基于16S rRNA基因测序技术分析急性肝内胆汁淤积大鼠的肠道菌群

目的 探讨ANIT诱导的大鼠急性肝内胆汁淤积(acute intrahepatic cholestasis,AIC)与肠道菌群的关系。方法 以SPF级的SD大鼠为实验对象,随机分为正常对照组、模型组,每组24只,依据取材时间不同又将各组随机分为24 h、48 h、72 h 3个亚组,每组8只。模型组通过一次性予2%ANIT按100 mg·kg^(-1)·d^(-1)灌胃造模诱发AIC模型,正常对照组予等容积色拉油灌胃。通过高通量测序法对肠道粪便细菌16S rRNA的V_(3)~V_(4)区进行基因测序及生物信息学分析。结果 AIC造模后,随着时间增加,α多样性指数逐步升高,造模72 h组相比造模24 h组,Shannon指数有显著性差异;β多样性发现,利用基于加权Unifrac距离PcoA分析或NMDS分析均显示:正常对照组、造模24 h组和造模48 h组的肠道菌群显示比较明显的聚集效应;在门水平上,厚壁菌门(Firmicutes)丰度在造模48 h后显著下降,变形菌门(Proteobacteria)的丰度显著上升,拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰度显著上升;LEfSe对组间差异显著的物种分析结果显示,LDA值大于4的微生物类群有35个。结论 模型组干预后大鼠肠道菌群结构和多样性均发生显著变化。

基于16S rRNA基因测序技术分析原发性胆汁性胆管炎伴抑郁小鼠粪便样本中肠道菌群的变化

背景:肠道菌群失调或紊乱与脑和肝脏疾病之间存在联系,肠道菌群可能通过肠⁃肝⁃脑轴影响原发性胆汁性胆管炎(PBC)和抑郁的发生和发展。目的:应用16S rRNA基因测序技术分析PBC伴抑郁小鼠的肠道菌群情况。方法:将12只雌性小鼠随机分为对照组、胆汁淤积组、胆汁淤积+抑郁组和治疗组。对照组小鼠给予正常饲料和水喂养;胆汁淤积组小鼠采用含0.1%DDC的饲料连续喂养2周构建胆汁淤积模型;胆汁淤积+抑郁组小鼠先采用慢性温和不可预期应激方式刺激2周,再以含0.1%DDC的饲料喂养2周构建胆汁淤积+抑郁模型;治疗组小鼠在构建胆汁淤积+抑郁模型的基础上,腹腔注射盐酸氯米帕明(7.5 mg·kg^(-1)·d^(-1))2周。造模期间观察小鼠的行为学变化。造模结束后各组小鼠称重,行负重游泳试验、强迫游泳试验、悬尾试验和肝组织HE染色;采集新鲜粪便,基于16S rRNA基因测序技术分析小鼠肠道菌群的变化。结果:与对照组相比,胆汁淤积组和胆汁淤积+抑郁组小鼠体质量明显减轻(P<0.05),抑郁样行为明显加重(P<0.05);与胆汁淤积+抑郁组相比,治疗组小鼠体质量明显升高(P<0.05),抑郁样行为明显减轻(P<0.05)。胆汁淤积组、胆汁淤积+抑郁组和治疗组小鼠肝组织出现不同程度的胆汁淤积性损伤;与胆汁淤积+抑郁组相比,治疗组肝脏病理损伤明显减轻。小鼠粪便样本经测序抽平处理后获得个5491个操作分类单元(OTU),4组共有的OTU为162个。对照组与胆汁淤积组、胆汁淤积+抑郁组和治疗组小鼠粪便中微生物多样性和群落组成存在较大差异。在门水平上,胆汁淤积组厚壁菌门(Firmicutes)丰度明显升高;胆汁淤积+抑郁组变形菌门(Proteobacteria)丰度明显升高;治疗组厚壁菌门和变形菌门丰度均明显升高,拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度明显下降。对组间差异显著的物种行LEfSe分析发现,LDA值>4的微生物类群有38个。结论:PBC伴抑郁小鼠的肠道菌群结构和多样性均发生显著变化,抗抑郁治疗能改善肠道菌群的丰度和多样性,通过调节肠道菌群治疗PBC伴抑郁有可能成为一种新的治疗策略。

