云南3种野生稻中抗病基因同源序列的克隆及序列分析

根据已报道的NBS LRR类和STK类抗病基因结构中的氨基酸保守区域 ,设计简并引物 ,通过PCR扩增及克隆 ,从普通野生稻 (OryzarufipogonGriff.)、药用野生稻 (OryzaofficinalisWall.)、疣粒野生稻 (Oryzameye rianaBaill.)中共获得 14类NBS LRR类抗病基因同源序列 ,其中普通野生稻中的有 7类 ,药用野生稻中的有 2类 ,疣粒野生稻中的有 6类。药用野生稻中TO12代表序列与普通野生稻中TR19代表序列 ,同属一类 ,且具有 10 0 %的同源性 ,说明不同种野生稻中的同一类 (聚类 )抗病基因同源序列是完全一致的。同时 ,还获得 5类STK类抗病基因同源序列 ,其中普通野生稻中的有 4类 ;药用野生稻中的有 1类。通过氨基酸同源性比较分析 ,发现笔者克隆到的抗病基因同源序列与已克隆的抗病基因L6、N、Bs2、Prf、Pto、Lr10和Xa2 1等的氨基酸同源性都相当低 (均低于 2 5 % ) ,暗示了这些抗病基因同源序列可能是目前尚未报道的抗病基因的同源序列。

云南稻种抗病基因同源序列类似性分析

利用已知植物抗病基因和蛋白激酶序列中的保守区域设计的 3对引物对 137个水稻品种DNA进行PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果表明 ,水稻抗病基因同源序列类型丰富 ,以带型差异类似性 96 %为标准 ,这些品种可划分出籼粳差异较为明显的 3个类群 ;以带型差异类似性 6 0 %为标准 ,这些品种可划分为 2 0个类群。这些依分子标记划分的类群与品种的亲缘关系和抗瘟性基本一致。

通过Cyt b基因同源序列比较评估厦门文昌鱼的分类学地位

白氏文昌鱼Branchiostomabelcheri (Gray)在我国和日本沿海均有分布 ,由于南、北方文昌鱼形态学上有一定差异 ,且二者间存在一些过渡类型 ,其分类地位问题仍有待进一步澄清。本文测定了厦门欧厝海域产的文昌鱼mtDNACytb基因序列 ,并与日本产的文昌鱼以及另外产于大西洋的两种文昌鱼Cytb基因序列比较。分子系统学分析结果表明 :厦门欧厝海域产的文昌鱼与日本产的文昌鱼平均遗传距离为 2 1 12 % ,达到了种间分化的水平 ;经过对已有文献和文昌鱼地理分布的综合分析 ,作者建议将原来的白氏文昌鱼青岛亚种B belcheritsingtauense提升为种 ,南、北方所产文昌鱼分别作为两个独立的种存在 ,即南方的B belcheri (Gray)和北方的B

水稻抗病基因同源序列的克隆及测序分析

根据已知的 NBS- L RR类及丝 /苏氨酸蛋白激酶类抗病基因结构中氨基酸的保守区域 ,设计了两组简并引物用于扩增广谱抗稻瘟病品种云系 2号中的抗病基因同源序列。结果一共获得 11类的 NBS- L RR类抗病基因同源片段及 16类的丝 /苏氨酸蛋白激酶类抗病基因同源片段。所有 11类的抗病基因同源系列均含有 NBS- L RR类抗病基因的保守序列 ,如 P-loop、Kinase 2、Kinase 3a以及跨膜区域等。所有 16类的蛋白激酶的序列均含有丝 /苏氨酸蛋白激酶所共有的催化区 (共有氨基酸序列 :DL KPEN)、 (共有氨基酸序列 :GT/ SXXYXAPE)以及蛋白激酶的其他催化区。两条 NBS- L RR类的抗病基因同源片段 YR1、YR12分别与抗病基因 I2 C- 2及 Xa1氨基酸同源性很高 (>5 0 % )。7条丝 /苏氨酸蛋白激酶类的抗病基因同源片段与已克隆的 Xa2 1、Pto、L r10等抗病基因的氨基酸序列超过 6 0 %的相同以及 76 %～

