提高小麦基因枪法转化频率的研究

用基因枪法将带Bar－GUS双标记基因的质粒（pAHC25）转入普通春小麦品种中─60634的幼胚盾片，并获转基因植株。在轰击的经预培养3～4天的342块幼胚盾片再经筛选再生的植株中，经PCR和Southern分析表明，外源基因已稳定整合到小麦基因组中，转化率为0．88％。此外发现，幼胚培养基中用2mg／Ldicamba代替2mg／L2，4－D，可提高愈伤组织的再生能力。同时，为了保持小麦幼胚愈伤组织的分化能力，在诱导愈伤组织阶段5mg／Lbialaphos的筛选时间以不超过1个月为宜，及早转入3mg／Lbialaphos分化及壮苗培养基筛选转基因植株。

水稻基因枪法多基因转化研究

为探索多基因转化系统,利用基因枪法进行水稻3个质粒的共转化研究,结果从25个转基因植株中获得3个三转化植株N12、K4-39和K1-1-66,成功地将分别位于不同质粒载体上的GUS,hpt和RTBV CP基因同时导入到水稻中。3个三转化植株中N12、K4-39正常可育。对N12的后代遗传分析表明,该转基因植株中3个载体所携外源基因均呈孟德尔式分离(3:1),3个外源基因分别整合到水稻的两条染色体上。GUS基因与hpt连锁,RTBV CP位于另一条染色体上。

基因枪法转化籼稻胚性愈伤组织获得可育的转基因植株

以籼稻胚性愈伤组织作为基因枪法转化的靶材料，建立了可重复的、高效的籼稻转化系统。从籼稻成熟胚诱寻生长3～4周的愈伤组织，经过2～6周继代培养后，可以形成足够量的颗粒状胚性意伤组织。用含有bar基因B.t.δ-内毒素基因的质粒pFWZ16轰击转化胚性愈伤组织，在含2～4mg／LBasta的培养基上进行筛选、预再生、再生及长根培养，并通过干燥处理增加再生频率和出苗数。从接种到获得转化小植株只需要4～5个月。供试的两个品种为华南地区推广的优良籼稻品种，共轰击821块胚性愈伤组织，获得48个系的477株Basta抗性植株。经PCR扩增分析和Southernblot杂交分析证实外源的bar基因和B.t.基因己整合到转基因水稻植株基因组中，Basta抗性鉴定和PNA点杂交分析表明这两个基因在转基因植株中得到表达。87.5％的转基因植株可育。Basta喷施实验和Southernblot分析证明bar基因和B.t.基因已遗传至子代，并且主要按孟德尔规律进行分离。

基因枪法向小麦导入几丁质酶基因的研究

利用基因枪法,以菜豆几丁质酶基因转化小麦幼胚愈伤组织。在轰击压力1300psi,轰击距离6cm、100μg金粉/枪和轰击距离9cm、150μg金粉/枪的2种处理条件下,获得4株春小麦东农7742转化植株,转化频率分别为0.36%和0.56%。经PCR和PCR-Southern杂交分析,证实菜豆几丁质酶基因已整合到T0和T1小麦基因组中。采用氨基葡萄糖法测定几丁质酶活力,结果表明,转基因小麦的几丁质酶活力明显高于对照株;转基因植株对白粉病症状减缓,并获得一株赤霉菌接种未扩展的转基因T1植株。

基因枪法转化小麦及转基因植株的获得

应用基因枪法转化了小麦幼胚、成熟胚及胚性愈伤组织,成功地将携带有豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因以及选择标记潮霉素磷酸转移酶(Hpt)基因的质粒pBCAHpt导入小麦胚性愈伤组织。通过在选择培养基上严格筛选后获得潮霉素抗性(hygr)愈伤组织,并进一步分化培养获得完整的小麦再生植株。PCR检测结果显示抗性愈伤组织和再生植株细胞内存在有目的基因序列。

应用基因枪法获得抗大麦黄矮病毒转基因小麦

以我国特有的大麦黄矮病毒 GPV株系的外壳蛋白 ( CP)基因为材料 ,设计合成了分别含有 Act启动子或 Emu启动子的植物表达载体 p PPI2、p PPI3和 p PPI5。采用基因枪法分别转化小麦幼胚和愈伤组织。诱导成苗后进行 PCR检测 ,T0 代阳性率为 18%。对转基因苗的后代进行进一步检测 ,部分转基因苗阳性株至 T3代 PCR检测阳性率为 10 0 % ,PCR结果 CP探针杂交呈阳性反应 ,序列测定结果与 GPV CP基因序列一致 ,表明 GPV CP基因已整合到小麦基因组中。室内抗病性鉴定结果 ,虽然转基因植株全部发病 ,但对大麦黄矮病毒 GPV株系具有一定的延迟发病作用。

