神秘果素基因合成及其液泡积累表达载体DC-miraculin的构建

在不依赖神秘果(Synsepalum dulcificum Daniell)植物资源的条件下,根据已报道的神秘果素基因序列合成24条寡核苷酸引物,通过重叠延伸PCR法合成了神秘果素全基因。为使神秘果素导向液泡积累,利用菜豆蛋白C末端四肽的液泡定位功能,在人工合成基因的3'末端加入了编码液泡定位短肽的核苷酸序列。将该基因序列插入植物表达载体YH4215,成功构建了神秘果素植物双元表达载体,命名为DC-miraculin。载体上的神秘果素基因由双CaMV35S启动子控制,转基因植物的报告基因为gusA,抗性筛选标记为潮霉素抗性基因hpt。

人血纤维蛋白溶酶原K5环的基因合成、表达、纯化与活性鉴定

根据大肠杆菌遗传密码的偏爱性 ,人工合成人血纤维蛋白溶酶原 K5全基因 ,并在原核系统中以硫氧还蛋白融合蛋白的形式实现了高效表达 .重组蛋白通过 Ni2 +金属螯合层析得到初步纯化 ,通过肠激酶切割去除了融合标签 .应用鸡胚尿囊膜实验检测切割后的 rh K5的生物学活性 ,发现与对照组相比 ,rh K5能明显地降低血管管径、血管总面积以及血管总面积与视野面积的比值 ,表明切割后的产物具有显著抑制新生血管生成的生物学活性 .为进一步研究和开发抗血管生成药物奠定了基础 .

日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团(TSP2HD)基因合成、表达与免疫原性研究

目的合成和表达日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团(TSP2HD)基因,并研究其免疫原性。方法采用重叠PCR人工合成日本血吸虫TSP2HD(aa107～aa182)完整基因片段,经测序正确后,将此片段插入表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒TSP2HD-PG,转化大肠埃希菌BL21(DE3),获得含重组表达质粒的转化子,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察TSP2HD融合蛋白表达情况。用谷胱甘肽(GST)融合蛋白纯化胶(glutathione sepharose 4B)从表达产物裂解上清中纯化GST-TSP2HD融合蛋白,用凝血酶切割融合蛋白,制备纯化的重组TSP2HD蛋白。通过蛋白质印迹(Western blotting)分析重组TSP2HD蛋白与血吸虫病患者血清及血吸虫重感染兔血清的免疫反应性;重组TSP2HD蛋白刺激血吸虫感染小鼠淋巴细胞进行淋巴细胞增殖试验,通过比较实验组与对照组脉冲指数(cpm)值的差异研究重组TSP2HD蛋白的免疫原性。结果经过3轮重叠PCR扩增,获得长228bp的TSP2HD基因,序列分析证实与天然基因序列完全一致。含重组质粒TSP2HD-PG的转化子细菌,经IPTG诱导后表达相对分子质量(Mr)约为34000的可溶性GST-TSP2HD融合蛋白。凝血酶切割GST-TSP2HD融合蛋白获得纯化的重组TSP2HD蛋白。Western blotting分析证明,重组表达蛋白可被血吸虫重感染兔血清和血吸虫病患者血清识别,有较好的免疫反应性;重组TSP2HD蛋白能刺激血吸虫感染小鼠脾细胞增殖,实验组cpm值明显高于对照组,两者间差异有统计学意义(P<0.01)。结论日本血吸虫TSP2HD基因合成及表达获得成功,重组TSP2HD蛋白有天然免疫原性。

人GnRH及其转运肽基因合成及鉴定

目的人工合成人GnRH及转运肽(TRS)基因。方法根据已发表的人GnRH基因mRNA序列以及转运肽(9个左旋精氨酸)基因核苷酸序列,设计一对核苷酸,再用含7mol/L尿素的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,然后以这对核苷酸3′末端短互补序列退火、补齐,合成长达90bp的目的序列GnRH/TRS。将其亚克隆到pMD18T载体上,构建重组质粒pYC1。酶切鉴定筛选出阳性克隆pYC1,并测序。结果GnRH/TRS序列由90个核苷酸组成,扩增产物与原设计序列同源性达100%。结论已成功合成人GnRH/TRS基因,为进一步研究和应用奠定基础。