甘蔗NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

根据已知植物(拟南芥、烟草和亚麻)抗病基因(RGAs)保守序列设计简并引物,从甘蔗高抗黑穗病品种NCo376的基因组DNA和cDNA中扩增出11条抗病基因同源序列,其中5条来自基因组DNA(EF059973、EF059974、EF059975、EF059976和EF059977),6条来自cDNA(EF155648、EF155649、EF155650、EF155651、EF155652和EF155653)。序列分析表明,这些RGAs均含有典型的NBS-LRR类抗病基因所拥有的保守结构域P-loop、Kinase-2a、Kinase-3a和疏水结构域。聚类分析表明,11条RGA同RPS2和XA1聚为一类,而N和L6则单独聚为一类。所有11条抗病基因同源序列中,kinase-2(LLVLDDVW/D)最后一个氨基酸皆为色氨酸。定量PCR分析表明,编号为EF059974的PIC基因的表达不仅受黑穗病菌胁迫的影响,而且受水杨酸的诱导和过氧化氢的抑制,也具有抗病基因组织特异性和组成型表达特性。

中国野生刺葡萄抗白腐病NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

【目的】通过同源克隆法从刺葡萄‘高山2号’叶片中得到抗白腐病基因的同源片段,为筛选葡萄抗白腐病基因奠定基础。【方法】根据已知植物抗病基因NBS-LRR保守区设计简并引物,从高抗葡萄白腐病刺葡萄‘高山2号’的基因组DNA与cDNA上得到抗病基因同源片段(RGAs),并对其表达分析进行检测。【结果】从刺葡萄‘高山2号’上获得了10个NBS-LRR类抗病基因同源片段,10条葡萄RGAs间在氨基酸水平上的同源性表现出丰富的多态性,进一步分析发现,在10条葡萄RGAs中,4个推测所属基因为non-TIR-NBS-LRR类抗病基因,6个所属基因为TIR-NBS-LRR类抗病基因。定量PCR分析表明,NB7基因受到白腐菌的诱导,而且NB7基因在刺葡萄叶片中为低丰度表达,NBS6基因受到白腐菌的诱导后为下调表达。【结论】在刺葡萄上成功获得了抗病基因同源序列,通过荧光定量PCR分析发现,NB7基因与NBS6基因都受到白腐菌的诱导表达,为最终克隆得到葡萄抗白腐病基因奠定基础。

植物抗病基因同源序列及其在抗病基因克隆与定位中的应用

近 10年来已有 2 0多个植物抗病基因被克隆、测序 ,这些抗病基因所编码的蛋白中大多含有核苷酸结合位点、富含亮氨酸重复序列、蛋白激酶、亮氨酸拉链结构、跨膜结构域、Toll白介素 - 1区域等保守结构域。利用这些保守结构域合成PCR引物 ,已扩增出大量的植物抗病基因同源序列 (RGA)。对RGA与抗病基因的关系进行了分析 ,讨论了RGA在研究抗病基因进化中的作用 ,指出RGA在抗病基因定位和转基因中具有重要意义。

辣椒抗病基因同源序列的克隆与分析

【目的】利用同源序列法分离辣椒抗病基因同源序列。【方法】根据已知植物抗病基因的NBS-LRR保守结构域设计简并引物,以辣椒品系PR205基因组DNA为模板对抗病基因同源序列进行扩增。【结果】获得了25个抗病基因同源序列(resistance gene analogs,RGAs),聚类分析将其分为7个不同的类别。由其核酸序列推导的氨基酸序列与Mi-1.2、prf、Hero、I2C-1、RPM1基因相应区域的同源性为27.4%～98.2%。其中RGA-p20与Mi-1.2基因的核苷酸和氨基酸序列相似性均达到99%,确认RGA-p20为抗根结线虫基因的一部分,即辣椒中也含有与Mi基因同源的根结线虫抗性基因。【结论】本研究在辣椒品系PR205中获得了抗病基因同源序列,为辣椒抗病基因的克隆奠定了基础。

