基因的同源克隆

为了寻找一种简捷的克隆同源基因的途径,以小麦铁蛋白基因的同源克隆为例,利用玉米的铁结合蛋白基因序列比对小麦的EST库,在网上进行电子延伸后以起始密码子为起点,终止密码子为终点设计特异性强的引物进行基因克隆,经过引物O1和Fcds扩增片段的测序及Blast比对,证实本试验已成功地从小麦的基因组和cDNA中克隆出铁结合蛋白基因。最后对基于同源序列克隆基因的策略及引物设计技巧进行了探讨。

百萨偃麦草ThbGSK和ThbHKT1基因的同源克隆与表达分析

百萨偃麦草(Thinopyrum bessarabicum Lve,2n=2x=14,JJ)是小麦改良的重要亲缘物种。为了解GSK和HKT1基因在百萨偃麦草耐盐胁迫中的作用,本研究采用同源克隆的方法从百萨偃麦草中扩增获得了糖原合成酶激酶基因ThbGSK及高亲和性钾离子转运蛋白基因ThbHKT1的全长cDNA,ThbGSK基因全长1 233bp,与水稻、短柄草、小麦等物种的氨基酸一致性为93.92%～99.02%,表明GSK基因在这些物种间具有较高的保守性;聚类分析表明,ThbGSK与小麦TaGSK关系最近。ThbHKT1基因全长1 602bp,与水稻、小麦、短柄草、大麦等物种的氨基酸一致性为66.17%～92.87%,说明HKT1基因在这些物种间变异较大;聚类分析表明,ThbHKT1与大麦HvHKT1关系最近。RT-PCR和荧光定量PCR分析表明,经250mmol.L-1 NaCl胁迫处理后,GSK基因在百萨偃麦草和中国春诱导0～24h的叶片中表现为组成型表达,而HKT1基因在百萨偃麦草和中国春中均表现为诱导后上调表达。

基于同源克隆技术分离玉米漆酶基因片段

漆酶是木质素生物合成途径的关键酶,其高度保守的铜离子结合区以及N末端糖基化位点使利用同源克隆技术成为可能。本研究利用GeneBank中公布的黑麦草漆酶基因全长cDNA序列及在玉米数据库中的比对结果设计特异引物,以8份AS系列玉米自交系为模板进行PCR筛选。经过提取质粒、测序及对推导的氨基酸序列进行比对,发现所克隆基因片段中含有保守的H-A-H基元和N末端糖基化位点,为以后玉米漆酶基因全长的克隆以及饲用玉米改良打下了基础。

梭菌氢酶基因部分片段的同源克隆及敲除载体的构建

为从分子水平探索典型铁还原菌-梭菌的铁还原能力与其氢酶产氢之间的关系,以从水稻土中分离得到一株具有高铁还原能力和高产氢能力的梭菌为材料,通过同源克隆获得长度为761bp氢酶基因的部分序列。生物信息分析发现,该基因片段覆盖氢酶的活性中心,是氢酶的主要功能结构域。采用Overlap PCR的方法构建含有四环素抗性基因的氢酶基因敲除载体(pMD-19-HTH),以期进一步构建氢酶基因缺失的梭菌突变体,为分析氢酶产氢与铁还原的关系奠定基础。

同源克隆筛选小尾寒羊繁殖性状候选基因

以构建的小尾寒羊卵巢组织cDNA文库为基础,利用最新的生物信息数据资料,采用同源克隆的策略,以已知其他物种与排卵率相关基因片段标记的探针对小尾寒羊发情期卵巢组织cDNA文库进行筛选、克隆,获得小尾寒羊卵巢组织特异表达的与排卵有关的基因ESTs,从而得到小尾寒羊与繁殖性状相关的新的候选基因。

