葡萄VvAGL12基因启动子克隆及表达活性分析

MADS-box家族是植物最大的转录因子家族之一,在参与逆境胁迫与调控开花应答中具有重要作用,其AGL12-like亚组在葡萄中的功能尚不清楚。从黑比诺葡萄基因组克隆获得VvAGL12启动子(proVvAGL12),对启动子序列元件进行分析,发现该启动子区域存在多种与逆境胁迫相关的顺式作用元件。构建proVvAGL12驱动的GUS表达载体,并在拟南芥和烟草中进行转化,发现proVvAGL12启动子片段在拟南芥中具有启动活性,其驱动GUS在转基因拟南芥植株的叶片、茎段、花器官、根、果荚部位表达,表达活性可持续整个生长周期。转基因拟南芥和烟草胁迫处理实验表明,proVvAGL12驱动的GUS活性受赤霉素、脱落酸、聚乙二醇和低温调控。

启动子克隆方法研究进展

启动子是基因表达调控的重要顺式元件,也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。启动子的克隆对于构建基因工程载体,表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多,从常用的利用启动子探针型载体筛选启动子到PCR方法的应用,此后相继问世的一些基于PCR法的克隆启动子技术,像I-PCR、P-PCR、SSP-PCR、YADE、TAIL-PCR等,为克隆启动子提供了更可靠,更合理的方法。对这几种方法进行了简要综述,比较了不同方法的优缺点,并展望了今后的研究前景。

粤油7号花生AhNCED1基因启动子克隆及其活性分析

AhNCED1是干旱胁迫下花生中调控脱落酸(abscisic acid,ABA)生物合成的关键基因。本文采用基于PCR的基因组DNA步移法,从抗旱性强的粤油7号花生中克隆AhNCED1基因起始密码子ATG上游2392bp启动子序列,构建该启动子驱动报告基因GUS的植物双元表达载体pAhNCED1p∷GUS,转化野生型拟南芥获得AhNCED1p∷GUS转基因植株。通过GUS染色及其酶活性测定分析AhNCED1p∷GUS转基因拟南芥中AhNCED1p启动子的活性。结果表明,AhNCED1p∷GUS转基因拟南芥叶片中AhNCED1p启动子活性最强,脱水胁迫显著增强7 d龄转基因拟南芥幼苗叶片中AhNCED1p启动子活性。300mmol·L-1山梨醇胁迫或100μmol L-1外源ABA处理3 h明显增强25d龄AhNCED1p∷GUS转基因拟南芥中AhNCED1p启动子活性。结果说明,粤油7号花生AhNCED1基因启动子受渗透胁迫和ABA诱导,与生物信息学预测AhNCED1基因启动子序列中存在逆境胁迫和ABA响应元件的结果相一致。

枇杷叶片发育基因EjGRF5与启动子克隆及其在不同倍性枇杷中的表达

【目的】克隆并解析枇杷(Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.)中参与调控叶片生长发育的EjGRF5及其启动子序列的结构特征,研究其在不同倍性枇杷中的表达特性,为进一步研究该基因调控不同倍性枇杷叶片生长势差异的机理奠定基础。【方法】从转录组测序数据中挖掘枇杷EjGRF5的参考序列,以此序列设计引物,并以‘龙泉1号’四倍体枇杷基因组DNA为模板扩增EjGRF5全长,参照EjGRF5参考序列获得其CDS序列。利用Bioedit7.2及Signal P4.1对EjGRF5的CDS序列及其蛋白的理化性质进行分析;采用Mega7.0软件构建EjGRF5和其他物种GRF5的系统进化树;采用Loc Tree3及Soft Berry Prot Comp9.0在线软件对EjGRF5蛋白进行亚细胞定位预测;采用染色体步移的方法克隆EjGRF5的启动子序列,并利用Plant CARE在线软件对克隆得到的EjGRF5启动子序列进行生物信息学分析;采用RT-PCR技术对EjGRF5在三倍体枇杷及其亲本(4x、2x)中的表达差异进行初步分析。【结果】将测序结果与转录组测序的参考序列进行比对发现,EjGRF5全长为1 386 bp,含有3个外显子,2个内含子,内含子全长399 bp,CDS全长987 bp。进化树分析表明,枇杷EjGRF5与蔷薇科的其他植物高度同源,且与白梨的亲缘关系最近。亚细胞定位预测结果显示,枇杷EjGRF5蛋白定位于细胞核中。启动子分析显示,EjGRF5启动子区域含有多个顺势作用元件,包括脱落酸、乙烯、高温、厌氧诱导、赤霉素和光响应元件,并且光响应元件多达11个。qRT-PCR结果显示,除F1代A-6和B-3外,其余三倍体子代EjGRF5表达量相对于中间亲本值(MPV)都发生了不同程度的上调,其中A-3的表达量是其MPV的20倍,A-5表达量是其MPV的18倍左右。【结论】获得了与枇杷叶片生长发育相关的EjGRF5、CDS序列及其启动子序列,EjGRF5在三倍体枇杷叶片中的表达呈现出上调趋势。