全基因测序技术在宫颈癌诊断中的应用效果

目的探讨全基因测序技术在宫颈癌诊断中的应用效果。方法将200例宫颈病变患者分为模型组62例和验证组138例。所有患者均接受宫颈细胞的全基因组序列分析,基于染色体拷贝数变异的分析结果构建C-Score模型,使用验证组的数据对构建的C-Score模型进行验证,评估其在实际应用中的有效性和准确性。结果宫颈癌患者宫颈脱落细胞及肿瘤组织的染色体测序结果显示,染色体拷贝数不断变化,且肿瘤细胞与宫颈脱落细胞染色体拷贝数的变异表现出一致性。通过对模型组宫颈鳞状细胞癌样本的检测发现,第3条、第5条、第11条染色体上存在最多的拷贝数变异,根据该拷贝数变异,可以成功建立C-Score模型。验证组构建的C-Score模型诊断宫颈癌的灵敏度为94.1%,特异度为96.8%,曲线下面积为0.94。所有患者构建的C-Score模型诊断宫颈癌的灵敏度提高到了97.2%,特异度提高到了97.4%,曲线下面积提高到了0.98。结论基于全基因测序技术的宫颈癌诊断方法具有较高的准确性和可行性,可以为临床提供更有效的诊断手段。

基于基因测序技术分析乳腺癌中微生物菌群的研究进展

乳腺癌中存在独特的细菌群落,与正常乳腺组织、乳腺良性疾病以及癌旁组织在数量和多样性上均存在显著差异。乳腺癌不同分子分型、病理分级和分期之间的菌群结构也不同,这表明微生物菌群可能在乳腺癌的发生、发展及治疗中发挥重要的作用。然而,受种族和地域差异、样本量、测序深度等方面的影响,目前的研究结果存在差异,且缺乏系统性的综述。因此,文章通过总结乳腺癌微生物菌群测序的最新研究进展,系统分析了乳腺癌组织与非癌组织、乳腺癌不同分子分型、病理分级和分期之间微生物的组成差异,并对微生物菌群在乳腺癌诊断及治疗中的作用进行展望和讨论,以期为基于微生物菌群的乳腺癌诊断及治疗提供全新视角。

基因测序技术在中药质量研究中的应用(Ⅰ)——山东郓城猴头半夏基原的DNA测序鉴别

目的:分析半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.及其伪品虎掌南星Pinellia pedatisecta Schott的核基因组序列,为半夏正品基原鉴别提供分子依据。方法:采用PCR直接测序技术测定半夏及其伪品的18S rRNA基因核苷酸序列并作序列变异和选择性内切酶谱（PCR-SR）分析。结果:半夏和伪品的18SrRNA序列;天度均为 1805bp,根据排序比较,半夏原植物与商品药材间的序列完全相同,虎掌南星亦如此。而半夏与其伪品虎掌南星间则存在序列差异（有4个变异位点）。在半夏18S rRNA序列中有一个限制性内切酶Ase识别位点,通过PCR-SR图谱显示800bp和900bp2个酶切片断,而虎掌南星则无此位点,PCR-SR图谱显示1个未消化的1800bp片断;;结论:通过核基因组序列和PCR-SR图谱差异,DNA测序技术可成为半夏正品某原鉴别准确而有效的分子方法。

新一代基因测序技术及其在肿瘤研究中的应用

基因测序技术的进步,为分子生物学的发展,起到了巨大的推动作用。传统的基因测序技术的重要代表,是所谓的Sanger测序法,这是一种以末端终止法为原理建立起来的技术[1]。20世纪90年代开始启动的人类基因组计划,

基因芯片检测技术与基因测序技术在遗传性耳聋产前诊断中的联合应用

耳聋是最常见的出生缺陷之一。60%的先天性耳聋伴有一定程度的遗传性因素。利用常规听力物理筛查手段并不能够解决日益增多的迟发性、渐进性和药物敏感性耳聋的诊断及干预治疗。基因检测技术能够准确定位致病基因突变位点,了解疾病形成机理,有针对性地干预治疗和预防疾病发生。对于中国人群耳聋致病基因特异性研究表明,GJB2、GJB3、SLC26A4（PDS）、12s rRNA是主要的耳聋致病基因。本研究在遗传性耳聋产前诊断中联合应用基因芯片检测技术与基因测序技术，现将结果报告如下。

新一代基因测序技术在肿瘤研究中的应用及发展前景

随着分子生物学的发展及科学技术的进步,基因测序技术亦取得飞速发展。与传统基因测序相比,新一代基因测序具有高通量、低成本等特点。新一代基因测序技术的发展和广泛应用,为肿瘤的分子生物学研究提供新的有效途径。而新一代基因测序技术的广泛应用,可能为肿瘤研究提供更先进的诊断方法和更有效的治疗手段。