结球甘蓝NBS-LRR类R基因同源序列的分离

根据大多数抗病基因编码蛋白质的核苷酸结合区(NBS)和富含亮氨酸重复序列(LRR)保守区域的特点,设计PCR特异简并引物,从抗TuMV的结球甘蓝材料84075中,扩增出513 bp的DNA片段,经克隆、测序后,得到4个含有NBS-LRR保守区域的R基因同源序列,分别命名为:Bor1、Bor2、Bor3和Bor4,同源性比较分析表明,它们与已克隆的抗病基因或抗病基因片段有不同程度的同源性。以Bor1为探针,对84075进行Southern blot和RFLP分析的结果表明,Bor1以多拷贝形式存在。

几个抗疫病性不同的辣椒材料抗病基因同源序列的分离与比较

根据已克隆抗病基因的保守序列设计简并引物 ,对 9个不同抗、感疫病的辣椒种质材料基因组DNA进行抗病基因同源性序列的特异PCR扩增 ,经序列测定和同源性分析发现 14个抗病基因同源性序列 (RGAs)与辣椒抗疫病作用相关 ,其中B引物扩增的 8个RGAs与烟草抗花叶病基因N、拟南芥抗丁香假单菌基因RPS2和亚麻抗锈病基因L6的同源性较高 ,属于广谱 (细菌、病毒、真菌 )抗病基因同源序列 ;C引物扩增的 6个RGAs与番茄抗叶霉病基因Cf2和Cf9有较高的同源性 ,与抗疫病作用密切相关。研究还发现 ,高感疫病的辣椒基因组中也存在抗疫病相关RGAs,这与已报道的辣椒抗疫病微效QTLs位点则来于感病亲本基因组的研究结论一致。

不结球白菜抗病基因同源序列的克隆及分析

目的利用同源序列法分离不结球白菜抗病基因同源序列。方法根据植物抗病基因TIR-NBS-LRR保守区设计简并引物,对不结球白菜基因组DNA及cDNA进行PCR扩增。结果获得了10个具有通读氨基酸序列的片段。同源性比较发现,该10个片段均属于TIR-NBS-LRR类抗病基因同源序列(RGA),与已知R基因相应区段的氨基酸序列一致性为50%～66%。与已知抗病基因聚类分析结果显示,该10个RGA序列可以分为5大类。利用RGA950作为探针进行Southern杂交,结果表明,其在基因组中存在多拷贝。结论本研究成功获得了不结球白菜RGA序列,为进一步克隆不结球白菜的R基因奠定了基础。

柚cDNA中NBS-LRR类R基因同源序列的分离

提取柚花柱的总RNA,通过逆转录合成其cDNA,根据已知植物抗病基因(R基因)的NBS保守区设计简并引物,对cDNA进行扩增,获得大小约为500bp的PCR产物,对连接产物进行酶切归类,筛选得到不同类别的克隆12个,并进行了测序。通过序列同源比较分析发现,其中有10个片段属于NBS-LRR类抗病基因的同源序列(RGA),与已知植物R基因相应区段的氨基酸序列的同源性为11.5%～47.1%。