白桦BpGT14基因启动子克隆及表达活性分析

本文利用Site Finding-PCR方法克隆了白桦BpGT14基因起始密码子ATG上游2 169 bp序列,并通过PLACE启动子预测工具对其进行元件分析。结果表明,该启动子片段含有启动子核心元件及多种逆境及激素响应元件,同时具有植物苯丙烷及木质素生物合成的MYB类转录因子的重要结合基序。研究选取了其中含有启动子核心元件的1 156 bp片段构建了pBpGT14∷GUS植物表达载体,利用农杆菌侵染的方法将pBpGT14∷GUS报告基因瞬时转化烟草植株,鉴定该启动子在烟草中的表达活性及对非生物胁迫和激素的响应模式。对转基因烟草植株进行GUS染色,结果表明该启动子具有启动活性,且在茎段处活性较高;进一步分析非生物胁迫对烟草中GUS酶活性的影响,表明该启动子对ABA、NaCl、PEG及高温处理均有明显响应,且对于NaCl及PEG处理响应迅速。为了更好的鉴定白桦BpGT14基因启动子在白桦细胞中的启动活性及响应模式,本文构建了pBpGT14∷GFP载体并瞬时转化白桦茎段悬浮细胞,进行研究。GFP转录水平分析结果与GUS酶活性结果基本一致,但其中部分时间点仍存在差异。选取PEG处理3、6、12及24 h的转GFP基因白桦茎段悬浮细胞,在显微镜下观察其绿色荧光蛋白,以此揭示该启动子对干旱的响应模式。结果表明,该启动子在白桦茎段悬浮细胞中启动了GFP的表达,在处理初期(3 h),荧光效果明显;随着处理时间的增加,细胞脱水明显,且在细胞壁表现高亮度荧光。

灰树花漆酶基因及启动子克隆和序列分析

本文以优化后的漆酶培养基为基础,运用RT-PCR和RACE技术相结合,从该菌株中获得编码漆酶基因的cDNA及Genomic DNA的全长序列,Genomic DNA大小为2105 bp。比较该漆酶基因的cDNA和Genomic DNA的全长序列,发现该基因包含11个外显子和10个内含子。cDNA序列全长为1873 bp,其中,包含一个完整的ORF,长度为1563 bp,编码520个氨基酸。序列在氨基酸水平上与偏肿革裥菌Lenzites gibbosa的相似性评价最高,相似性达70%。采用FA-PCR的方法,扩增得到漆酶基因起始密码子上游长800 bp的启动子序列。该启动子区域上除分布有TATA-box、CAAT-box以及AP2等基本的转录起始元件外,还存在有多个潜在的顺式作用元件序列位点,包括3个MRE元件、2个STRE元件、1个HSEs元件、5个氮因子结合位点等。这些结果表明,不同的外源诱导物可以调节灰树花漆酶基因的表达。

马铃薯sgt3基因启动子克隆及其功能鉴定

【目的】克隆马铃薯茄啶鼠李糖基转移酶基因(sgt3)的启动子序列并对其进行功能鉴定.【方法】采用染色体步移技术(genome walking)进行启动子的克隆,构建了该启动子驱动报告基因gfp::gus的植物双元表达载体p1304sgt3p,以pCAMBIA1304为阳性对照表达载体,采用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达及稳定遗传转化,结合GUS组织化学染色对其进行功能鉴定.【结果】电泳图表明为1条长约2 500bp的特异扩增条带,瞬时表达和稳定遗传表达的烟草叶片的GUS组织化学染色结果均显示gus基因在转化烟草叶片中高效表达,并且低于阳性对照,非转化烟草叶片中无表达.【结论】成功克隆到sgt3基因起始密码子上游2392bp的启动子序列并且该启动子具有活性.