嗜热古菌高温酸性淀粉酶基因合成和大肠杆菌中的表达

BD5088是来源于1种嗜热球菌Thermococcus sp.的高温酸性α-淀粉酶的人工突变体,研究中根据BD5088基因的氨基酸序列,经密码子优化,用2步PCR法合成去信号肽后的成熟肽基因。该基因全长1311bp,由436个氨基酸组成。现将其克隆到大肠杆菌的表达载体pET30a上,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达出的目的蛋白分子量约为48ku,大小与理论值一致,经过Ni+树脂纯化,得到纯化后的重组酶BD5088。重组α-淀粉酶BD5088具有α-淀粉酶的活性,最适反应温度范围为70～85°C,最适反应pH值为5.6～6.0,在100℃下酶活性半衰期约30min。活性不依赖于Ca2+。本研究为该基因在毕赤酵母中的表达和基因的定向进化改造打下了基础。

人表皮生长因子(hEGF)基因合成及在枯草杆菌BS9920中分泌表达

采用 PCR技术人工合成了一段长约 1 75 bp的人表皮生长因子 ( h EGF)的基因片段 .为了便于克隆 ,在该片段的 5′端设计了 Pst 的酶切位点及与 p US1 86载体 signal sequence相连接的碱基部分 ,在 3′端设计了 Hind 的酶切位点及终止密码子 .经 DNA测序分析 ,合成的片段与已发表的 h EGF在序列上完全一致 ;之后将其克隆至枯草杆菌分泌型质粒载体p US1 86上 ,构建重组载体 p USE并转化一株枯草杆菌突变菌株 BS992 0感受态细胞 ;以 PCR法快速筛选重组菌落 ,RIA检测结果表明 BS992 0阳性转化子能够表达和分泌 h

基孔肯雅病毒包膜蛋白E2的全基因合成及原核表达

目的通过对全长基孔肯雅病毒包膜蛋白E2(CHIKV-E2,1～404 aa)及其跨膜疏水区(351～378 aa)缺失突变体E2(1～350 aa)进行原核表达,分析跨膜疏水区对E2蛋白在大肠杆菌中表达的影响。方法利用ExPasy预测软件对E2蛋白跨膜疏水区进行预测分析,根据GenBank数据库中CHIKV-E2氨基酸序列获得其对应的基因序列。结合重叠延伸PCR(OE-PCR)原理设计用于全基因合成的核酸引物对CHIKV-E2全长基因(404 aa)进行体外合成,构建全长E2蛋白及其缺失突变体原核表达质粒,将序列正确的两种重组质粒分别转至E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组质粒的表达情况。结果 OE-PCR法成功合成了大小为1 212 bp的编码CHIKV-E2(1～404 aa)蛋白的全长基因,构建了全长E2蛋白及其缺失突变体重组表达质粒pET21b-E2(1～404)和pET21b-E2(1～350),经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE结果显示缺失突变体pET21b-E2(1～350)融合蛋白表达量较pET21b-E2(1～404)有明显提高。结论 E2蛋白跨膜疏水区(351～378 aa)对该蛋白的原核表达具有重要影响,缺失该疏水区的突变体在大肠杆菌中表达量比全长E2蛋白表达量明显提高。

胸腺素α1的基因合成、表达及活性测定

目的 合成胸腺素α1(Tα1)基因并在原核细胞中表达。方法 用半酶半化学合成并克隆Tα1基因 ,将该基因插入表达质粒pGEX 4T 1并在大肠杆菌进行表达 ,对表达的融合蛋白GST Tα1利用亲和层析法纯化 ,再经Thrombin酶切后 ,获得重组Tα1进行生物学活性检测。结果 经测序证实合成的Tα1序列与设计的一致。构建的重组表达载体pGEX 4T 1 Tα1在大肠杆菌中得到高效表达。E玫瑰花结形成试验证明重组Tα1具有生物学活性。结论 合成的Tα1基因在大肠杆菌中表达出具有生物活性的蛋白。

