土曲霉抗耐药菌活性成分及其逆转耐药性作用研究

目的探讨土曲霉的抗菌活性成分及其对临床耐药菌的逆转作用。方法采用体外抗菌活性导向法及现代分离技术对土曲霉的代谢产物进行活性物质分离,采用核磁共振波谱法和质谱法确定化合物的结构。采用96孔板测定单体化合物对耐药菌的作用,筛选活性成分,并在无抗菌作用的浓度下分析活性成分对抗菌药物、耐药菌株最低抑菌浓度(MIC)的影响,评价活性成分逆转耐药菌耐药性的作用。结果从土曲霉的活性组分中分离出5种化合物,分别为烟曲霉酸(HA,化合物1)、对羟基苯丙酸(化合物2)、对甲氧基苯甲酸(化合物3)、吲哚-3-乙酸(化合物4)、对羟基苯甲酸(化合物5)。HA对多重耐药菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌的抑菌圈大小分别为(21.00±0.37)mm、(19.00±0.21)mm、(32.00±0.23)mm。HA在1/2 MICHA的浓度下,使头孢曲松对耐药菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌的MIC分别降低了75.00%,75.00%,87.50%,使氨苄西林对上述3种耐药菌的MIC分别降低了75.00%,75.00%,93.75%,使左氧氟沙星和环丙沙星对上述3种耐药菌的MIC均降低了75.00%;HA在1/4 MICHA的浓度下,使头孢曲松、氨苄西林、左氧氟沙星、环丙沙星对耐药菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的MIC均降低了50.00%,使头孢曲松、氨苄西林、左氧氟沙星、环丙沙星对耐药菌屎肠球菌的MIC分别降低了50.00%,87.50%,50.00%,50.00%;HA在1/8 MICHA的浓度下,使左氧氟沙星、环丙沙星对耐药菌金黄色葡萄球菌的MIC均降低了50.00%,使头孢曲松对耐药菌表皮葡萄球菌的MIC降低了50.00%,使氨苄西林、左氧氟沙星、环丙沙星对耐药菌屎肠球菌的MIC分别降低75.00%,50.00%,50.00%。结论化合物2至化合物5均为从真菌土曲霉代谢物中首次分离出。HA是土曲霉抗多重耐药菌的主要活性成分,对多重耐药菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和屎肠球菌均有抗菌、逆转耐药性作用,对3种耐药菌的最佳逆转浓度为1/2 MICHA。

耐盐碱土曲霉SYAT-1的分离鉴定及抑制植物病原真菌特性研究

盐碱地微生物长期在盐碱环境中共存与进化,具有独特适应性和生物学特性,成为微生物改良盐碱地的首选。从吉林省松原市典型苏打盐碱地土壤中分离到1株耐盐碱真菌菌株SYAT-1,通过形态特征观察和ITS-rDNA序列分析对该菌株进行鉴定,并对该菌株不同pH生长特性、耐盐性、拮抗植物病原真菌活性和潜在致病性进行研究。结果表明,该菌株鉴定为土曲霉(Aspergillus terreus)。菌株SYAT-1在碱性(pH 7.0-12.0)培养基条件下均可生长,其生长最适pH范围为7.0-9.0。在0-17.5 mg/mL NaCl和0-4 mg/mL NaHCO_(3)的PDA培养基上均能生长。拮抗植物病原真菌测定结果显示,菌株SYAT-1对供试植物病原真菌均有一定的抑制效果。潜在致病性测试结果表明,菌株SYAT-1对供试植物无潜在的致病性。土曲霉菌株SYAT-1属于耐高盐碱特性的真菌,并具有抑制植物病原真菌的特性,该结果为利用微生物改良盐碱土和植物病害生物防治提供新的菌株资源和理论支撑。

