两种型特异性引物聚合酶链反应法检测乙型肝炎病毒基因型和亚型的评价

目的比较并评价本室创建的方法和日本Naito等建立的乙型肝炎病毒（HBV）型特异性引物聚合酶链反应（PCR）基因分型法。方法分别用新方法和Naito法检测系列稀释的含有A、D基因型和B1、C2亚型HBV基因组的质粒及不同浓度比例的B1／C2亚型混合质粒，评价两种方法的灵敏度和特异度。此外，用该两种方法分别对深圳市、河北邯郸市、新疆乌鲁木齐市送检的113份HBV DNA阳性慢性乙型肝炎患者的血清标本进行HBV基因分型，并对该两种分型方法检测结果不一致的血清样本，用PCR产物直接测序法分析。结果两种方法对单一型别的质粒样本灵敏度无差异，但新方法对B／C混合型质粒样本的灵敏度及对各型别质粒样本的特异度明显优于Naito法。该两种方法检测单一基因型血清标本的灵敏度无差异，但新方法对B／C混合型血清样本的检出率更高。该两种方法检测结果总符合率为83．2％（94／113），不一致率为16．8％（19／113）。从两法分型不一致的19份血清标本中，选取15份以PCR产物直接测序法进行分析，结果与新方法检测结果完全一致，而与Naito法不一致。结论本室建立的HBV型特异性引物-PCR基因分型法具有较高灵敏度，其特异度也明显优于目前临床上常用的Naito法，适用于HBV基因型和基因亚型的临床及流行病学研究。

丙型肝炎病毒型特异性聚合酶链反应基因分型的临床应用

目的 探索丙型肝炎病毒 (HCV)基因型在不同人群中的分布规律及流行优势型。方法 分别对健康体检者、住院患者和血液透析患者抗HCVIgG阳性标本 ,用自行设计的 5’非编码区 (5’ NCR) 1、2、3、1b型特异性引物进行扩增和基因分型。结果 3组人群中血液透析患者HCV感染率最高 ,抗HCVIgG和HCVRNA阳性率分别为 5 5 .37%和 38.84%。基因型以 1b亚型为主 ,1b及 1b的相关型占 91.6 7%。结论 本地区HCV流行优势型为 1b亚型。

聚合酶链式反应-特异性序列引物基因定型在新生儿溶血病ABO血型定型中的应用

目的研究聚合酶链式反应-特异性序列引物(PCR-SSP)基因定型在新生儿溶血病(CHDN)ABO血型定型中的应用。方法收集20例来自广东省肇庆市第一人民医院新生儿溶血病(HDN)的样本,对这些样本进行ABO血型鉴定等一系列血型血清学方法进行检测,然后用PCR-SSP基因定型技术进行样本的基因分型。结果与其血型的血清学分型结果进行比较,新生儿溶血病ABO血型的定型是新生儿输血的必要保障,而PCR-SSP基因分型较血型血清学方法更快捷、准确。结论 PCR-SSP基因正型技术将不再局限于疑难血型的鉴定中,并会越来越多地应用于HDN的鉴定中。

逆转录聚合酶链反应检测Ⅲ型登革病毒的敏感性和特异性研究

本文应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测Ⅲ型登革病毒基因。所设计引物在E基因组,引物2位于核苷酸序列的1139～1158位,引物1位于1453～1471位,反应产物为333bp,内含1个HindⅢ限制性内切酶位点,酶切后有128 bp和199 bp两个片段。产物在含溴化乙锭的2％琼脂糖中电泳。采用RT-PCR法可测出少至5个半数组织细胞培养感染量(TCID_so)的病毒RNA。