利用中间偃麦草抗病基因同源序列分离黄矮病抗性候选基因克隆

根据已克隆植物抗病 (R)基因编码蛋白质的保守结构设计简并引物 ,利用同源序列法PCR扩增、克隆到 9个具有开放阅读框的中间偃麦草R基因同源片段 (ResistanceGeneAnalogs ,RGAs)。利用抗黄矮病材料 (含Bdv2 )、感黄矮病材料 (无Bdv2 )进行RFLP分析 ,筛选到 1个NBS类RGA序列TirgaZ1与Bdv2连锁。根据TirgaZ1的序列重新设计 1对引物 ,优化PCR扩增条件 ,将其转化为经典特异PCR标记 (SC TZ1)。利用该特异PCR标记 (SC TZ1)和克隆池 PCR法筛选抗黄矮病小麦 中间偃草易位系HW6 4 2基因组的可转化人工染色体 (Transformation competentArtificialChromosome ,TAC)文库 ,分离到 4个阳性TAC克隆T1～T4。限制酶切图谱分析结果表明 ,T1～T3为 1类 ,插入片段约 2 3kb ,T4为另 1类 ,插入片段约为 2 5kb。以TirgaZ1为探针 ,通过Southern杂交证实了阳性TAC克隆T1、T4为含有TirgaZ1序列的抗病基因候选克隆。分别以中间偃麦草、HW6 4 2和小麦亲本为探针对阳性克隆T1、T4进行Southern分析 ,结果表明 ,阳性TAC克隆T1、T4的插入片段均具有抗黄矮病易位系的中间偃麦草易位染色体片段 7XL ,T1、T4为抗黄矮病基因候选克隆。测定和分析阳性克隆T1插入片段 5 '端 - 6 4 4 8bp部分的序列 ,表明其最长完整开放阅读框

基于NBS-LRR类R基因保守结构域克隆瓠瓜抗病基因同源序列

【目的】分离鉴定瓠瓜Lagenaria siceraria抗病种质的抗病基因同源序列（Resistance gene analogs,RGAs）,为瓠瓜功能性抗病基因的克隆及分子标记辅助育种奠定基础.【方法】根据已知核苷酸结合位点和富亮氨酸重复（Nucleotide binding site and leucine rich repeat,NBS-LRR）类抗病基因保守区设计简并引物,从“大籽瓠”抗性材料基因组DNA中分离抗病基因同源序列,并利用生物信息学软件进行长度变异、保守结构域、同源比对与系统进化分析.【结果和结论】基于同源克隆策略,获得23条瓠瓜NBS抗病同源序列,命名为HNB1～HNB23,GenBank登录号为KJ908192～KJ908214.序列分析及同源比对结果表明,这些RGAs长度变异在242～261nt之间,18条序列具有连续开放阅读框（Open reading frame,ORF）,推导氨基酸序列具有P-loop、Kinase-2a典型NBS类R基因保守结构域;核苷酸序列相似性为41.5% ～98.8%,氨基酸序列相似性为21.5% ～100.0%;利用NCBIBlast同源搜索发现,与其他植物尤其是冬瓜、黄瓜、葫芦及丝瓜的已知R基因具有40% ～100%相似性;氨基酸序列聚类分析将其分为5个组;同源进化分析表明,23条瓠瓜RGAs均为non-TIR-NBS-LRR类R基因,与推导氨基酸序列多重比较结果一致.

小麦中雄性不育同源序列的分离、鉴定及表达分析

利用拟南芥中已克隆的雄性核不育基因MS2和水稻中假定雄性不育蛋白的保守区域,设计一对简并引物,并在太谷核不育小麦可育株及不育株花药中进行扩增,得到了一条134bp的片段。以该片段为基础,通过电子延伸得到一个长为1 604bp的序列,该序列编码的氨基酸包含一段由200个氨基酸组成的雄性不育保守区。RT PCR结果表明,该雄性不育同源序列只在小麦可育花药中表达,而在小麦败育花药、叶片和根中不表达,说明该雄性不育同源序列为花药发育特异基因。

西瓜抗枯萎病基因同源序列的克隆与分析

本研究根据已克隆的抗枯萎病基因的NBS保守结构域设计了22条上游简并引物和17条下游简并引物,以西瓜抗枯萎病种质PI296341-FR和感枯萎病品种97103为材料,获得了7条来自基因组DNA的RGA序列(GenBank登录号:DQ156558-DQ156564),均含有NBS保守区的P-环、kinase-2或kinase-3等抗病基因的特征序列结构,所编码的氨基酸序列与已知抗枯萎病基因Fom-2、I2C-1、I2C-2和I2等编码的氨基酸序列表现出11%￣72%的同源性,其中来自PI296341-FR的RGA序列175R1与甜瓜抗枯萎病基因Fom-2的同源性最高,为72%。来自PI296341-FR与97103的RGA序列之间同源性较高(73%￣97%),证明了抗病基因在进化上的保守性。