基因枪法转化水稻(Oryza sativaL.)获得可育的转抗虫基因水稻再生植株

应用基因枪 ( particlebombardment)转化技术成功地将豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpeatrypsininhibitor,CpTI)基因分别导入三个水稻粳稻栽培品种 (OryzasativaL .,japonica)中花 8、中花 10和中作 32 1的幼胚和胚性愈伤组织中 ,并由此获得了可育的再生植株 ,抗性植株的筛选频率为 6.1%～ 12 .2 4 %。经PCR、Southernblot分子检测和ELISA检测等证实所获得的潮霉素抗性植株为转基因植株。抗虫性分析结果表明 ,部分转基因水稻植株对玉米螟虫 (Ostrinianubilalis)

用基因枪法将Bt杀虫基因导入玉米自交系的研究

利用PDS1000/氦气基因枪将人工合成的Bt基因导入玉米自交系340,8902,吉853,Mo17等的愈伤组织,在含有除草剂Basta2～5mg/L的培养基上筛选与分化。经3轮的除草剂筛选获得1840块抗性愈伤组织,再生860个植株。Southernblot分析证明,3个植株中整合有Bt基因。

基因枪法转化马铃薯及转基因植株的获得

应用基因枪法将携带有FMDVP1全长基因的质粒pBI1 3 1SP1导入马铃薯茎段 ,通过在抗性培养基上严格筛选 ,获得了马铃薯再生植株。PCR检测及PCR -Southern杂交分析表明 ,已成功地将目的基因导入马铃薯基因组中。

大豆成熟种子胚尖基因枪法转化体系的优化

以山东省主栽大豆品种"荷豆12"成熟种子胚尖为材料,探讨了6-BA和潮霉素浓度等因素对基因枪法遗传转化的影响,并通过报道基因GUS检测了外源基因的表达和整合情况。结果表明:经5 mg.L-16-BA诱导16 h,"荷豆12"胚尖的再生丛生芽数目、丛生芽的伸长速率等综合指标最佳;5～15 mg.L-1的潮霉素多步梯度筛选可以提高转化筛选效率。基因枪转化后的胚尖组织和转基因植株后代的叶片中均可以观察到GUS基因的表达;通过分子鉴定证明外源GUS基因插入到转基因后代的基因组中。

基因枪法获得转基因小麦植株

利用适用于禾谷类作物的表达载体 pGU4ABBar,采用基因枪法 ,将人工合成的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cryIa导入小麦品种扬麦 15 8,经PCR和Southernblot鉴定 ,证明获得 4株导入cryIa基因的小麦转基因植株 ,转化率约为 0 .7% ,并通过Westernblot鉴定检测到了目的蛋白的表达。

基因枪法获得优质HMW亚基基因表达的转基因小麦

为探讨利用基因工程技术进行小麦品质改良的可行性,用基因枪法对湖北省3个小麦品种鄂恩1号、鄂麦11号和鄂麦12号分别进行优质高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)基因1Ax1和1Dx5+1Dy10的转导。试验结果表明,经基因枪轰击的幼胚外植体的再生频率和转化频率明显比幼穗高;基因型间愈伤组织再生能力和转化频率的差异,直接影响着小麦转化的成功率;3个品种的幼胚发育时期与其再生频率均呈显著负相关(r=-0.93或-0.95);在可控环境条件下,花后12～14d的供试植株幼胚的转化频率最高(鄂恩1号、鄂麦11号和鄂麦12号分别为4.5%、2.9%和2%)。研究表明,鄂恩1号、鄂麦11号适龄期的幼胚试材,用等摩尔比的优势亚基基因1Dx5和1Dy10与选择标记基因以2:1摩尔比混合的沉淀物包裹金粉,经600～900psi氦气压轰击后,在含0.5mg·L-12,4-D的MS培养基中诱导愈伤、含0.1mg·L-12,4-D和5mg·L-1玉米素的R培养基中分化、3mg·L-1L-PPT选择压下继代分化筛选,可获得稳定可育的T0代转基因植株以及胚乳特异性表达的T1代转基因种子。