应用顺序特异性引物聚合酶链反应检测华南人群HLA-B座位第4外显子变异

目的 为探明中国华南人群中因HLA B座位发生基因突变而引起表达变异存在的可能性。方法 用顺序特异性引物聚合酶链反应 (PCR SSP)对 75例经血清学分型为纯合型样本再次分型 ,对有差异的结果使用PCR SSP方法检测第四外显子突变情况。结果 75例血清学指定为纯合型标本经DNA分型证实有 1 2例为杂合型。 1 2例结果有差异的样本经PCR SSP法表达变异的筛查发现有 1例存在第四外显子额外胞嘧啶插入 ,经DNA分型发现的第二基因为沉默基因。结论 应用PCR SSP方法可检测HLA B等位基因突变 ,该突变导致HLA B基因表达无效 ,进行HLA基因表达变异的检测可提高HLA分型的准确性 ,更加有效的指导临床进行器官和骨髓的选配。

聚合酶链反应顺序特异性寡聚核苷酸探针反向杂交法在HLA-DRB_1分型中的应用

目的:探讨聚合酶链反应顺序特异性寡聚核苷酸探针(polymerasechainreaction-sequencespe-cificoligonucleotideprobes,PCR-SSOP)反向杂交法应用于人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)-DRB1配型的可行性。方法:随机选取25例已行聚合酶链反应顺序特异性引物(polymerasechainreac-tion-sequencespecificprimers,PCR-SSP)法HLA-DRB1配型的肾移植受者的血标本,采用PCR-SSOP反向杂交法再次配型,并与PCR-SSP法的结果比较。结果:两法的一致性达92%。2例不一致的患者经再次PCR-SSOP反向杂交法配型后,其中1例与PCR-SSP结果一致,PCR-SSOP反向杂交法的平均操作时间为4小时30分。结论:PCR-SSOP反向杂交法是一种能以中等分辨度进行等位基因分型的方法,操作较简单,结果解读客观,适用于临床肾移植配型。

聚合酶链反应-序列特异性引物方法检测儿科疾病基因多态性

目的建立多个基因多态性分型的聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)的方法,以推广其在儿科疾病分子水平研究中的应用。方法应用PCR-SSP的方法分析以下基因的多态性,TNF-α-308A/G和-238G/A变异,IL-6-174G/C变异。结果应用同一个PCR扩增程序,可同时对多个基因、多个临床样本的多态性进行分析,基因型清晰,且基因分型快速、准确。结论PCR-SSP适合对大样本、多基因的多态性进行分析,成本低、快速、准确,在儿科疾病分子水平研究中前景良好。

巯基乙酸修饰的CdTe量子点对聚合酶链反应特异性的影响

合成了巯基乙酸（TGA）修饰的量子点,X衍射分析证实CdTe相的存在,高分辨电子显微镜分析表明量子点的直径为3 nm,Zeta电位表征表明量子点表面带有负电荷.把TGA修饰的CdTe量子点加入到聚合酶链反应（PCR）反应液中,使用brcaa1基因载体作为PCR反应的模板,进行两轮PCR反应.最终的PCR产物通过w=1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析,结果表明,在0-1.33 g/L范围内,随着量子点的量逐渐增加,非特异性的扩增条带逐渐消失,荧光（PL）光谱表明PCR反应后的量子点荧光强度降低.X射线光电子能谱（XPS）证实PCR反应前后Cd元素和Te元素的能谱峰并没有出现化学位移,吸收光谱（UV-vis）表明了PCR反应之后的吸收强度增强.因此,TGA修饰的CdTe量子点置于PCR反应液之中,能提高PCR的特异性,可以应用于超灵敏DNA检测、光电生物传感器.

序列特异性引物多聚酶链反应方法进行大样本多基因的多态性鉴定(英文)

目的建立多个基因同时进行多态性分析的序列特异性引物多聚酶链反应(PCR-SSP)方法,以满足其在临床检验中进行基因多态性鉴定时的应用。方法应用优化后的PCR-SSP的方法分析以下基因的多态性:TNF-α-308A/G和-238G/A变异、IL-6-174G/C变异、CYP2D6*10B外显子第188位的C/T变异。结果应用同一个PCR扩增程序,可同时对多个基因、多个临床样本的基因多态性同时进行分析,基因型清晰,而且基因分型快速、准确。结论优化后的PCR-SSP适合对大样本、多个基因的单核苷酸位点变异进行多态性分析,值得在临床检验的应用中推广。