小麦NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

目的拟利用同源序列法分离小麦抗病基因同源片段。方法根据已克隆植物抗病(R)基因NBS-LRR保守区段设计两对引物,采用RT-PCR方法对小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr35的RNA进行扩增。结果获得了3个通读的小麦抗病基因NBS-LRR类抗病基因同源片段PS13-1、PS13-2和S2A2,长度分别为239bp、289bp和539bp,编码78、84和177个氨基酸。核苷酸比较分析表明,PS13-1和PS13-2与已克隆小麦抗白粉病基因PM3b同源性为91%;S2A2与大麦一个来源于mRNA的同源片段同源性为91%;经BLASTp比较,3个片段均含有NB-ARC保守结构域,与已知抗病基因I2C-1,L6,RPS2等相应区域相一致,具有抗病基因NBS特征结构域(P环、激酶2a等)。Northern杂交分析表明,3个同源片段在小麦叶片中为低丰度组成型表达。结论本研究在TcLr35小麦中成功获得了抗病基因同源序列,为最终克隆小麦抗叶锈病基因奠定了基础。

番茄NBS-LRR抗根结线虫基因同源序列的克隆与分析

根据已知抗病基因的NBS-LRR保守结构域设计简并引物,从抗南方根结线虫病的番茄材料cDNA中克隆抗病基因同源序列(resistance gene analogs,RGAs),并通过qRT-PCR技术检测RGAs与南方根结线虫侵染的相关性。序列分析发现,2条序列具有NBS-LRR保守结构域,分别命名为F5-8和F5-20;保守区域氨基酸比对结果显示,F5-8(GenBank登录号为MG860907)和F5-20(GenBank登录号为MG860908)与已知抗病基因保守区域具有很高的相似性,其中F5-8与Mi-1相应区域氨基酸相似性为94%,F5-20与Hero基因相应区域氨基酸相似性为96%。qRT-PCR结果发现,F5-8和F5-20在接种南方根结线虫2龄幼虫24h后其表达量均发生了变化。初步推测F5-8和F5-20为南方根线线虫侵染相关基因同源序列。

小麦NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

根据已知植物抗病基因的保守区域设计引物,从抗锈病小麦品种西农88基因组DNA扩增出3条与植物抗病基因同源的序列,分别为WRGA1、WRGA2和WRGA14。这三条同源片段均含有典型的NBS-LRR类抗病基因所拥有的保守性结构域Kinase-2a、Kinase-3a和疏水结构域(HD)．它们与部分已知NBS-LRR类抗病基因的氨基酸序列同源性为46．0%-9．9%,三个片段间在氨基酸水平上的同源性为80．7%-56．8%。Northern杂交表明WRGA1在小麦中受水杨酸正调控,属诱导型表达。

斑茅NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆与分析

根据已知NBS-LRR抗病基因[含有核苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复(LRR)的胞内受体蛋白基因]NBS结构域蛋白质的保守序列,设计简并引物,对斑茅基因组进行体外扩增,获得了对应区段的DNA片段,回收、克隆这些特异片段,测序分析,共获得8个片段序列。序列分析发现其中7个编号分别为RGA-Q1、RGA-Q2、RGA-Q3、RGA-Q4、RGA-Q5、RGA-Q6和RGA-Q7的片段推导的氨基酸序列均具有典型的NBS结构域,即P-loop(GGVGKTT)、Kinase-2a(VLDDVW)、Kinase-3a(GSR/KILVTTR)及疏水结构域HD(hydrophobic domain)。它们在NCBI上的登录号为EU685828、EU685829、EU685830、EU685831、EU685832、EU685833和EU685834。这些抗病基因同源片段(RGA)与已经克隆的N、L6、RPS2和Mi等11个抗病基因在氨基酸水平上的同源性为2.3%～39.8%,可进一步用作斑茅抗病候选基因的分子筛选及遗传图谱的构建。