杏和李树啤酒花矮化类病毒的检测与序列分析

从无明显症状表现的24个杏样品,37个李样品的1年生枝条表皮中抽提低分子RNA进行DIG-cDNA斑点杂交、RT-PCR、正反向聚丙烯酰胺凝胶电泳(Return-PAGE)和生物学检测。结果表明:杏有3个样品,李有6个样品带有啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid,HSVd)。从这9个样品中选a5、a17、p6、p16进行克隆和测序分析。所得序列与GenBank中已报道的HSVd序列同源性达99.0%～99.7%,且序列变异与地域、寄主等无明显相关性,说明HSVd的序列是比较保守的。

啤酒花矮化类病毒属属级寡核苷酸芯片筛查方法的建立

啤酒花矮化类病毒属是重要的植物类病毒属,目前尚无有效的筛查方法。通过对该属类病毒的核苷酸序列进行分析筛选,设计了8条用于该属类病毒筛查的属级特异性探针并制备了寡核苷酸芯片。应用啤酒花矮化类病毒标准样品对该芯片进行验证,结果表明所建立的属级芯片可以特异性检测啤酒花矮化类病毒,可检测到2ng/μL的总RNA。该芯片可用于啤酒花矮化类病毒属类病毒的筛查,为该属类病毒的检疫与防控提供技术支撑。

山西省枣树上啤酒花矮化类病毒的检测及序列分析

［目的］ 从枣树样品中分离鉴定啤酒花矮化类病毒（HSVd）。［方法］ 从山西省农业科学院果树研究所国家枣种质资源圃采集70份枣树叶片样品，提取小分子RNA后通过Northern杂交、RTPCR进行检测，并对阳性样品中的类病毒进行克隆测序，利用生物学软件对所得序列进行分析。 ［结果］ 70份枣树样品中有1份样品感染HSVd，克隆测序后，共获得13条HSVd序列，它们与GenBank上首次报道的HSVd序列相似性为92.6%~92.8% 。［结论］ 本研究首次在国内报道了枣树上分离得到的HSVd序列，HSVd枣树分离物与已报道的HSVd分离物差异较大。

啤酒花矮化类病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、灵敏、特异的定量检测啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid,HSVd)的实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)方法,设计了2对引物及特异探针,体外转录制备了RNA标准品,绘制标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。建立的定量标准曲线C t值与模板拷贝数对数之间呈良好的线性关系,相关系数R2为0.9988,扩增效率为95%;该方法的特异性好,与啤酒花潜隐类病毒(HLVd)、葡萄黄斑类病毒1(GYSVd-1)、葡萄黄斑类病毒2(GYSVd-2)和桃潜隐花叶类病毒(PLMVd)均无交叉反应;灵敏度为1.0×102拷贝/μL,比普通RT-PCR高10倍;试验内及试验间重复性试验的变异系数均小于3%。研究表明该方法适用于实际样品中HSVd的快速定量检测。

法国进境葡萄砧木中啤酒花矮化类病毒的检测与序列分析

为检测法国进境葡萄砧木中啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid,HSVd),对其进行了RTPCR检测及序列测定,并构建系统进化树比较了不同地域来源HSVd间的分子差异性。结果表明基于HSVd基因序列设计合成的1对引物能够扩增出302 bp大小的目标片段,而健康植株无此扩增产物。法国葡萄砧木中检出的HSVd分离物,与国内外已报道毒株的核酸序列同源性达90%~97%,与已报道的HSVd全基因组序列间差异较小,表明HSVd的序列变异与地域、寄主等无明显相关性。

柑橘3种病毒类病原多重RT-PCR检测技术的建立及应用

【目的】建立柑橘黄化脉明病毒(citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)、柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)和啤酒花矮化类病毒(hop stunt viroid,HSVd)的多重RT-PCR检测体系。【方法】设计多重RT-PCR引物,分析其特异性,确定其最佳浓度比、最适退火温度及灵敏度,在此基础上对福建地区的柑橘样品进行检测。【结果】确定了CYVCV-F/R、CTV-F/R和HSVd-F/R等3对引物的最佳浓度比例为1∶1∶2,最适退火温度为52.9℃,灵敏度结果显示该体系可检测模板稀释到10^(-2)的阳性样品。应用该体系对采自福建部分地区的157份柑橘样品进行检测,结果发现,CYVCV、CTV和HSVd的检出率分别为47.1%、56.7%和22.9%。【结论】成功建立了柑橘CYVCV、CTV和HSVd病原的多重RT-PCR检测方法,为该类病害的检测提供准确、快速的检测方法。

柑桔木质陷孔病类病毒贵州分离物的分子鉴定

从采自贵州感染了啤酒花矮化类病毒(Hopstunt viroid,HSVd)的柑桔植株中抽提总核酸,通过一对鉴别引物,经RT-PCR扩增初步筛选出柑桔木质陷孔病类病毒(Citrus cachexia viroid,CCaVd)。扩增该类病毒的全长核苷酸片段,通过克隆和测序,结果发现,该片段全长298 bp,与GenBank中报道的木质陷孔病类病毒分离物同源性达到96%以上。这是中国发生的木质陷孔病类病毒的分子生物学特征的首次报道。

甜樱桃斑果病研究进展及其防治

类病毒是一类单链、闭合环状低分子量的致病性RNA,大小为246~463bp,无蛋白质外壳包裹,是目前发现的最小病原物。类病毒侵染性强,可导致被侵染的细胞或组织发生异常,侵染后造成类似病毒感染的矮化、斑驳、叶变形、裂皮、斑果和坏死等症状。从类病毒的危害症状、检测及鉴定、致病机理、传播及防治等方面介绍了引起甜樱桃斑果病的啤酒花矮化类病毒。

HSVd靶向性ds-sRNA对感病番茄miRNA表达影响的分析

序列与类病毒基因组一致的外源ds-sRNA可在短时间内沉默类病毒基因组,miRNAs广泛参与基因表达调控,在这一生物过程中发挥重要作用。为了挖掘参与外源ds-sRNA沉默类病毒基因组的核心miRNAs,通过对感染啤酒花矮化类病毒(HSVd)的番茄植株外源施用靶向基因组不同分区的dssRNA,并在施用后不同时间段测定类病毒全基因组滴度,确定靶向HSVd中央保守区的ds-sRNA施用36 h对HSVd沉默效率最佳。基于最佳处理,对样本进行miRNA-seq、降解组测序以及关键miRNAs的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证。结果表明,与ddH2O处理对照相比,miRNA-seq中检出参与调控植物抗性的sly-MIR10528-p3和参与调控基因沉默的ptc-miR162a_R+1的表达量变化显著,qRT-PCR检出目标miRNA表达趋势与测序数据一致;降解组检测中,sly-MIR10528-p3和ptc-miR162a_R+1的表达趋势与miRNA-seq检测结果基本一致,另外检出参与调控病毒防御的sly-miR162、调控非生物胁迫抗性的vvi-miR3630-3p_L-2R-1_1ss21AT和参与调控基因沉默的bna-MIR169c-p3_2ss12GC17TG的表达量变化显著。本次检测共获得52个显著差异表达的新miRNA信息。本研究结果可为番茄抗病育种和分子药物开发提供新的理论基础和技术支持。