应用甲基化特异性聚合酶链反应分析P15基因对成人急性白血病微小残留病灶的检测价值

目的 :评价由甲基化特异性聚合酶链反应分析P15基因甲基化对成人急性白血病微小残留病灶的检测价值。方法 :运用甲基化特异性聚合酶链反应 ,分析了 38例各种类型的急性白血病在初诊时和缓解后的不同阶段P15基因的甲基化状态。结果 :①甲基化特异性聚合酶链反应检测P15基因甲基化的敏感性为 2 .0× 10 -4。② 38例急性白血病初诊时的P15基因甲基化的出现率为 6 8.4 % ,正常对照组无甲基化。③P15基因甲基化可能与疾病的预后有关。经治疗后P15基因甲基化消失的病人与P15基因甲基化持续存在的病人复发率之间的差异有显著性 (0 %比 6 8.8% ,P <0 .0 1)。结论 :P15基因甲基化状态在急性白血病中有较高的检出率 (达 6 8.4 % )。应用甲基化特异性聚合酶链反应分析急性白血病P15基因甲基化状态的特异性和敏感性高。该指标可监测急性白血病微小残留病灶相关的情况 ,值得在临床上推广。

聚合酶链反应检测对肺结核诊断的特异性和敏感性探讨

利用聚合酶链反应(PCR)技术检测482例肺部疾患病人的痰标本,并同时以涂片,培养法对病人疾标本进行检查,以评估PCR的敏感性和特异性。结果显示：PCR敏感性最高,62％(4／236),但特异性最低,为63％(54／246)。故目前此法仅能作为诊断肺结核的辅助检查,其方法有待进一步完善。

基于细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ序列位点特异性聚合酶链反应鉴别鹿茸及其伪品

目的:基于细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)序列建立一种新的PCR鉴定方法,以快速鉴别出梅花鹿、马鹿茸片与驯鹿茸片。方法:采集不同来源的鹿茸片共60批。通过比较梅花鹿、马鹿与驯鹿等其他伪品的COⅠ基因序列差异,根据SNP鉴别位点设计梅花鹿茸、马鹿茸同驯鹿茸的鉴别引物Cne-F、Rt-F、Co-R,并对影响聚合酶链反应(PCR)结果的主要因素变性时间、退火温度、退火时间、延伸时间等进行方法学考察和优化。结果:该实验构建的双位点特异PCR鉴别体系,基于COⅠ的鉴别位点,可通过PCR扩增获得294 bp的梅花鹿、马鹿特异片段,而产生514 bp的驯鹿特异片段,伪品及阴性对照无条带。结论:该实验建立对梅花鹿、马鹿及驯鹿等其他伪品鹿茸的PCR鉴别方法简便、可靠。

五引物单管聚合酶链反应（PCR）扩增法快速测定人CYP2D610等位基因的类型

以人CYP2D6 10等位基因位点为研究对象,建立了一种由5条引物同时PCR扩增在单管中进行等 位基因快速检测的新方法。该方法在等位基因特异性扩增法的基础上,在内引物3′端引入了一个人工错配 碱基并在5′端附加一段“尾巴”作为引物的锚定部分,使扩增反应的特异性得到了提高。本实验所建立的方 法可在单管中同时完成SNP3种可能等位基因类型的快速检测。实测了47份样品的CYP2D6 10等位基因 的类型,并随机对其中20份样品的测定结果用RFLP法进行了验证,结果完全一致。结果表明本法简便、快 速,结果准确。

金纳米粒子对聚合酶链式反应体系中长链DNA特异性扩增的效应

以乙烯受体基因ETR1（2500bp）和山梨醇脱氢酶基因（SDH）（1100bp）为材料，研究了不同浓度金纳米粒子对聚合酶链式反应（PCR）体系中大于1000bp的长链DNA特异性扩增的效应。结果表明，金纳米粒子显著增强了ETR1和SDH在PCR时的特异性扩增，有效降低了非特异性扩增。在ETR1和SDH的PCR中，金纳米粒子适宜浓度为0．4nmol·L^-1。在50℃-62℃的退火温度范围内，金纳米粒子均能够显著增强ETR1和SDH的特异性扩增。因此，金纳米粒子不仅提高了1000bp以上的长链DNA在PCR扩增的特异性，而且拓宽了PCR的退火温度范围。