基因枪法转化香蕉薄片外植体的参数优化

采用果用香蕉（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）的薄片外植体作为转化受体；通过对ＧＵＳ基因瞬间表 达的研究，找出了较适合的轰击条件和外植体培养条件．研究表明，高渗处理对转化的影响 较大，轰击前后对外植体进行高渗处理的瞬间表达率（１４．１１％）是对照（３．６８％）的３．８６ 倍。预培养外植体转化的瞬间表达率（１７．５％～４２．１１％）普遍高于没有预培养的外植体 （１２．２０％），并以预培养６ｄ为好．最适压力和射程分别为７．５８４ ＭＰａ，９ｃｍ．ＤＮＡ沉淀剂的组成以ＣａＣｌ_２和亚精胺同时存在较佳、对不同ｐＨ（５．０，１０．０）下的Ｃａ ＮＯ_３）_２或ＣａＣｌ_２对瞬间表 达率的影响进行研究发现正常ｐＨ（５．０）的ＣａＣｌ_２优于其他组合．利用最佳条件组合，瞬间表达率可达４８．７２％，初步建立了果用香蕉薄片培养的转化体系。

利用基因枪法将玉米矮花叶病毒外壳蛋白基因导入玉米优良自交系

利用基因枪法将玉米矮花叶病毒外壳蛋白基因导入玉米优良自交系18-599红、18-599白幼胚诱导的愈伤组织,转化的愈伤组织在Bialaphos浓度为8mg/L、10mgL、5mg/L的筛选压下经过三次抗性筛选后,分别再生出可育植株12株和6株。PCR检测结果表明18-599红和18-599白分别有10株和3株为阳性,说明CP基因已导入到玉米自交系中。

利用基因枪法将Bt基因导入玉米优良自交系

利用基因枪法将Bt基因导入玉米优良自交系501和C111。轰击后的幼胚转至附加Bialaphos浓度为10mg/L的选择培养基上进行愈伤组织的诱导,继代筛选3轮,每轮3周。得到的抗性愈伤组织在不含Bialaphos的分化培养基上进行绿苗分化,501获得了20株转化再生植株,C111获得了10株转化再生植株,PCR鉴定结果表明Bt基因已整合到玉米自交系501和C111的基因组中。

基因枪法转化水稻E32后代非目标农艺性状变异的研究

采用基因枪法将4个抗真菌性病害基因(RAC22、RCH10、β-1,3-Glu和B-Rip)导入超级稻(Oryza sativa L.)恢复系E32中,经选择获得10个T4代转基因株系。分蘖盛期纹枯病抗性鉴定表明外源基因已在转基因株系中得到表达并获得抗性,这些转基因株系除了产生抗病性等目标性状的变异外,还发生生育期、植株形态、谷粒外观及产量性状等非目标农艺性状变异。对这些非目标性状进行遗传增益和稳定性分析表明,不同转化株系间或性状间的遗传增益均存在较大差异,其中遗传增益最高的性状是单株穗数、着粒密度和单株产量;各性状中以株高、穗长和谷粒外观性状的变异程度最低,单株穗数和千粒重的变异系数最大。通过选择可获得产量与品质性状均有提高的转基因水稻。

基因枪法在水稻工程育种中的应用

至今 ,基因枪法以其实用性和有效性应用于水稻工程育种已有十几年。本文阐述了其在水稻工程育种的六个主要领域的应用现状 ,同时评价了外源基因在转基因水稻中的稳定性和对转基因水稻主要农艺性状的影响。当然 ,基因枪法的转化效率还有待提高 ,随着转不同基因的工程水稻的日益增多 ,进一步的安全性试验显得十分必要 ,它是转基因水稻商品化的前提。

蔗糖在小麦基因枪法转化体系中的应用

构建植物表达载体并利用该载体与含有选择压力基因的载体对小麦幼胚愈伤组织进行共转化。比较分析了高渗透压处理阶段使用0.4 mol/L的蔗糖（合12％）代替甘露醇及恢复培养阶段使用过渡浓度的蔗糖（6％,介于高渗透压培养基中蔗糖的浓度12％和分化培养基中蔗糖的浓度3％之间）对分化率和转化效率的影响。结果表明,在采用基因枪轰击法叶小麦幼胚愈伤组织进行转化的体系中,以蔗糖代替甘露醇进行高渗透压处理,进而使用含有较高浓度蔗糖的培养基进行恢复培养的方法简便有效,可以促进分化能力提高,转化效率可达2.1％。

影响基因枪法遗传转化的因素

通过对影响基因枪法遗传转化的因素探讨 ,以期对提高基因枪法的转化效率提供参考。

基因枪法导入Bar基因转化春小麦幼胚的研究——影响转化的主要因素

利用基因枪法将抗除草剂 Bar基因导入春小麦东农 774 2 ,IE4 7和辽 10。在本试验条件下以培养 2 0～ 2 2 d的幼胚为受体 ,在 80 ︼g·枪金粉量和 6 cm的轰击距离下的基因枪转化效果最佳。