两株能利用甲烷的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的分离和鉴定

分别从杭州华家池黄松田稻田土和浙江金华老黄筋泥稻田土中分离得到能利用甲烷的Z5 6 菌株和J2 6 菌株,通过形态特征、生理生化实验鉴定,初步认为 2菌株属于链霉菌属(Streptomyces)吸水类群(Hygroscopicus)的能氧化甲烷的菌株,暂命名为吸水链霉菌甲烷氧化菌株S.hygroscopicusstrainmethane oxidizingZ5 6 和S.hygroscopicusstrainmethane oxidizingJ2 6 。

吸水链霉菌NND-52菌株胞内抗生素M1分离、纯化及结构确定

吸水链霉菌 NND- 5 2菌丝体 ,经溶媒浸提 ,粗结晶 ,梯度洗脱的硅胶柱层析分离 ,纯化 ,得到主要组分 M1,通过对其基本理化性质分析和 UV、IR、1 H- NMR、1 3C- NMR、DEPT等波谱分析 ,确定其结构与阿扎霉素 B相同 。

阿扎霉素B产生菌吸水链霉菌NND-52的诱变筛选

用紫外线 ,紫外线加氯化锂 (Li Cl)、吖啶橙 3种诱变方式对阿扎霉素 (Azalomycin) B产生菌 Strepto-myces hygroscopicus NND- 52菌株进行诱变处理 ,确定了它们的最佳诱变剂量 ,获得了数株 Azalomycin B产量较出发菌株提高 3倍以上的高产菌株 ,编号 Al3的菌株摇瓶产量达 110 0 mg/ L,且传代稳定。经过对 3种诱变方式的比校 ,发现后两种诱变方式对产量的提高更为有效。

紫黑吸水链霉菌Streptomyces violaceoniger-hygroscopicus发酵代谢产物对几种常见果蔬病原菌的拮抗活性

从南昌地区不同土质中采得约300份土样,用平板分离法筛选得到8株放线菌,经分类鉴定,其形态,培养特性,生理生化特性与紫黑吸水链霉菌形似,命名为紫黑吸水链霉菌Streptomycesviolaceoniger-hygroscopicus。用其发酵液对果蔬病原真菌—青椒疫霉病菌Phytophthoracapsici,番茄灰病菌Botrytiscinerea,黄瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum,黄瓜灰霉病菌BotrytiscinereaPers,苹果黑星病菌Venturiainaeualis,白菜黑斑病菌Alternariabrassicae等进行拮抗实验研究,结果表明有2株菌株的发酵液对青椒疫霉病菌有明显的抑制作用,1株对黄瓜枯萎病菌有较好的抑制作用,1株对番茄灰霉病菌有一定的抑制效果。

不吸水链霉菌基因文库的构建及初步筛选

采用碱裂解法从不吸水链霉菌提取染色体DNA,用Sau3AI对染色体DNA进行部分水解,利用透析袋法回收3.5～9kb之间的DNA片段。以pUC18为载体,用BamHI对其进行酶切,再用热敏磷酸酶去磷酸化,酶切产物与外源DNA按一定比例混合后,加入T4DNA连接酶进行连接。连接产物用受体菌E.coliDH5α进行转化,根据α-互补性质产生的颜色反应,挑选白色菌落,构建了相应的不吸水链霉菌基因文库。分别利用特异性探针2-1-1及1-2-1对不吸水链霉菌基因文库进行筛选,利用DIG-Ⅱ-dUTP对特异性探针进行标记,与基因文库中的阳性转化子进行Southern杂交,通过显色反应对杂交结果进行检测,由于时间关系,暂未筛选出阳性克隆,但这些工作对以后的相关实验研究具有很好的借鉴作用。

反相高效液相谱型分析检测吸水链霉菌17997变株发酵新产物

以吸水链霉菌17997为出发菌株,分别阻断格尔德霉素(geldanamycin,GA)生物合成酶基因簇中的I型聚酮合酶(type I polyketide synthase,pks)基因的第6模块,单加氧酶(monooxygenase,gdmM)基因和氨甲酰基转移酶(carbamoyltransferase,ct)基因得到3种变株(pks-)、(gdmM-)和(ct-)。比较变株与原株发酵产物的H PLC谱型,结合紫外吸收图谱分析。检测结果表明各变株的GA生物合成均被阻断,并产生3个不同于原始菌株的新物质。这证明基因操作所涉及的pks,gdm M和ct基因是GA生物合成的必需基因;这些基因的阻断可产生不同于原株的新物质。HPLC谱型比较可以在多样化代谢产物的产生菌中快速、准确地发现基因工程变株发酵产物的变化,指导新化合物的分离鉴定,样品用量甚微,是化学早期鉴别的有力工具。