基因测序技术的发展与临床应用概述

基因检测技术是近年来伴随"精准医疗"概念的提出而迅速发展起来的一门科学技术,它可以从基因组机制上阐释遗传学、发育生物学、进化生物学等学科的经典概念,在全基因组水平延伸了染色体高级构象、细胞异质性、功能模块等新概念,为精准医学开辟了应用性新领域。

下一代基因测序技术新进展

基因测序技术已发展至第四代,其中第二代、第三代和第四代测序技术统称为下一代测序(NGS)技术。基因测序原理也相应地经历了Sanger测序法,边合成边测序、单分子测序和纳米孔测序。NGS技术因为通量提高、成本降低和测序周期缩短的优势已被广泛应用于基因组学、转录组学、宏基因组学和表观组学等方面。本文就NGS技术的基本原理和应用特点进行综述。

基因测序技术及其在肺癌中的应用

基因测序技术是描绘基因组特征的有力工具,可有效检测出导致肿瘤发生、发展的基因突变,在肿瘤发病机制研究、药物治疗靶点筛查、临床诊疗及疾病预防等方面发挥重要作用。肺癌是一种发病率和死亡率极高、预后极差的恶性肿瘤,目前临床存在早期诊断困难、治疗效果不佳等问题。随着新一代基因测序技术的发展,测序时间缩短、费用降低,基因测序技术已成为研究肿瘤致病基因的重要方法。利用基因测序技术筛选肺癌的致病基因,研究肺癌的发病机制,进而指导肺癌的诊疗,可有望改进肺癌的诊疗现状。近年来,关于肺癌基因组测序方面的研究取得了巨大进展,本文就基因测序技术及其在肺癌中的应用作一综述。

联用多重连接酶依赖探针扩增技术和基因测序技术检测地中海贫血基因缺陷

目的联用多重连接酶依赖探针扩增技术(MLPA)和基因测序技术,对地中海贫血病患者进行基因诊断。方法回顾性分析2011年10月-2013年2月来深圳市坪山新区人民医院就诊的地中海贫血病患者110例,先对他们进行基因检测,再对他们进行MLPA技术。结果通过基因检测,α1型地中海贫血病21例,α2型地中海贫血病27例,β型地中海贫血病62例。在62例β型地中海贫血病患者中,21例(33.9%)合并α型地中海贫血病双重杂合子,41例(66.1%)是41～42杂合基因型。通过MLPA检测,又发现16例(14.55%)α型地贫缺失型。结论发现运用基因测序技术能检测到大部分的地中海贫血病,再联用多重连接酶依赖探针扩增技术能更准确的检测到全部地中海贫血病,所以联用多重连接酶依赖探针扩增技术和基因测序技术是检测地中海贫血病有效的方法,为以后的临床检测提供了依据。