垂体腺苷酸环化酶激活肽基因合成表达和产物纯化与鉴定

为利用基因工程技术获得垂体腺苷酸环化酶激活肽 (pituitaryadenylatecyclaseactivatingpolypeptide ,PACAP) ,根据大肠杆菌的密码偏好性 ,设计并人工合成编码 38个氨基酸的PACAP基因 .克隆到表达载体pET 35b(+) ,构建重组质粒pET PACAP ,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)pLysS+ .实现纤维素结合域 (cellulosebindingdomain ,CBD)与PACAP融合蛋白的表达 ,并在两者之间引入 (凝血 )因子Ⅹa识别位点 (Ile Glu Gly Arg↓ ) .融合蛋白CBD PACAP经纤维素亲和层析纯化后 ,因子Ⅹa酶切释放PACAP .在因子Ⅹa识别位点前引入 7个氨基酸的柔性短肽 (Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly)明显提高了融合蛋白对因子Ⅹa的敏感性 .HPLC进一步纯化得到纯度大于 95 %PACAP多肽 .所得的PACAP多肽的Western印迹鉴定为阳性 ;激光飞行质谱测定分子量结果与理论值相符 .生物活性分析表明 ,所制备的PACAP具有促进胰腺癌细胞株SW 1

黑曲霉脂肪酶全基因合成及其在毕赤酵母中的表达

黑曲霉脂肪酶是重要的工业用酶,在食品、制药、前体化合物的合成和手性化合物的拆分等方面有广泛的用途。获得高效表达黑曲霉脂肪酶的基因工程菌是该酶工业化生产的前提。根据黑曲霉脂肪酶LIP的氨基酸序列及毕赤酵母密码子的偏爱性,设计合成26条相互重叠20 bp的引物,通过组装PCR分别合成lip基因的4个片段lipA1(300bp)l、ipA2(237 bp)l、ipA3(234 bp)和lipA4(210 bp)。再以基因头lip1和基因尾lip26为引物,以lipA1l、ipA2l、ipA3和lipA4混合物为模板进行第二轮PCR扩增,得到的产物经加A处理后,连接到载体pMD18-T上,挑取重组子测序。通过PCR扩增对人工合成的基因进行校正,得到完全正确的lip基因。将优化后的基因克隆到表达载体pPIC9K上,获得的重组质粒pPIC9K-lip经线性化后转化毕赤酵母GS115菌株,构建分泌型表达LIP的酵母工程菌,G418梯度筛选,得到高拷贝稳定整合菌株。为重组黑曲霉脂肪酶的规模化制备奠定了基础。

猪嗜血支原体ORF9的全基因合成及原核表达

为原核表达猪嗜血支原体(M.haemosuis)ORF9蛋白,本研究根据GenBank登录的AJ504999的ORF9基因序列,采用重叠延伸PCR技术(SOE-PCR),选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成4对寡核苷酸片段,人工合成ORF9基因。将其克隆于表达载体pET-32a中构建重组表达质粒pET-ORF9,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。经SDS-PAGE和western blot鉴定表明,重组蛋白的分子量约为34 ku。

小肽基因合成及其串联体表达载体的构建

以人表皮生长因子为研究对象,分3段合成了hegf基因片段,运用套叠PCR技术进行连接,形成全长hegf(159bp)并克隆到酵母表达载体pGAPZα-A中.利用同裂酶技术构建串联体表达载体,获得了分别含2、3、4拷贝的串联体表达载体pGAPZα-2hegf、pGAPZα-3hegf和pGAPZα-4hegf,为下一步进行基因表达及其生物学活性分析奠定了基础.

水蛭素的全基因合成及克隆

报道了水蛭素全基因的合成及克隆。根据已知水蛭素氨基酸序列及酵母菌体内蛋白质表达特性 ,设计了水蛭素的全基因序列 ,采用化学合成及酶学相结合的方法 ,合成了该基因片段 ,并逐段克隆至载体 pBS上 ,得到全长水蛭素基因。序列测定表明 ,克隆后DNA顺序同原设计序列。

一株全基因合成的高温嗜碱甘露聚糖酶的酶学性质分析

根据来源于褐色高温单孢菌(Thermomonospora fusca)YX基因组序列,预测并合成了甘露聚糖酶ManB全基因序列(Accession No.KJ806638),与表达载体pPIC9K重组后,转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,筛选获得重组菌株ManB-GS115。其酶学性质检测结果表明,该酶最适温度为70℃,最适pH为9.0。该甘露聚糖酶ManB在碱性高温环境下有较高的酶活力,可应用于食品、酿造、饲料、纺织和医药等工业领域。