红平菇HP1漆酶基因及启动子克隆和序列分析

以优化后的漆酶培养基为基础,将RT-PCR、RACE技术相结合,从红平菇菌株中获得漆酶基因cDNA全长及Genomic DNA全长序列,Genomic DNA大小为2 344 bp。通过对漆酶基因cDNA全长和Genomic DNA全长序列的比较,结果显示该基因包含13个外显子和12个内含子。基因cDNA全长为1 746 bp,其中包含1个完整的ORF,长度为1 590 bp,编码529个氨基酸。序列在氨基酸水平上与桃红侧耳Pleurotus salmoneostramineus的氨基酸序列具有较高的同源性,相似性达97%,与齿耳菌Steccherinum murashkinskyi漆酶氨基酸序列相似性达到72%。通过SEFA-PCR的方法,扩增得到漆酶基因起始密码子上游长1 126 bp的启动子序列。分析表明,该启动子区域上除分布有TATA-box、CAAT-box、AP2等基本的转录起始元件外,还存在多个潜在的顺式作用元件序列位点,包括4个MRE元件、2个CreA热击元件、2个STRE元件、1个NIT2元件、1个HSEs元件、1个XRE异生物质反应元件、4个氮因子结合位点等。不同外源诱导物可以调节红平菇HP1漆酶基因的表达。

水稻5.3 kb Gt1启动子克隆以及Gt1启动子引导优质大豆球蛋白Gy7基因表达载体构建

以越光水稻基因组为模板,在成功克隆5.3 kb谷蛋白Gt1基因5’上游和信号肽序列基础上,将其定向插入到pCAMBIA1300质粒中,构建了中间载体p1300-5.3 kb Gt1;再将富含赖氨酸的优质大豆球蛋白Gy7全基因序列及cDNA编码序列分别定向插入p1300-5.3 kb Gt1质粒上Gt1基因信号肽下游,再在2个载体Gy7全基因序列及cDNA编码序列下游都正向插入Gt1 3’UTR,完成由5.3 kb谷蛋白Gt1基因启动子及信号肽引导的大豆球蛋白Gy7基因2种表达载体的构建。此试验为利用转基因技术改良水稻稻米营养品质以及将水稻种子作为生物反应器等方面研究奠定了基础。

蜡梅水通道蛋白基因CpAQP1转录水平变化及其启动子克隆

利用荧光定量PCR技术对蜡梅花发育的不同组织、不同花期和不同胁迫下的水通道蛋白基因CpAQP1的表达量进行分析.结果表明:CpAQP1在盛开期中瓣的表达量明显高于其他组织器官,在高温、高盐、ABA胁迫下表达量变化明显,说明该基因具有组织表达差异性及能够对环境胁迫做出响应.同时利用hi-TAIL PCR方法克隆获得蜡梅水通道蛋白基因CpAQP1上游启动子1082bp,命名为CpAQP1pro(GenBank登录号为:JQ952563).该序列具有典型的基本元件TATA-box、CAAT-box及与胁迫相关的元件和光应答元件.将克隆的启动子CpAQP1pro替换pBI121中的CaMV35s启动子,构建植物表达载体pBI121-CpAQP1pro,通过农杆菌转化烟草,稳定表达结果说明该启动子具有驱动GUS报告基因表达的活性.

一种启动子克隆的改良Adaptor-PCR方法及在橡胶树上的应用实例

真核生物通过顺式作用元件和反式作用因子相互作用实现基因的转录调控,而启动子区域含有多种顺式元件,作为基因表达调控网络的枢纽控制着基因转录的起始与效率,一直是基因表达调控研究的重点[1]。本文提供了一种改良的基于Adaptor-PCR启动子克隆方法,改进了接头序列,设计了适合两步法PCR的接头引物。选取了25种限制性内切酶对橡胶树基因组DNA进行酶切,在所有酶切产物都平端化后,与改进的接头连接,成功构建了以Adaptor-PCR为基础的橡胶树基因启动子克隆文库,并利用此文库成功克隆了橡胶树6个蔗糖转运蛋白基因、1个转化酶基因和1个海藻糖合酶基因的启动子。本文研究结果为橡胶树基因启动子克隆提供了一个高效平台,也为其他生物基因启动子克隆提供了有益的参考。