基于16S rRNA基因测序技术分析非酒精性脂肪性肝病大鼠的肠道菌群

目的 基于16S rRNA基因测序技术分析非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)大鼠的肠道菌群。方法 以SPF级SD大鼠为实验对象,随机分为普通饮食组(对照组)和高脂饮食组(模型组)。高脂饮食组通过进食高脂饲料8周诱发NAFLD模型。8周后检测大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、甘油三酯(triglyceride,TG)和总胆固醇(total cholesterol,TC)水平,取肝组织进行HE及油红O染色,采集大鼠新鲜粪便通过高通量测序法对肠道粪便细菌16S rRNA的V3-V4区进行基因测序。利用UPARSE软件进行类单元(operational taxonomic unit,OTU)聚类,采用RDP Classifier算法对OTU代表序列进行比对分析,并在门、纲、目、科、属、种等水平上进行注释其群落的物种信息。基于OTU聚类结果,利用mothur软件和Qimme(V.1.8)进行Alpha多样性分析和Beta多样性分析,并通过LEfSe软件进行组间菌落差异分析。结果 与正常组相比,模型组大鼠AST [(23.63±4.82)U/L vs (10.61±1.17)U/L]、ALT [(9.98±2.27)U/L vs(3.40±0.81)U/L]、LDL-C [(0.69±0.11)mmol/Lvs(0.34±0.10)mmol/L]、TG [(0.90±0.24)mmol/L vs (0.33±0.13)mmol/L]及TC [(5.69±0.72)mmol/L vs(2.10±0.42)mmol/L]水平均显著升高,HDL-C [(0.62±0.14)mmol/L vs (1.07±0.17)mmol/L]水平显著降低,差异均有统计学意义(P均<0.05)。两组共获得2607个OTU,经过抽平处理后获得2547个OTU,其中对照组2367个,模型组2168个,两组共享OTU为1988个。随样本量增加物种累积曲线趋于平缓,表明样本量充分。在Alpha多样性指数中,模型组的香农指数(7.0673±0.4812 vs 6.1695±0.7165)、物种个数[(968.6250±233.0221)个vs (1155.9500±129.0011)个]和PD_Whole_Tree指数(69.3449±14.2872vs82.0219±10.2012)显著低于对照组,差异有统计学意义(P均<0.05),Chao1指数也低于对照组(1418.4503±277.8639 vs 1599.1725±100.1048),但差异无统计学意义(P>0.05)。采用主成分分析、主坐标分析、层次聚类分析、偏最小二乘法判别分析和非度量多维尺度法等Beta多样性分析方法均能将模型组与对照组大鼠完全区分开来,进一步说明二者间的菌群有明显区别。采用RDP Classifier算法对OTU代表序列进行比对分析,结果表明,从门水平分析,NAFLD大鼠厚壁菌门和放线菌门丰度增加,其中放线菌门丰度显著增加,拟杆菌门和变形菌门的丰度降低。从纲水平分析,NAFLD大鼠放线菌纲和丹毒丝菌纲相对丰度显著升高,而杆菌纲相对丰度显著下降。从目水平分析,NAFLD大鼠红椿菌目和丹毒丝菌目相对丰度显著升高,而乳杆菌目和酸微菌目相对丰度显著降低。从科水平分析,NAFLD大鼠毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcus)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)和双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)等增加,其中双歧杆菌科、肽链球菌科显著增加,乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)和拟杆菌目S24-7组比例下降,其中乳酸杆菌科显著性减少。采用LEfSe对组间差异显著的物种分析,结果表明两组间差异起重要作用的肠道微生物类群共126个,LDA值大于3.6的微生物类群共24个。结论与普通饮食组相比,高脂饮食组干预8周后大鼠肠道菌群结构和多样性均发生显著变化。

应用高通化基因测序技术研究稽留流产胚胎染色体异常的临床实用价值

目的分析应用高通量基因测序技术研究稽留流产胚胎染色体异常的临床实用价值。方法对54例稽留流产者行清宫术,应用高通量基因测序技术绒毛组织染色体检测,分析染色体异常情况。结果 54例患者经检测出染色体异常标本36例,中有31例染色体数目异常,26例三体型性染色体数目异常3例,45X 2例。结论对稽留流产胚胎染色体异常采取高通量基因测序技术,准确性高,利于孕妇再次妊娠。

高通量基因测序技术在自然流产胎儿绒毛染色体的核型分析

目的探讨自然妊娠与辅助生殖助孕(ART)流产组织胎儿绒毛染色体异常情况。方法采用高通量测序技术对364例流产组织进行染色体核型分析,并根据染色体非显带核型对三体核型进行分组,将其分为A、B、C、D、E、F、G 7组。结果 (1)绒毛染色体总异常发生率为48.90%(178/364),自然妊娠组绒毛染色体异常发生率显著高于ART组(52.85%vs 40.68%)(P=0.033);异常核型以三体型最多见,占65.17%,染色体微缺失/微重复次之,占15.73%;(2)ART组<35岁与≥35岁胚停组织绒毛染色体异常发生率差异无统计学意义,自然妊娠组两者间差异有统计学意义(P=0.005);(3)流产组织中女性胚胎异常核型占总异常核型的46.89%,男性胚胎占53.11%,两者差异有统计学意义(P=0.007);(4)ART组以复发性流产最常见,占60.00%;(5)自然流产组织中胚胎异常核型主要分布于E组和G组,男胚A组异常核型显著多于女胚(P=0.007)。结论高通量测序在自然流产绒毛组织染色体核型分析中有较高的应用价值,有助于判断早期流产的遗传学病因,为再次妊娠遗传学咨询提供服务。