治疗性与生殖性克隆的分水岭——同源克隆实验评介

韩国科学家把从卵丘细胞中提取的DNA注入到同一位女性的无核卵细胞中去,并能发育至胚泡期,增殖细胞近100个,这就是“同源克隆”。这次的克隆十分成功,没有发现染色体的丢失或异常表达。同源克隆属于治疗性克隆,它的目的是建立胚胎干细胞系,让它们发育成为有特殊功能的细胞群,用于治疗。而生殖性克隆的目的则是培养出一个完整的胎儿,此类克隆有悖于伦理学道德,是人们应该严肃、慎重对待的问题。

小麦分蘖角度TaTAC1基因同源克隆及表达分析

分蘖角度影响植物群体结构、光合效率以及植株的形态建成,最终影响其产量及品质。小麦中关于分蘖角度的研究鲜有报道。前人研究显示,水稻OsTAC1正向调控分蘖角度的大小,玉米Zm TAC1与叶片角度呈正相关。本研究的目的是解析Ta TAC1的表达模式并初步了解该基因的分子遗传机制及其与分蘖角度的遗传关系。本研究以CN16、SM969、Lan2399、SHW-1为材料,利用同源克隆分离获得Ta TAC1,利用生物信息学软件对Ta TAC1进行序列特征分析,应用实时荧光定量PCR对其表达模式进行分析,并进行Ta TAC1蛋白的亚细胞定位分析。结果显示,Ta TAC1长度约1.1~1.2 kb,包括780 bp的完整开放阅读框和320~370 bp的3'-UTR。Ta TAC1的c DNA序列分为2类,其中CN16-2、SM969-2的第10号碱基发生突变,引起终止子提前,导致Ta TAC1表达受阻;Lan2399-2和SHW-1-2在109~115碱基位置有"CGCGCG"片段插入,导致蛋白质β-折叠片减少。表达分析表明,Ta TAC1在分蘖期的叶鞘、茎高效表达,分蘖节其次,叶与根表达量最低。相关分析表明该基因在分蘖节各时期表达量与分蘖角度呈显著正相关,Pearson相关系数为0.677,其他组织表达量与分蘖角度无显著相关性。亚细胞定位分析显示Ta TAC1定位于细胞膜。从上述结果可以推测Ta TAC1在mRNA水平上正向调控分蘖角度,且可能参与生长素极性运输过程从而改变分蘖角度大小。

甘蓝型油菜BnGS3和BnGhd7的同源克隆及其与油菜产量相关性状的关系

甘蓝型油菜为异源四倍体,基因组结构复杂,而水稻基因组与油菜基因组具有一定的共线性。本研究利用水稻产量相关基因GS3和Ghd7序列信息,通过同源克隆方法,获得了甘蓝型油菜的同源基因BnGS3和Bn Ghd7。BnGS3有6个外显子,ORF全长666 bp,编码222个氨基酸。BnGS3蛋白具有水稻GS3四个保守结构域中的VWF结构,属于A型。Bn Ghd7含有1个外显子,ORF全长1014 bp,编码337个氨基酸。Bn Ghd7蛋白具有N端的B-Box和C端的CCT两个重要的结构域。BnGS3和Bn Ghd7分别位于A2和A10连锁群,比较测序得到BnGS3的多态性标记brgs-16及Bn Ghd7的多态性标记brghd-3和ghd7-7,其中brghd-3与千粒重(P<0.05)、ghd7-7与株高(P<0.01)正相关,ghd7-7与开花期负相关(P<0.05)。上述结果表明,利用水稻功能基因序列信息克隆甘蓝型油菜的同源基因是可行的,为油菜功能基因研究提供了一种有效途径。

朝天椒Tm-2^(nv)-Like基因的同源克隆及其表达验证

番茄的Tm-2nv基因是一个NBS-LRR类型的病毒抗性基因。本研究以该基因的保守序列作为扩增引物,对辣椒栽培种朝天椒的基因组DNA进行电子分析、同源扩增和表达验证,首次获得了具有70%相似性的同源基因。生物信息学分析显示,朝天椒Tm-2nv-like基因的N端289～300 nt处和316～333 nt处分别含有12和18个碱基的插入,并且含有一个ATP/GTP结合位点的基序A(P-loop),以及3个依赖于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点。这一结果对于辣椒抗病基因功能的研究具有重要意义。