透明颤菌血红蛋白基因在吸水链霉菌NND-52-C中的克隆与表达

将透明颤菌血红蛋白基因 (vgb基因 )克隆至链霉菌的质粒载体pIJ70 2中 ,构建成表达载体pLY70 2 ,并将pLY70 2质粒转化阿扎霉素B的高产菌株———吸水链霉菌NND 5 2 C的原生质体 ,获得转化子H。经发酵实验表明 ,在限氧的条件下 ,可以使NND 5 2 C菌株的生物量提高 14 4 % ,阿扎霉素B的产量提高 30 8%。

不吸水链霉菌公主岭变种诱导大豆抗病性与根际土壤微环境的变化

不吸水链霉菌公主岭变种(农抗"769")是一株来源于土壤中对多种植物病原真菌具有较强拮抗作用的农用链霉菌,为明确农抗"769"对大豆抗疫霉根腐病的免疫诱抗作用及对大豆生长土壤微环境的影响,对盆栽种植不同大豆品种植株进行下胚轴创伤接种,鉴定大豆幼苗对疫霉根腐病的抗性,接种7 d后测定幼苗叶片PAL、PPO、MDA、SOD、CAT、POD、GLU的活性及Chl的含量。小区试验采取随机区组设计,在大豆播种后以农抗"769"菌液浇灌,采用稀释平板法测定不同生育期土壤中可培养细菌、真菌、放线菌菌群数量,并测定土壤中过氧化氢酶、碱性磷酸酶、脲酶和蔗糖酶等生物酶的活性。试验结果表明:农抗"769"菌液浇灌后不同品种的大豆幼苗在抵御疫霉根腐病侵染时发病率均有不同程度的降低。4个品种在农抗"769"诱导下抗性顺序为:Williams 82>沈农9号>九农21>Jack,分别比对照提高74.74%、68.82%、14.32%和8.30%。农抗"769"诱导可增强大豆幼苗的诱导抗性,且在病原菌侵入时具有更强的系统抗性。在病原菌与农抗"769"的双重诱导下,PAL、PPO、SOD、CAT、GLU表达量分别比对照提高95.22%、34.55%、9.46%,73.01%和10.71%,Chl的含量比对照高18.19%;MDA比对照降低了33.47%,POD活性比对照降低0.69%,差异不显著。农抗"769"菌液浇灌对根际土壤微生物群落结构优化及土壤酶活性升高具有促进作用。农抗"769"菌液浇灌后大豆植株根际土壤中可培养细菌、放线菌菌群数量增加,真菌菌群数量降低,根际土壤中蔗糖酶、脲酶和磷酸酶活性与对照相比最高分别提高342.59%、73.98%和150.27%,过氧化氢酶活性变化不显著。农抗"769"诱导可提升大豆对疫霉根腐病的抗性,并对其生长的土壤微环境的改良具有积极的作用。

探讨不同剂量嗜热吸水链霉菌抗原诱导大棚肺动物模型

目的探讨不同剂量嗜热吸水链霉菌抗原是否能引起豚鼠大棚肺,及制作大棚肺动物模型的方法及最适宜的嗜热吸水链霉菌抗原剂量。方法 40只成年豚鼠随机分为A、B、C、D组,每组10只。B、C、D组为模型组,分别予嗜热吸水链霉菌抗原制剂1.0 mg(0.2 ml)1、.5 mg(0.3 ml)2、.0 mg(0.4 ml)3种剂量鼻内滴注;A组为对照组,予0.9%无菌生理盐水0.3 ml鼻内滴注。每周连续滴注3 d,连续滴注12周。结果 B组于第2周末,C、D组均于第1周末出现明显肺泡炎改变;B组于第4周末、C组于第3周末、D组于第2周末可见肉芽肿形成;C组在12周末可观察到肺成纤维细胞数目增多,B组无明显纤维化改变,D组豚鼠多在第3周因肺部感染死亡。模型组CT影像上均可见弥漫性磨玻璃影,后可见双肺多发性、边缘模糊的斑片状及微小结节状影,多呈小叶中心型。模型组肺组织均可见嗜热吸水链球菌生长。结论嗜热吸水链霉菌抗原可以在豚鼠引起典型大棚肺病变。1.5 mg(0.3ml)可作为构建嗜热吸水链霉菌抗原诱导的大棚肺动物模型的标准剂量。