半导体基因测序技术筛查地中海贫血的临床应用价值

目的:探讨半导体基因测序技术在地中海贫血基因筛查中的应用价值。方法:采集随机就诊者的静脉血197例作为前瞻性样本;随机选择临床确诊样本200例作为既往样本。同时采用半导体基因测序技术和PCR技术进行检测与分析,比较两种检测方法结果的差异。结果:前瞻性样本中,PCR技术检出地中海贫血基因突变共22例,其中α-突变18例,β-突变3例,α合并β-突变1例;采用半导体基因测序技术除检出以上基因位点外,另发现罕见型地中海贫血6例。既往样本共200例,其中α-突变118例,β-突变65例,α合并β-突变17例,采用半导体基因测序技术另发现突变位点1例。统计分析结果显示,PCR技术与半导体基因测序技术总符合率为98.5%,Kappa=0.97(≥0.8)。结论:半导体基因测序技术不仅能够覆盖PCR技术能检测到的所有位点,而且可检测到地中海贫血的罕见基因突变位点,且检测成本低,仪器价格低廉,有利于地中海贫血的普查。

基于16SrRNA基因测序技术研究低聚异麦芽糖对奶牛瘤胃细菌菌群的影响

【目的】本试验旨在利用16SrRNA基因测序技术研究低聚异麦芽糖对奶牛瘤胃菌群的影响。【方法】试验采用两阶段交叉设计方法,将4头泌乳中国荷斯坦泌乳奶牛随机分为两组,第一阶试验结束,经过恢复期后,再将试验组和对照组交叉,由之前对照组变为试验组。试验组添加60 g/(d·头)的低聚异麦芽糖。【结果】结果表明日粮添加低聚异麦芽糖后,奶牛瘤胃细菌菌群多样性无显著影响。门水平上分析,疣微菌门丰度显著增加(P<0.05)。属水平上分析,饲喂低聚异麦芽糖,奶牛瘤胃液Comamonadaceae_NA(未注释丛毛单胞菌属)丰度极显著提高(P<0.01),WCHB1-25_NA丰度极显著增加(P<0.01),Ruminobacte(瘤胃杆菌属)丰度显著增加(P<0.05),Salinibacterium(盐细菌属)丰度显著增加(P<0.05),Lactobacillus(乳酸杆菌属)丰度显著降低(P<0.05)。Acidaminococcus(氨基酸球菌属)、Aeromicrobium(气微菌属)、Actinotalea、Adlercreutzia菌属丰度有增加趋势(0.05<P<0.1),TMEG_NA菌属丰度有降低的趋势(0.05<P<0.1)。【结论】在本试验条件下,日粮添加低聚异麦芽糖对奶牛瘤胃菌群多样性无显著影响,纤维分解菌丰度影响差异不显著,淀粉分解菌丰度增加、乳酸生成菌丰度降低。

基因测序技术在临床检验领域的应用及国内外监管现状比较研究

基因测序技术是现代分子生物学研究中最常用的技术,从1977年第一代测序技术的出现,经过四十多年的发展,基因测序技术取得了重大进展,尤其以高通量为特点的第二代测序技术正在逐步应用于临床检测中。本文介绍了基因测序技术的发展及国内外第二代测序技术在临床应用中的监管制度和监管建议。

MLPA与基因测序技术检测联用检测地中海贫血基因缺陷分析

目的对深圳地区地中海贫血(简称:地贫)人群及正常人群进行HBA、HBB基因突变的筛查,旨在提高地贫基因确诊率,发现传统基因诊断技术易漏检的地贫相关基因突变类型。方法选取2009年4月～2010年10月送检本实验室疑似地中海贫血基因缺陷血样100例,采用MLPA技术和基因测序技术联合检测。结果 (1)成功检测出β合并α地贫双重杂合子;(2)β地贫中,41-42杂合子基因型占53.57%,β合并α地贫双重杂合子,占28.6%,α1地贫中一SEA/αα基因型占96.9%;(3)α2地贫以αcs/αα、α3.7/αα和αWS/αα基因型居多;(4)进一步经MLPA检测后另发现α地贫缺失型及β地贫β基因缺失型占12%。结论联合应用MLPA技术、PCR技术和基因测序技术,可以提高地中海贫血基因缺陷检测的准确率,为本病家系成员的遗传咨询和产前基因诊断提供准确的依据。

简化基因测序技术在植物检材个体认定中应用初探

目的在涉及中草药真假辨识及个体识别的案件中很大比例的植物类物证都无法用形态学检验方法来鉴别,而植物DNA测序分析技术为我们提供了一种强有力的手段。方法通过对18个桂花植物样品进行DNA建库和高通量测序、序列多态性分析,评估其遗传多样性,并用基于单核苷酸多态性分析方法探讨了简化基因测序技术用于个体识别的案例。结果未知植物物证样品A与桂花1的匹配度最高,未知植物物证样品B与桂花4匹配度最高,未知植物物证样品B与桂花11的匹配度最高,该方法能成功识别3个盲测样品。