大麦幼穗MLOC-14401基因编码区的同源克隆和序列分析

【目的】编码区序列是基因作用机制、遗传多样性和进化关系等研究的重要资源。【方法】以盐城红茎大麦、青田红大麦、淳安六棱胭脂大麦和北青7号为材料,采用同源克隆技术分离、克隆MLOC-14401基因CDS序列,利用ORF Finder、BLAST和Clustal X等软件分析所克隆的CDS序列。【结果】MLOC-14401基因CDS序列全长1 248 bp、包含3个外显子、GC含量为62.82%,位于大麦3H染色体的609 892 778~609895 303 bp区间,起始密码(ATG)和终止密码序列(TAA)分别位于119 bp和1 366 bp位点。所编码多肽链包含415个氨基酸、2个MYB结构域,与普通小麦等9个物种的MYB基因编码多肽链具有不同程度的氨基酸序列相似性,保守序列位于105氨基酸与237氨基酸之间。【结论】MLOC-14401基因属大麦转录调控基因R2R3-MYB,所克隆的CDS序列对于大麦MYB基因作用机制等研究具有一定指导作用。

紫花苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因同源克隆与序列变异分析

β-1,3-葡聚糖酶是植物重要的防卫蛋白之一。采用同源克隆法,从16个紫花苜蓿品种的集群DNA中分离到3个苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因的部分基因组编码序列,分别对应于蒺藜苜蓿3个不同的β-1,3-葡聚糖酶基因,并命名为β-1,3-葡聚糖酶基因1、β-1,3-葡聚糖酶基因2和β-1,3-葡聚糖酶基因3。其中,β-1,3-葡聚糖酶基因2和苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因3及其蒺藜苜蓿对应基因与包括β-1,3-葡聚糖酶基因1在内的其他豆科同类基因遗传距离较大。序列变异分析显示,β-1,3-葡聚糖酶基因2的SNP位点间平均距离为255bp,DNA和氨基酸序列均非常保守,表明其在进化中受到了强烈的选择压力。β-1,3-葡聚糖酶基因1的SNP位点间平均距离虽然较小(31bp),但其全部21个SNP位点均为同义SNP,同时,测序片段仅发现了10个单倍型,远远小于其理论单倍型数目(221)。这表明β-1,3-葡聚糖酶基因1的氨基酸序列高度保守,在功能上非常重要,少量单倍型的存在是为了调节其表达,以使苜蓿适应多种内、外部环境条件。

芒果NBS类抗病基因同源序列克隆与分析

根据已知物种NBS抗病类基因(RGAs)保守序列设计引物,从芒果品种金煌基因组DNA中分离得到了10条同源序列(pp-1～10,GenBank登录号为HM446507～16)。DNA序列分析表明,这些RGAs在200～300 bp区间存在较大变异,Pi值都在0.4以上。同源性分析表明这些序列的同源性差异范围从11.0%～98.4%,离散值范围为1.6～100.7,10条RGAs可以分为2大类。蛋白序列分析表明,pp-01～10都具有开放读码框,编码的蛋白含有典型的NBS抗病类基因所拥有的P-loop和Kinase-2a结构域,通过同源进化分析可将其分为TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR 2类,与已知物种同源性范围为20%～60.2%。

黑皮冬瓜NBS类抗病基因同源序列克隆与分析

以黑皮冬瓜＂B98K＂种质为试材,根据已克隆的植物NBS类抗病基因保守结构域设计简并引物,PCR扩增冬瓜基因组DNA,获得对应区段的DNA片段,回收克隆与测序后,得到19条抗病同源序列（命名为DNB1至DNB19）。利用DNAStar软件进行序列分析及同源性比对发现,这些抗病同源序列长度在249-252 nt之间,其核苷酸序列同源性在48.4%-98.8%之间,氨基酸序列同源性为23.2%-100.0%,推导氨基酸序列具有P-loop（GGVGKTT）、Kinase-2a（VLDDVW）典型的NBS保守结构域。同源进化分析将其全部归为non TIR-NBS-LRR类,与推导氨基酸序列多重比较结果一致;该序列与其他作物已克隆抗病基因的氨基酸序列同源性在24.7%-99.0%之间。该组序列已登录Genbank,登录号为KF776401-KF776419。