土曲霉DT2菌株固体菌剂修复烟嘧磺隆污染土壤研究

为解决玉米田烟嘧磺隆残留导致下茬高粱药害的问题,本研究通过单因素优化方法制备DT2固体菌剂,并采用室内盆栽和大田试验相结合的方法,在土壤中添加烟嘧磺隆并施用菌剂DT2,确定了DT2固体菌剂对烟嘧磺隆残留土壤的修复效果和对高粱药害的缓解作用。研究结果表明,烟嘧磺隆降解菌土曲霉DT2固体发酵最佳条件为p H值7、接种量10%、发酵时间168 h,室温储藏90 d有效活菌数仍可达3.3×10^(8)cfu/g。室内盆栽试验结果表明,土壤中烟嘧磺隆浓度分别为0.023和0.046 mg/kg时,分别添加菌剂6.25和12.5 g/kg处理30 d后,可将烟嘧磺隆对高粱株高的抑制率由26.95%和49.23%分别降低至1.79%和2.24%;当土壤中烟嘧磺隆浓度为0.094 mg/kg时,添加菌剂25 g/kg处理40 d后,可将烟嘧磺隆对高粱株高的抑制率由51.39%降低至4.89%。当土壤中烟嘧磺隆浓度为0.046 mg/kg时,添加菌剂12.5 g/kg,药后10 d,土壤烟嘧磺隆残留率下降56.42%,与对照差异极显著;药后30 d,土壤中烟嘧磺隆质量为0;DT2菌剂可以改善土壤环境,增强土壤脲酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶等土壤酶活性和土壤细菌、真菌等微生物多样性;施用菌剂后40 d,不仅能够缓解烟嘧磺隆对高粱叶绿素含量、净光合速率和根系活力等各项生理指标的抑制,而且对高粱株高、根长和鲜重等有一定的促生作用。大田试验结果表明,添加DT2菌剂能够有效减轻土壤中烟嘧磺隆残留对高粱的药害,提高出苗率和产量,降低病株率和株高抑制率;当土壤中烟嘧磺隆施药量为20、30和40 g a.i/hm^(2)时,分别添加DT2菌剂300、450和600 kg/hm^(2)能够将烟嘧磺隆残留对高粱的抑制降低至无明显药害水平。综上,土曲霉DT2菌剂对土壤中烟嘧磺隆残留有较好的修复作用,具有潜在的应用前景。

土曲霉固态发酵lovastatin的动力学研究

对Aspergillus terreus ATCC20542固态发酵产lovastatin的过程进行了研究,根据发酵过程中菌体生长和产物生成等规律,建立了土曲霉固态发酵的过程动力学模型,并对模型进行了参数拟合和验证。模型在一定程度上揭示了lovastatin发酵代谢过程的特征,可以用于分析固体发酵过程。

栖土曲霉生产角蛋白酶研究

从土壤中分离出 1株可有效降解角蛋白的栖土曲霉 (Aspergillusterricola) ,经UV射线处理及发酵条件优化 ,固态发酵产酶活力提高了 80 % ,达 1980U/ g。测定了该酶的基本性质 ,其作用最适 pH和温度分别为 7.5和45℃ ,可被DTT激活 ,被甲醛、Hg2 +等抑制 ,具丝氨酸蛋白酶的特性。

碳源对土曲霉中洛伐他汀生物合成的影响

通过摇瓶培养考察碳源种类及其初始水平对土曲霉次级代谢物洛伐他汀生物合成的影响。蔗糖和葡萄糖等快速利用碳源产洛伐他汀量较低,且易积累其直接前体monacolin J;淀粉和甘油等缓慢利用碳源有利于细胞生长和产物合成,其monacolin J积累相对较少,甘油为碳源时,可获得最高产物量(937.5±12.3)mg/L,乳糖不利于细胞生长导致较低的产物量。以淀粉为碳源时,其初始水平的增加可促进洛伐他汀的合成,碳质量分数为2%时对底物利用率较高,4%时最高产物量可达(875.4±23.1)mg/L,monacolin J则在2%—3%时积累较多,同时产生较多的2-甲基丁酸。

复合氮源对土曲霉洛伐他汀生物合成的影响

【目的】研究不同复合氮源对土曲霉生物合成洛伐他汀的影响。【方法】以酵母粉、蛋白胨、花生粉、燕麦粉、玉米浆和黄豆粉分别为复合氮源,通过摇瓶培养检测培养过程中洛伐他汀产量及其关键中间代谢物2-甲基丁酸盐和monacolinJ的积累量。【结果】以蛋白胨为氮源时,土曲霉细胞比生长速率最大,为8.06d-1;以花生粉为氮源时,洛伐他汀比产物合成速率最大,为1.44mg/(g·h),同时培养过程中2-甲基丁酸盐和monacolinJ对细胞得率明显高于其他氮源,均约为玉米浆的4倍;以酵母粉为氮源时,2-甲基丁酸盐的合成速率是monacolinJ的4倍,其monacolinJ转化率最高(92.0%),约是玉米浆的1.6倍。【结论】不同复合氮源不仅影响次级代谢的碳代谢流,还可能通过调控洛伐他汀合成途径中的关键酶(LovD或LovF)影响其生产。

重离子束-紫外线复合诱变选育高产Lovastatin土曲霉菌株

利用重离子束与紫外线复合诱变的方法,选育得到一株高产Lovastatin土曲霉菌株Aspergillus terreusUV150-3。液态摇瓶发酵中Lovastatin产量达966.32mg/L,较原始出发菌株A.terreus CA99提高了4.6倍。经连续传代培养5代,其遗传性状均比较稳定。

