新型常压室温等离子体-紫外复合诱变选育埃莎霉素Ⅰ高产菌株

目的通过对埃莎霉素Ⅰ产生菌WSJ-IA进行诱变选育研究,以期获得埃莎霉素Ⅰ高产菌株。方法使用多功能等离子体诱变系统(multifunctional plasma mutagenesis system,MPMS)对出发菌株的孢子进行等离子体和紫外复合诱变,设定不同的诱变时间处理孢子悬液,通过致死率确定合适的诱变条件,利用突变株摇瓶发酵效价筛选出正突变菌株。结果在MPMS射频功率为100W,处理距离5mm,气体流量12.5SLM,等离子体-紫外辐射时间为50s时,菌株致死率为96.08%。在此诱变条件下,以突变株的初筛效价为指标的突变率、正突变率分别达到63.96%和22.52%,复筛效价是出发菌株1.5倍以上的有5株,占复筛菌株的9%。最终筛选出一株发酵单位比出发菌株提高221%、埃莎霉素Ⅰ组分含量提高192%的正突变株IA-425。42L自动发酵罐发酵结果表明,该菌株埃莎霉素Ⅰ产量达到(2000±200)μg/m L左右。结论新型等离子体复合紫外诱变方式,可有效提高菌株的埃莎霉素Ⅰ发酵产量和组分含量。这为埃莎霉素Ⅰ的大规模发酵和临床前研究奠定了良好基础。

利用异源正调控基因acyB2构建埃莎霉素Ⅰ高产菌株

必特螺旋霉素(bitespiramycin,BT)是以异戊酰螺旋霉素(简称为埃莎霉素)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ为主要成分的多组分抗生素。通过阻断3-O-酰基转移酶基因(sspA),获得了只产埃莎霉素Ⅰ的WSJ-2菌株,但其发酵产物中含有大量螺旋霉素,而埃莎霉素Ⅰ含量较低。为提高4″-异戊酰基转移酶基因(ist)在WSJ-2中的表达水平,从而提高埃莎霉素Ⅰ的产量,首先构建了含有ist基因和其正调控基因acyB2连锁片段的重组质粒pSET152-ia,然后将其导入到埃莎霉素Ⅰ产生菌WSJ-2中,通过具有阿普拉霉素(apramycin)抗性标记的链霉菌整合型载体pSET152整合到WSJ-2的染色体上,获得新的埃莎霉素Ⅰ产生菌WSJ-IA。在不同发酵时间定量检测ist的表达水平,WSJ-IA中ist的表达量要明显高于WSJ-2。WSJ-IA高产菌株的发酵单位从(280±20)μg/ml提高至(1160±108)μg/ml,较原始菌株WSJ-2提高了314%,而且在WSJ-IA发酵产物中埃莎霉素Ⅰ与螺旋霉素Ⅰ含量的比值是WSJ-2的2.4倍左右,说明在引入acyB2基因的同时提高了菌株的发酵单位和埃莎霉素Ⅰ的产量。

埃莎霉素Ⅰ组分高含量、高产量基因工程菌WSJ-IA及其原株的鉴定

【目的】利用调节基因acyB2激活异戊酰基转移酶(ist)基因表达的特点,将ist与调节基因acyB2在异戊酰螺旋霉素(埃莎霉素)Ⅰ产生菌菌株中共表达,获得埃莎霉素Ⅰ单组分的高含量及高产量菌株WSJ-IA。对其及原始螺旋霉素产生菌菌株Streptomyces spiramyceticus F21进行了初步鉴定。【方法】从形态学、培养和生理生化特征、细胞壁化学组成、16S rRNA基因序列、5个看家基因(atpD、gyrB、rpoB、recA和trpB)蛋白分析和系统发育树构建等方面对该菌株及其原株进行了鉴定。【结果】两株菌在形态培养特征、生理生化特征、细胞壁化学组成、16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白水平基本一致,在系统发育树分析中同处在一个分支中。而在16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白水平在系统发育上它们均与已知相近菌株处于不同的分支上,并且与不同基因的相近菌株各有不同,其中无一报道产生螺旋霉素。【结论】Streptomyces spira-myceticus F21可能是一个产生螺旋霉素的链霉菌新种,16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白序列分析可以作为埃莎霉素Ⅰ基因工程菌生产过程中进行鉴别的分子标志。