月季品种‘绿萼’RcAG基因启动子克隆及分析

月季品种‘绿萼’(Rosa chinensis‘Viridiflora’)是中国古老月季最宝贵资源之一,其花瓣、雄蕊及雌蕊均萼片化。本研究以花器官正常发育的月季品种‘月月粉’(R.chinensis‘Old Blush’)为对照,利用实时荧光定量PCR技术对RcAG基因在‘绿萼’花器官中的表达情况进行分析,阐明RcAG基因在‘绿萼’花器官发育中的作用。结果显示,RcAG基因在‘绿萼’中的表达明显下调。进一步克隆‘绿萼’和‘月月粉’的RcAG基因启动子,序列分析结果表明两个启动子均含有TATA、TATC-box和MBS等顺式作用元件,但在‘绿萼’RcAG基因启动子中发现了光响应元件MRE和昼夜节律调控元件Circadian,而光响应元件TCT-motif只在‘月月粉’RcAG基因启动子中被发现。同时,本研究采用重亚硫酸盐测序技术分析了‘绿萼’和‘月月粉’RcAG基因启动子甲基化的情况,发现‘绿萼’RcAG基因启动子区域中有4个CpG位点均发生甲基化,其甲基化程度远高于‘月月粉’。研究结果表明RcAG基因在‘绿萼’花器官中的下调表达可能与其启动子的顺式作用元件及甲基化修饰相关。

人PD-L1基因启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的:对人源PD-L1基因启动子进行PCR扩增,构建PD-L1荧光素酶报告基因。方法:用PCR扩增方法获得PD-L1基因启动子;PD-L1启动子和载体行KpnⅠ、XhoⅠ酶切、连接和转化,然后行菌落PCR以及测序等。构建成功后转染至A549细胞中并检测PD-L1启动子活性。结果:经PCR方法扩增出PD-L1基因启动子片段,;菌落PCR鉴定各重组体构建正确并经生工测序成功;瞬时转染A549细胞后经报告基因检测得知所克隆的不同片段序列具有启动子活性。结论:成功克隆PD-L1基因启动子,构建出不同片段基因启动子荧光素酶报告基因,为进一步研究其分子机制提供详实基础。

美洲水貂EDNRB基因启动子克隆与生物信息学分析

为了克隆出水貂EDNRB基因的启动子区域,预测该片段的核心启动子区域、CPG岛、顺式作用元件及转录因子结合位点,为水貂EDNRB基因的表达调控研究提供理论依据,试验采用PCR扩增、克隆及生物信息学方法进行了研究。结果表明:克隆出的长为1 830 bp的水貂EDNRB基因候选启动子序列,经检验与人的EDNRB基因序列有高度的同源性;在此段序列中利用在线软件成功预测出多个核心启动子区域,2个CPG岛区域,3个GAAT框,1个GC框,6个TATA框,并提示存在MEF2、NF-1、Sp-1等转录因子结合位点。说明水貂EDNRB基因的-1 763/+67 bp候选启动子区域可能受到甲基化影响,同时也受顺式作用元件与转录因子的调控作用。

沙柳SpsLAZY1a、SpsLAZY1b基因启动子克隆及表达分析

为研究SpsLAZY1a、SpsLAZY1b基因的表达调控机制,本研究从沙柳中分离了SpsLAZY1a、SpsLAZY1b基因的启动子片段。使用PlantCARE数据库对该启动子片段中顺式作用元件预测显示,SpsLAZY1a和SpsLAZY1b启动子序列中除了包含核心元件CAAT-box和TATA-box外,还含有光、茉莉酸甲酯、脱落酸、低温、乙烯、赤霉素等响应元件。Pro_(SpsLAZY1a)和Pro_(SpsLAZY1b)在烟草中瞬时表达和转基因84K杨中的GUS显色结果表明,Pro_(SpsLAZY1a)和Pro_(SpsLAZY1b)具有启动子活性。对转基因84K杨的GUS酶活检测结果表明,Pro_(SpsLAZY1a)的GUS表达活性强于Pro_(SpsLAZY1b)。对转基因84K杨茎的切片结果显示,蓝色显色反应主要集中于内皮层和韧皮部。上述结果表明,SpsLAZY1a、SpsLAZY1b基因的启动子是非组织特异性表达启动子,并且这两个基因启动子的活性存在差异。本研究结果为解析LAZY基因的上游调控机制提供参考。