土曲霉(Aspergillus terreus)产生洛伐他汀(lovastatin)的研究

从土曲霉Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ＣＡ９５１发酵液中，分离出一种白色针状晶体，经质谱、紫外光谱、红外光 谱和核磁共振谱分析，与文献报道的洛伐他汀（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）基本一致。 Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ＣＡ９５１经亚硝基胍诱变，选出 编号为ＣＡＮ １８７的突变株，其产生洛伐他汀的能力比ＣＡ９５１高６６％。摇瓶发酵实验研究了不同碳源、氮源和 水质对 ＣＡＮ１８７ 菌株产生洛伐他汀的影响，并进行了 ５００Ｌ发酵罐实验，发酵单位达９００ｍｇ／Ｌ左右。

通过红曲霉-土曲霉属间原生质体融合提高Monacolin K产量

为获得高产Monacolin K的红曲霉菌株，将高产Monacolin K的土曲霉Aspergillus terreus CA99与低产Monacolin K的红曲霉Monascus anka M-3进行原生质体融合．生长24h的A．terrus CA99和M．anka M-3菌株用0．5％溶壁酶、0．3％蜗牛酶和0．3％纤维素酶混合酶液分别在34℃和30℃下处理5h和3．5h，原生质体的形成率分别为1．76×10^7／mI。和1．68×10^7／mL．两种原生质体分别置于30W的紫外灯下，距离30cm照射3min灭活，等浓度混合后用浓度为30％的PEG 6000融合15min．再生平板上共选取363株融合子，从中筛选得到多株Monacolin K产量高于出发菌株的高产融合子，其中有10株产量的提高幅度超过60％，有2株融合子（F49和F104）产量提高了将近一倍，分别为460μg／mL。和457μg／mL。对F49的发酵培养基进行优化，Monacolin K发酵单位达到了1216μg／mL。

土曲霉与红曲霉双灭活原生质体融合选育洛伐他汀高产菌株

研究原生质体融合技术选育洛伐他汀高产菌株的方法。土曲霉(Aspergillus terreus)和红曲霉(Monascus anka)用混合酶液(体积分数0.5%溶菌酶,0.3%纤维素酶,0.3%蜗牛酶)分别酶解5.0h和3.5h制备原生质体,土曲霉原生质体和红曲霉原生质体在紫外线(20 W,30cm)下分别照射5min和4min灭活,灭活后混合并用PEG(体积分数30%PEG,0.05mol/LCaCl2,0.05mol/L甘氨酸)介导融合。在187株融合子中筛选得到27株洛伐他汀产量高于红曲霉出发菌株的融合子,其中有7株的洛伐他汀产量是出发菌的2倍以上。双灭活原生质体融合方法成功选育出红曲霉洛伐他汀高产菌株。

衣康酸产生菌—土曲霉T-730原生质体的制备和再生

以衣康酸产生菌土曲霉T-730为供试菌株,研究了菌丝体培养方式、酶配比、菌丝的菌龄、酶解温度和时间、再生培养方法等因素对土曲霉原生质体形成和再生的影响.结果表明:采用液体静置培养12h～14h的菌丝体,在含有纤维素酶0.6%,蜗牛酶0.3%,溶菌酶0.1%的混合酶系统中,置35℃酶解3.5h,原生质体形成率最高;采用双层平板培养法于32℃再生,再生率达到70.6%.

土曲霉M11液体发酵时菌丝球形态与发酵产酶的关系

在不同的培养条件(如接种量、初始pH、温度、转速、不同碳氮源等)下,对土曲霉M11菌丝球的形态与产酶量的关系进行了深入研究,可以观察到有3种基本的菌丝球形态:丝状体、团块和球形,并且大小与致密度有明显差异.结果表明,即使在不同培养条件下,大小一致、致密的球形菌丝球(直径1～2 mm)都具有最高的产酶量,菌丝球的形态与真菌产酶量密切相关.因此,在工业发酵产酶过程中,对菌丝球形态的检测,可以作为一种关键的指标来检测发酵的效果.

洛伐他汀产生菌土曲霉原生质体的制备与再生

报道了产生降血脂药物洛伐他汀 (lovastatin)的土曲霉 (Asp ergillus terreus)原生质体的制备与再生条件及原生质体形成过程。结果表明用溶壁酶 5mg.m L-1、Zymolyase2 0 T2 .5mg.m L-1和蜗牛酶 2 .5mg.m L-1配制的混合酶液 ,可制备出土曲霉原生质体 ;其最佳酶解温度为 34℃ ,作用 5h。