聚合酶链反应在口岸鼠疫监测中的特异性和敏感性试验

目的利用UDG防止聚合酶链反应(PCR)的产物污染,以2个不同基因为靶序列,设计了3对引物进行PCR扩增。方法用不同的模板考察方法的特异性和灵敏性。结果该方法可以特异性的检出鼠疫菌,对于DNA模板,检测灵敏度可以达到7CFU。结论PCR技术是一种快速、敏感、特异性很高的方法。

检测HBV基因组nt551A→G突变特异性聚合酶链反应的建立与初步验证

目的：建立一种特异而敏感的检测乙型肝炎病毒(HBV)基因组nt551位A→G变异株的方法。方法：根据已知的HBV基因组序列，结合国内主要流行亚型adr和adw的特点，合成在nt55l位分别为A或G两对引物，建立了突变特异性聚合酶链反应方法。结果：利用该方法对由16份乙型肝炎患者血清扩增的HBVS基因片段进行了初步检测。结果14份样本nt55l为A，l份为G，l份nt55l非A非G。经核苷酸序列分析表明结果正确。结论：该法是鉴定HBV基因组nt55l位A→G变异株的特异而敏感的方法。

双引物聚合酶链反应同时快速检测梅毒螺旋体和单纯疱疹病毒Ⅱ型

目的建立双引物聚合酶链反应(PCR)用于同时快速检测梅毒螺旋体和单纯疱疹病毒Ⅱ型。方法基于单纯疱疹病毒II型(HSV-2)的DNA聚合酶基因以及梅毒螺旋体47KD膜蛋白基因序列,自行设计2对特异性寡核苷酸引物,建立了同时检测上述2种病原体的双引物PCR。结果各特异性引物仅扩增相应的病原体DNA,即单纯疱疹病毒Ⅱ型扩增产物为202bp以及梅毒螺旋体扩增产物为252bp。其他11种生殖道常见微生物及正常人基因组DNA不被扩增。检测了51例临床标本,梅毒螺旋体暗视野显微镜检查阳性检出率为15.7%,双引物PCR阳性检出率为19.6%;二种方法检测结果间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。HSV阳性培养率23.6%,双引物PCR阳性率47.1%,双引物PCR阳性检出率显著高于HSV培养且差异有统计学意义(P=0.019);上述临床标本分别进行了2种病原体的单引物PCR,与双引物PCR对照结果完全一致。结论我们建立的双引物PCR一次可同时检测2种病原体,且有快速、敏感、特异以及简便的特点。

套式聚合酶链反应在豚鼠巨细胞病毒宫内感染模型中的应用价值

目的 运用套式聚合酶链反应 (N -PCR)检测豚鼠巨细胞病毒 (GPCMV)宫内感染 ,并探讨N -PCR在模型建立中的应用价值。方法 选择无感染史豚鼠 ,受孕后腹腔接种GPCMV ,分娩后 2 4h内处死 ;观察妊娠结局 ,运用N -PCR检测亲代及子代感染情况 ,并对标本进行病理学检查。N -PCR的特异性实验设阴性、空白和阳性对照。结果 感染孕鼠出现病毒血症征象 ,胎仔出现流产、死胎等异常结局。N -PCR检测显示 ,亲代 10 0 % ( 10 / 10 )感染 ,子代 96 .0 % ( 2 4 / 2 5 )感染 ,且感染脏器均出现非特异性组织病理学变化。N -PCR有较高的GPCMV检测特异性和灵敏性。结论 N -PCR检测GPCMV宫内感染 ,简便、快速、灵敏、准确 。

用甲酰胺提高多聚酶链式反应的特异性、灵敏度和效率的研究

在多聚酶链式反应体系中加入甲酰胺可以有效地抑制非特异性扩增,提高特异性扩增,并使反应的灵敏度提高一个数量级。