启动子克隆技术及牛功能基因启动子研究进展

基因启动子(promoter)是DNA上决定RNA聚合酶转录起始位点的序列,是基因的一个重要组成部分,控制基因表达的起始和表达的程度,而基因表达的最终产物是RNA和蛋白质,这两大类物质对维持生命活动不可缺少。因此,对基因的启动子进行克隆并研究其功能对研究基因表达调控机制具有重要意义。本文主要就两种常用的启动子克隆技术和启动子调控功能的研究进展做了简要综述,并对启动子的研究前景做了展望。

荔枝多酚氧化酶基因启动子克隆与功能分析

目的：获得多酚氧化酶（PPO）基因启动子序列并初步分析其功能，为进一步研究PPO基因表达规律及应用PPO基因启动子提供基础。方法：通过TAIL-PCR和接头PCR方法相结合获得荔枝PPO基因启动子序列并进行生物信息学分析，序列缺失结合瞬时表达法分析核心启动子调控元件。结果：从‘妃子笑’荔枝基因组中克隆获得了1048bp的荔枝PPO基因启动子序列，含有多种顺式作用元件。

木薯MeCYP79D1和MeCYP79D2基因启动子克隆及表达模式分析

MeCYP79D1和MeCYP79D2基因是调控木薯生氰糖苷合成的关键基因,研究其表达特性对低氰木薯改良具有重要意义。为了探究MeCYP79D1和MeCYP79D2基因在SC8木薯品种中的表达模式,本研究克隆获得了SC8木薯品种的MeCYP79D1和MeCYP79D2基因启动子,发现它们的启动子上具有ABA、SA、GA、Me JA及生长素等激素响应元件,同时具有低温、干旱、伤害胁迫相关元件。采用ABA、SA、GA3、MeJA、低温处理,证明MeCYP79D1和MeCYP79D2基因表达受激素和低温调控。MeCYP79D1和MeCYP79D2基因主要在须根中表达,其次为嫩叶;在块根发育过程中,MeCYP79D1和MeCYP79D2基因主要在块根形成期和膨大前期表达。此研究结果为解析MeCYP79D1和MeCYP79D2基因表达调控机理提供了新的线索。

钩藤UrLAMT基因及其启动子的克隆与分析

【目的】克隆钩藤(Uncaria rhynchophylla)中马钱苷酸甲基转移酶(loganic acid methyltransferase,LAMT)基因及其启动子,对UrLAMT基因的组织表达及其对生物和非生物胁迫的响应进行分析,并对UrLAMT及其启动子的生物信息学进行分析,为进一步研究UrLAMT转录调控奠定基础。【方法】基于钩藤的转录组数据设计引物,采用PCR从钩藤cDNA中克隆UrLAMT序列,并对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR,分析UrLAMT在钩藤不同组织(根、茎、叶、花、果实、钩)中的表达,以及对外源茉莉酸甲酯(MeJA)、遮光/复光胁迫的响应;利用FPNI-PCR技术克隆UrLAMT上游启动子序列,并验证其活性,结合酵母单杂交试验,分析相应转录因子与UrLAMT启动子的调控关系。【结果】克隆得到钩藤UrLAMT序列,其长度为1137 bp,共编码378个氨基酸。UrLAMT蛋白质相对分子质量为42.64 ku,理论等电点为5.76,为亲水性蛋白,无信号肽,不含跨膜结构,定位在细胞质中;UrLAMT基因在钩藤叶中表达量最高,其次为根;UrLAMT均能响应MeJA和光;其与短小蛇根草和长春花的进化关系较近。UrLAMT启动子序列长度为1141 bp,除核心响应元件外还含有多个光响应元件,UrLAMT启动子在酵母中与光调控转录因子HY5存在相互作用。【结论】获得了UrLAMT基因及其启动子序列,其在钩藤叶中表达量最高,可能受光诱导。

豆荚特异性启动子Pmsg的克隆及抗大豆食心虫植物表达载体的构建

植物基因工程载体构建时,一般采用组成型启动子,因涉及转基因食品安全性问题,在社会上引起争议。采用组织特异性启动子代替组成型启动子,既可调控下游基因的表达又能解决转基因食品安全性问题。采用同源克隆方法从栽培大豆绥农14中克隆了2 278 bp的豆荚特异性启动子Pmsg,与GenBank上的大豆msg基因启动子序列相似性为99%。构建了由启动子Pmsg调控经人工改造、具有抗大豆食心虫功能的基因(Cry1Iem)的表达载体pBMBt,以及由种子特异性启动子PGy2调控Cry1Iem基因的表达载体pBGBt,为抗大豆食心虫基因工程研究奠定了重要基础。