土曲霉M11菌丝球对结晶紫的吸附脱色研究

研究了土曲霉M11菌丝球对水溶液中结晶紫染料的生物吸附作用,考察了菌丝球的死活及培养方式、培养温度、溶液盐度、培养时间、染料溶液初始pH值和接种量对结晶紫脱色率的影响。结果表明,土曲霉M11的菌丝球在35℃1、50 r.min-1振荡培养方式下脱色效果较好,灭活菌丝球脱色效果更好,其24 h内对结晶紫脱色率均达90%以上;培养温度和接种量对菌丝球脱色效果影响不大;在初始pH值为6时,脱色效果最好,对结晶紫脱色率达93%以上。另外,较低的盐浓度对菌丝球脱色效果有一定抑制作用,而较高的盐浓度对结晶紫脱色效果无明显影响。

非免疫抑制患者内源性土曲霉眼内炎1例及实验研究

目的报道1例非免疫抑制患者内源性土曲霉眼内炎及实验研究。方法采集本院收治的1例非免疫抑制内源性眼内炎患者的玻璃体液,进行直接涂片镜检、培养,并进一步对分离到的菌株进行表型分析,分子鉴定及E-test法体外抗真菌药敏试验。结果直接涂片镜检可见真菌孢子及有隔真菌丝,培养7d后生长菌落较小,形态不典型,经分子鉴定及多次转种观察形态确定为土曲霉。E-test法测得MIC值(μg/mL):伊曲康唑0.250,伏立康唑0.125,两性霉素B 2.000。结论早期诊断性和治疗性玻璃体切割术有利于获得足够的样本用于微生物鉴定,并可以减少玻璃体中微生物量及炎性物质。直接涂片迅速报告镜检结果对临床最初选择抗菌药物有重要意义。对于直接分离自临床标本的形态不典型的丝状真菌,采用ITS序列分析等分子生物学鉴定有助于尽早定种,缩短鉴定时间。

土曲霉致双外耳道曲霉病

目的报道1例发生在双外耳道的曲霉病。方法取双耳耵聍行真菌直接镜检,将耵聍接种到沙堡培养基培养,并对培养出的病原菌进行形态学鉴定和rDNA序列分析。结果耵聍真菌直接镜检阳性,耵聍在沙堡培养基25℃培养长出沙褐色菌落,28℃小培养后光镜及扫描电镜下见分生孢子头呈柱状,顶囊半球形,直径约10μm,小梗双层,两层小梗的长度无明显差别,平行紧密生长在顶囊的上2/3处。分生孢子呈球形,小而光滑。分生孢子梗壁光滑、透明。提取真菌总DNA用PCR方法扩增rDNA序列,测序后登录Gene Bank进行比对,该菌与土曲霉菌株ATCC1012 rDNA序列一致性达100%,鉴定为土曲霉。患者外用4%氟康唑注射液直接滴耳,2次/d,治疗1个月后痊愈。结论确诊1例双外耳道土曲霉病,局部应用氟康唑注射液治疗外耳道曲霉病有效。

栖土曲霉蛋白酶特性研究

本文主要研究了栖土曲霉液体培养时产蛋白酶的属性,探讨了其最佳发酵方式,并研究了液体发酵时最佳培养基配比和培养条件。研究表明:液体发酵培养时中性蛋白酶活力最高,此栖土曲霉适合液态发酵培养,液态发酵时最佳培养基配比为麸皮3%,米糠1%,玉米粉1%,K2HPO40.4%,最适培养温度为28～30℃、培养时间为72hr、接种量为8%。

土曲霉发酵过程中菌形和有机酸积累对产物合成的影响

对土曲霉(Aspergillus terreus)产洛伐他汀过程中胞内外有机酸浓度进行测定,发现菌形对发酵过程胞内外有机酸浓度和洛伐他汀的产量有很大的影响。在发酵过程中形成球状菌比丝状菌更有利于洛伐他汀的合成,并且球状菌的胞内有机酸浓度普遍高于丝状菌。通过把有机酸与产素关联,发现在高产批次中胞内柠檬酸,α-酮戊二酸以及丙二酸大量积累,并且在产素期维持三羧酸循环的低通量能促进洛伐他汀高产。

红树林土曲霉GX7-3B多糖的提取工艺优化及抗氧化活性研究

通过正交实验对红树林土曲霉GX7-3B多糖的提取工艺进行优化,用Sevage试剂脱蛋白并纯化多糖,用DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力评价多糖的体外抗氧化活性。结果表明,红树林土曲霉GX7-3B多糖的最佳提取工艺为:提取温度75℃、提取时间3h、料液比1∶30(g∶mL),在此条件下,多糖提取率达到3.14%;在实验浓度范围内,多糖清除DPPH自由基的能力及总抗氧化能力与其浓度呈正相关关系。表明红树林土曲霉GX7-3B多糖是一种天然抗氧化剂。