牛肌酸激酶同功酶CK-BB的全基因合成及其原核表达

牛肌酸激酶是重要的能量代谢酶,尤其是在机体发生炎症时,会在局部存在特异性升高,具有潜在的疾病标志物作用。根据牛肌酸激酶同功酶CK-BB的氨基酸序列及大肠杆菌(BL21)密码子的偏爱性,设计合成54条互相重叠的引物,通过组装PCR分别合成CK-BB的6个片段CK-BB1、CK-BB2、CK-BB3、CK-BB4、CK-BB5和CK-BB6;再以基因头ck-1和基因尾ck-54为引物,以CK-BB1、CKBB2、CK-BB3、CK-BB4、CK-BB5和CK-BB6混合物为模板进行第2轮扩增;将得到的产物连接到p ET28b载体上,挑取重组子测序。通过PCR扩增对人工合成的基因进行校正,得到完全正确的CK-BB基因,为重组牛肌酸激酶同功酶CK-BB的规模化制备奠定了基础。

基因合成的奠基人——哈尔·戈宾德·科拉纳

1953年，沃森和克里克DNA双螺旋模型的提出标志着分子生物学的诞生，而1958年克里克提出中心法则，进一步阐述了DNA发挥信息载体功能的机制。DNA中的遗传信息需要转换为蛋白质中的结构信息才可实现生物学功能，这其中涉及到一个关键问题，即DNA（或RNA）中的碱基序列决定蛋白质中氨基酸序列的秘密，科学家将“碱基顺序决定氨基酸顺序”这一特性称为遗传密码。

心水病病原体高度保守基因合成与原核表达

通过软件DNAStar分析,设计合成心水病病原体抗原性、保守性比较高的一段基因,长度为564bp,将它插入pUC57载体,再转入pET-32a质粒中进行原核表达并纯化表达产物。结果表明,合成的基因在大肠杆菌中得到高效表达并能简易地提纯,纯化的表达产物有望用于心水病免疫学检测;此合成外来基因还可以作为心水病病原PCR检测的阳性对照。这些工作为我国建立心水病防控技术储备奠定了一些基础,也为防控高度危险性外来传染病提供一种安全和可行的研究新思路。

膜联蛋白A1基因合成及其真核表达载体的构建

目的探讨人膜联蛋白A1(ANXA1)基因的合成并构建其克隆载体。方法根据ANXA1基因序列设计一对寡聚核苷酸引物,通过PCR反应合成一段长度为870bp的ANXA1基因。真核表达载体pEGFP-N3经KpnⅠ&BamHⅠ限制性内切酶双酶切处理后与合成的ANXA1基因进行连接,连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞进行扩增,并提取质粒进行鉴定。结果 PCR扩增获得ANXA1基因,对PCR产物及重组质粒酶切后的凝胶电泳鉴定证实为与理论设计目的片段大小(870bp)相符的DNA基因片段,并成功地转入克隆载体pEGFP-N3中。测序分析显示合成的目的基因与GenBank中ANXA1基因序列同源性为99%,整个表达载体阅读框正确无误。结论成功构建了ANXA1基因pEGFP-N3表达载体,为下一步高效表达ANXA1蛋白和进一步研究其作用机理及应用价值打下基础。

利用PCR扩增及基因合成构建Adnectin半随机核糖体展示文库

目的构建Adnectin半随机的核糖体(mRNA)展示文库。方法分析Adnectin核糖体展示文库结构序列的编码氨基酸序列,利用无意突变建立酶切位点,使用PCR扩增和基因合成两种方法相结合,构建Adnectin半随机核糖体展示文库,通过限制性内切酶及DNA测序证实序列正确性,对文库转化菌的滴定和插入失活蓝白菌斑筛查和计数测定计算文库的库容。结果经测序证实文库结构的正确性,文库的库容为1.54×1013/m L。结论成功构建Adnectin半随机的核糖体展示文库,方法简单,库容量大,该文库的建成为亲和各种相关蛋白的Adnectin结合序列奠定基础。

基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成中多位点缺失突变的校正方法

目的:建立一种PCR方法,以快速校正基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的多位点缺失突变。方法:用PCR方法合成基孔肯雅病毒非结构蛋白基因;对测序的克隆进行序列比对,分析不同克隆上缺失突变发生的位置,以保守区域互相重叠的寡核苷酸为上下游引物、以该区域测序正确的克隆为模板进行PCR扩增,得到所需片段,再将这些片段用PCR方法进一步组装成完整的基因序列并进行测序。结果:测序结果表明,经过2次PCR扩增,校正了基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的5个位点缺失突变。结论:得到序列正确的基孔肯雅病毒非结构蛋白基因。在进行基因合成过程中如发生多位点缺失突变,可利用该方法同时对以上突变进行校正,无须再合成引物,降低了实验操作难度,并提高了实验效率。