香蕉NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆与分析

根据已知植物抗病基因的保守区域设计引物，从香蕉基因组DNA扩增出一条与植物抗病基因同源的序列，命名为BRGAl，该同源片段含有典型的NBS—LRR类抗病基因所拥有的保守性结构p-loop、Kinase-2a、Killase-3a和疏水结构域HD，它与部分已知NBS-LRR类抗病基因的氨基酸序列同源性为23．8％-42．7％。Northern杂交表明BRGA1在香蕉中受水杨酸调控，属诱导型表达。

日本晚樱同源异型基因PrseAP3的克隆及其在单瓣与重瓣花中的表达分析

用同源克隆的方法和3′RACE技术,从日本晚樱(Prunus lannesiana)中分离得到了1个AP3同源基因PrseAP3的cDNA全长,GenBank登录号为JF710371。其cDNA全长977bp,包括1个编码235个氨基酸共708bp的开放阅读框。序列比对和分子系统发生分析表明,PrseAP3是拟南芥的AP3同源基因,其蛋白质的C末端具有2个保守基元:PI-derived模体和paleoAP3模体,属B类转录因子中paleoAP3进化系。半定量RT-PCR分析表明,PrseAP3主要在单瓣日本晚樱品种大岛的萼片、花瓣和雄蕊中表达;在重瓣品种一叶的花瓣、雄蕊和叶化心皮中表达。其表达组织特异性在2个品种间表现出明显的差异,并与拟南芥的AP3基因有一定的差别。

绿豆NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆与分析

根据已知的拟南芥SPR2基因、烟草抗花叶病毒N基因、亚麻L6基因等NBS-LRR抗病类基因(RGAs)保守序列设计引物,从野生绿豆基因组DNA中分离得到了1条515bp大小的目的片段,并命名为FGV-1(GenBank登录号为KF021265)。经BLAST分析表明,分离的绿豆RGAs与已报道的大豆、豇豆、芸豆等植物的RGAs有较高的同源性。通过对其编码的氨基酸序列分析表明,FGV-1基因翻译的氨基酸序列中含有植物抗病基因NBS-LRR区域的4个保守结构:GMGGVGKTT、LILDDVD、GSRVIVTTRD及GLPLA,推测FGV-1可能是绿豆NBS-LRR类抗性基因的核心区域。绿豆RGAs的分离将为进一步从绿豆中分离功能性抗病基因打下基础,也为研究绿豆种质资源的起源与进化提供借鉴。

水稻不育系系谱抗稻瘟病基因同源序列的克隆与序列分析

根据已知NBS-LRR类抗病基因结构中氨基酸的保守区域设计简并引物,对水稻不育系系谱NBS-LRR类抗病基因同源序列进行克隆、测序和聚类。同源序列克隆与分析表明,7个水稻不育系系谱亲本中共获得14个阳性克隆,其中11个含有NBS-LRR类抗病基因所特有的保守氨基酸结构域KinaseⅠ、KinaseⅡ、KinaseⅢ及跨膜区域。这些片段间同源性最高达98.3%,最低仅为29.7%;11个氨基酸片段与抗病基因Xal(AB002266)的同源性较高,42%-45%的氨基酸序列相同,59%-64%的氨基酸序列相似,且与水稻其他NBS-LRR类抗性蛋白相似性很高。通过聚类分析,可以将其分为3类,分别记为G1、G2、G3,并发现抗源谷农13所含有的G3类基因,通过天谷、福伊传给后代谷丰、全丰。