吸水链霉菌应城变种的四个内源质粒及其逐个消除的研究

在改良质粒DNA提取方法的基础上,从三种农用抗生素的同一产生菌——吸水链霉菌应城变种中同时发现四个内源质粒,用双向电泳技术确定了它们均为CCC构型,根据分子量从大到小的顺序将它们分别命名为pHZ1、pHZ2、pHZ3和pHZ4,与已知分子量的CCC质粒分子同步电泳估计它们的分子量依次分别为61kb、4.7kb、4.1kb和3.3kb,基于这四个内源质粒中至少部分个体可能为接合性质粒,可在没有某个质粒的衍生菌株的菌坪上形成“麻点”的假设,我们分离和鉴定了三个质粒逐个消除的10-22衍生菌株,并在光学显微镜下确证了二种类型的麻点。

吸水链霉菌17997产生的4,5-双氢格尔德霉素的鉴别与检测

本文对从吸水链霉菌17997发酵提取获得的格尔德霉素精制品进行了LC-MS-MS分析,发现其中含有4,5-双氢格尔德霉素组分。对吸水链霉菌17997摇瓶发酵产物的硅胶板薄层层析分析表明,4,5-双氢格尔德霉素组分在发酵中期有积累。已知4,5-双氢格尔德霉素的抗肿瘤活性比格尔德霉素差,因而需要限制其在格尔德霉素制品中的含量。本文研究结果对以吸水链霉菌17997等为产生菌研究格尔德霉素发酵,促进4,5-双氢格尔德霉素转化为格尔德霉素以提高发酵液的品质,以及检测格尔德霉素制品中的4,5-双氢格尔德霉素组分具有实际意义。

吸水链霉菌17997格尔德霉素部分生物合成基因簇的克隆和分析

吸水链霉菌17997(Streptomyceshy groscopicus17997)是我所从中国云南土壤中分离到的格尔德霉素(geldanamycin,GDM)产生菌,GDM具有良好的抗肿瘤和抗病毒活性,但其肝毒性和水溶性差的缺点限制了其在临床上的应用。为了实现对GDM结构的生物学改造,首先要获得GDM的生物合成基因。根据GDM后修饰基因——氨甲酰基转移酶基因(gdmN)的保守序列筛选S.hygroscopicus17997的柯斯质粒基因组文库,共获得6个阳性克隆,选择CT-4阳性柯斯质粒进行亚克隆和测序,又通过PCR延伸的方法获得了与CT4连锁的将近5kb的外源序列,共获得28.356kb的外源DNA序列,其中包含了13个可能阅读框架,通过同源比较证实该序列与S.hygroscopicusNRRL3602中的GDM生物合成基因有很高的同源性。为进一步研究GDM生物合成基因的功能,并通过组合生物学的方法改造GDM的结构奠定了基础。

吸水链霉菌M-22产生的除草剂的研究

利用竞争性抑制谷氨酰胺生物合成的方法，从福州郊区土壤中分离到除草活性物质产生菌Ｍ－２２，其特征与除草剂双丙磷（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）产生菌吸水链霉菌ＳＦ－１２９３相近，Ｍ－２２代谢产物ＦＭ－２２经光谱分析证明与双丙磷同质。

吸水链霉菌井冈变种原生质体的制备与再生

目的研究井冈霉素产生菌吸水链霉菌井冈变种的原生质体制备与再生的最佳条件。方法使用溶菌酶水解菌体细胞壁法,分别考察影响吸水链霉菌井冈变种原生质体的制备与再生的各种因素。结果在R2YE液体培养基中,一级菌丝体的最佳培养时间为24 h,二级菌丝体的最佳培养时间为16 h,最佳甘氨酸质量浓度为5 g.L-1,最佳溶菌酶质量浓度为2 g.L-1,最佳酶解时间为60 min,最佳再生培养基为R2YE,原生质体的再生率最高可达到15.79%。结论本实验确定了吸水链霉菌井冈变种的原生质体制备与再生的最佳条件,能够得到较高的再生率。

不吸水链霉菌公主岭变种769原生质体制备条件初探

为获得较高的不吸水链霉菌公主岭变种769(简称链霉菌769)原生质体产率,采用酶解法制备原生质体,通过单因素试验法探索链霉菌769原生质体制备的最佳条件,包括溶菌酶浓度、酶解时间、酶解温度和渗透压稳定剂。试验结果表明,链霉菌769孢子在溶菌酶浓度为3.5mg/mL,酶解温度为36℃,酶解时间3h,以P缓冲液为渗透压稳定剂的条件下原生质体形成效果最好,原生质体再生率达到62.5%。链霉菌769原生质体的获得为以原生质体为基础的基因转移系统的建立奠定了基础。

吸水链霉菌NND-52-C基因工程宿主载体系统的构建

吸水链霉菌NND 5 2 C菌株是大环内酯类抗生素 阿扎霉素B的高产菌株。采用原生质体转化技术 ,将来自变铅青链霉菌TK2 4菌株的pIJ70 2质粒转化吸水链霉菌NND 5 2 C菌株的原生质体 ,建立了吸水链霉菌NND 5 2 C菌株的基因工程宿主载体系统。确定了NND 5 2 C菌株原生质体制备和再生的条件 ,其原生质体形成率达到 1 0 8个 mL ,再生率约为 0 2 % ,转化率为 1 0 2 ～ 1 0 3个转化子 μg质粒DNA。

采用嗜热吸水链霉菌单一抗原ST-omlA诱导小鼠大棚肺模型

目的探讨纯化的嗜热吸水链霉菌单一表面抗原能否诱导C57BL/6小鼠大棚肺模型。方法 C57BL/6小鼠20只,8周龄,雌性,体质量25～30 g,完全随机分为模型组和对照组,每组10只。模型组:纯化的嗜热吸水链霉菌表面抗原ST-omlA 0.2 mL(1 mg/mL)鼻内滴注,连续3 d/周,连续滴注4周;对照组:0.9%无菌生理盐水0.2 mL鼻内滴注,连续3 d/周,连续滴注4周。结果①组织病理学改变:模型组第2周末,可见肺泡炎改变;第3周末,可见肉芽肿改变;第4周末,可见纤维化改变。对照组无异常。②免疫组织化学染色结果:模型组ST-omlA滴注后的第4周末,Ⅰ型胶原蛋白及血管内皮生长因子表达明显增多,呈阳性;对照组Ⅰ型胶原蛋白及血管内皮生长因子表达呈阴性。结论纯化的嗜热吸水链霉菌表面抗原ST-omlA抗原制剂可以诱导C57BL/6小鼠大棚肺模型。

吸水链霉菌NND-52-C菌株产阿扎霉素B发酵条件的优化

通过碳源、氮源的单因子实验和正交实验 ,确定了吸水链霉菌NND 5 2 C菌株产阿扎霉素B最佳的液体发酵培养基组分 ( % ,质量分数 ) :甘油 4 5 ,玉米粉 3,黄豆粉 1,蛋白胨 1,NaNO3 0 5 ,NaCl 0 2 ,CaCO3 0 3,MgSO4·7H2 O0 0 5 ,FeSO40 0 5 ,pH 7 5 ;阿扎霉素B最佳的发酵条件 :发酵前期温度 30℃ ,起始pH 7 5 ;发酵后期温度 2 8℃ ,pH6 8;接种量 10 % ,装液量 30mL/ 2 5 0mL摇瓶 ,发酵时间 5d ,最终阿扎霉素B的产量达到 14 34mg/L ,比原配方以及原发酵条件提高了 76 %。

吸水链霉菌井冈变种JG5008转化系统的初建

吸水链霉菌井冈变种JG5 0 0 8的最佳转化条件是 :JG5 0 0 8在添加MgCl2 (cf=0 .0 0 5mol/L)和甘氨酸 (ρf=0 .5g/L)的含 10 %蔗糖的YEME培养基中接种浓度n≈ 10 8mL-1的JG5 0 0 8孢子悬液 ,37℃摇床培养 12h ,收获菌丝体 .在 32℃、溶菌酶浓度 ρ =2mg/mL的条件下溶菌 1h后制备原生质体 ,用T缓冲液在R2 YE培养基上进行转化 .本文初步建立了JG5 0 0 8的质粒载体系统 ,包括不同来源的pIJ70 2、pIJ92 2、pCZA16 8、pHZ132等质粒载体 .感染实验证实 ,JG5 0 0 8对外源DNA具有较强的限制性 .图 1表 5参

不吸水链霉菌公主岭新变种对大豆生长和产量的影响

[目的]明确农抗769作为免疫诱抗剂在大豆不同生育期和生长环境下对其产生的影响。[方法]以农用生防菌不吸水链霉菌公主岭新变种(农抗769)为试验材料,采用盆栽、田间种植等方法研究了该链霉菌对大豆生长的促生作用。[结果]不同品种的大豆对农抗769菌液的敏感性不同,其中农抗769菌液浇灌处理的大豆出苗率可提高1.2%~16.9%。不同生育期和种植环境大豆株高、茎粗、叶面积及根系等生长势指标的变化略有不同,各项指标的增长最多分别可达19.63%、37.35%、23.22%和19.92%,不吸水链霉菌公主岭新变种菌液对大豆生长的促生效果明显。菌液浇灌可提高大豆产量,其贡献在于促进大豆结荚数的增加。[结论]农抗769菌液对大豆出苗、生长及产量均具有促进作用。