猪肥胖基因(ob)部分序列的克隆与多态性分析

猪肥胖基因（ｏｂ）部分序列的克隆与多态性分析戴茹娟１李宁２吴常信１（１．中国农业大学动物科技学院，北京１０００９４）；（２．中国农业大学农业生物技术重点实验室，北京１０００９４）ＰａｒｔｉａｌＣｌｏｎｉｎｇｏｆＰｏｒｃｉｎｅＯｂｅｓｉｔｙＧｅｎｅａｎ...

冠心病的基因诊断与基因治疗(一)

基因的表达与调控是分子心血管病学研究中最激动人心的进展，某些基因的异常表达在冠心病的发生与发展过程中起着极为重要的作用。基因学诊断与基因学治疗代表了一种全新的技术和方法，对解决冠心病的早期诊断、预防及治疗等方面的疑难问题具有无可比拟的潜力。

USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的克隆人类泛素水解酶22（ubiquitin—specific processing enzyme22，USP22）基因，构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体。方法利用RT—PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段，依次插入真核表达载体pEGFP—N1；重组质粒转染HEK293T细胞，观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布。结果测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致，酶切显示重组质粒pEG—FP—USP22构建无误，质粒转染后有80％左右HEK293T细胞表达绿色荧光，且在胞质与胞核中广泛分布。结论成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体，为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。

大鼠脂联素基因的克隆、载体构建及其在嗜酸乳杆菌中的表达

目的构建大鼠脂联素基因(AdipoQ)乳杆菌原核表达载体,为脂联素及重组益生菌的进一步研究奠定基础。方法用TRIzol试剂从大鼠脂肪组织提取总RNA,经RT-PCR方法扩增全长的AdipoQ cD-NA片段,将PCR产物亚克隆入质粒pMG36e载体,对重组质粒pMG36e-AdipoQ进行序列验证后,将重组子经电穿孔转化嗜酸乳杆菌,经SDS-PAGE初步分析重组菌Lb-PMG36e-AdipoQ对目的基因AdipoQ的表达情况。结果从大鼠脂肪组织中扩增得到735bp片段AdipoQ基因,经双酶切鉴定及测序分析,证明AdipoQ已插入pMG36e载体中。构建的pMG36e-AdipoQ原核表达载体被成功转入乳杆菌,并成功表达出分子量约为30ku的蛋白质,与核苷酸序列推断的蛋白大小相符。结论成功构建了大鼠脂联素基因乳杆菌原核表达载体,并在乳杆菌中获得蛋白表达,为脂联素及重组益生菌的进一步研究提供了可能。

端粒及端粒酶活性的调控机制

广义的端粒由帽子、双链的串联重复序列的DNA核心部分及亚端粒构成，其结合蛋白是一个复合体，由TRF1、TRF2、TIN2、Pot1、TPP1、RAP1 6个亚单位组成；另外，还结合组蛋白的特定成分H3K9三甲基聚合体和H4K20三甲基聚合体。端粒酶主要由hTerc、hTert、dyskerin构成。端粒的功能主要受端粒酶的活性调控；而端粒酶活性主要受hTert及hTerc的转录水平和转录后的剪切、hTert的翻译等因素的调控。端粒与端粒酶结构和功能的异常与细胞衰老及肿瘤的发生、发展关系密切。

大鼠对氧磷酶1真核表达载体的构建及在体外的表达

目的构建大鼠对氧磷酶1(paraoxonase1,PON1)真核表达载体,并检测其在体外培养细胞中的表达及功能,为进一步探索运用其进行基因防治肺部感染奠定基础。方法利用RT-PCR扩增大鼠PON1编码区全长序列,克隆入pcDNA3.1(+),鉴定无误后,脂质体转染A549细胞及293细胞,Western印迹检测蛋白表达,并检测其芳香酯酶活性及对铜绿假单胞菌密度感知系统信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactones,AHLs)的水解功能。结果分别从大鼠肝组织中扩增出1153bp片段,克隆入表达载体后进行酶切鉴定和测序结果正确。转染细胞后能够表达目的蛋白,该蛋白具有芳香酯酶和AHLs内酯酶活性。结论成功构建了含有大鼠PON1真核表达载体,质粒能够在真核细胞中表达,能够有效地水解铜绿假单胞菌密度感知系统信号分子。

人miR-16真核表达载体的构建与鉴定

目的构建人miR-16真核表达载体,为研究其基因表达调控机制建立实验基础。方法从人类基因组DNA中扩增miR-16的前体序列,引入酶切位点和polyT转录终止序列,酶切后插入siRNA表达载体pSuper中,构建miR-16真核表达载体pmiR-16,然后进行酶切和测序鉴定;同时构建含miR-16完全互补序列及乙肝表面抗原HBsAg的报告质粒pXF3H-HBs。将pmiR-16与pXF3H-HBs共转染肝癌细胞系HepG2,通过HBsAg ELISA检测试剂盒检测表达产物HBsAg的改变,鉴定真核表达载体pmiR-16的生物学活性。结果成功构建了人miR-16真核表达载体pmiR-16及其报告质粒。pmiR-16与pXF3H-HBs共转染HepG2后,pmiR-16组HBsAg的基因表达与对照组相比显著降低,证实pmiR-16转染真核细胞后具有生物学活性。结论miR-16真核表达载体的成功构建为进一步研究其基因表达调控机制建立了实验基础。

GSTP1在先天性巨结肠症中蛋白质表达谱、甲基化检测与表达分析

目的 利用双向凝胶电泳-基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）技术进行先天性巨结肠症（hirschsprung disease,HD）中蛋白质表达谱的研究;寻找HD中的生物标志物,为临床HD的早期无创性诊断提供依据.方法 分别提取20例HD患者配对狭窄段及正常段肠管组织的总蛋白质,进行双向凝胶电泳、银染,两组凝胶图像差异分析,得到差异蛋白质.对目的谷胱苷肽-S-转移酶1（glutathione S-transferase pi,GSTP1）蛋白质进行MALDI-TOF-MS质谱分析.运用甲基化特异性聚合酶链反应方法检测HD中GSTP1基因启动子区5′端 CpG 岛甲基化程度与表达.采用荧光实时定量PCR方法检测HD中GSTP1基因的mRNA 转录水平.结果 获得了分辨率较高的HD狭窄段及正常段肠管组织双向凝胶电泳图谱;得到阳性结果的差异蛋白质谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione S-transferase,GST）.MSP 检测48 例HD,其中狭窄段肠管组织GSTP1基因高甲基化41例;而正常段肠管组织GSTP1基因甲基化仅7例.HD狭窄段肠管组织GSTP1基因mRNA表达低于正常段肠管组织（P〈0.05）.结论 利用双向凝胶电泳-MALDI-TOF-MS质谱技术检测HD组织差异蛋白质所获得的GSTP1蛋白可为寻找HD早期诊断的分子标记物提供理论依据;GSTP1基因异常甲基化、表达与HD的发生发展相关.

β-catenin的生物学功能与调控机制

β-连环蛋白（β-catenin）是一种胞内糖蛋白，具有双重功能。一是作为附着连接的组成部分，与钙黏蛋白结合形成复合体参与细胞间连接；二是作为信号分子，是Wnt信号途径的重要环节，在胚胎发育和肿瘤发生中起重要作用。β-catenin选择何种途径发挥作用，与不同配体竞争性结合密切相关。目前已经证实β-catenin Y142位点酪氨酸磷酸化是决定β-catenin功能的关键调控点，而E—cadherin、Left、APC和α-catenin均参与β—catenin活性的调节，对细胞的命运有着重要影响。

人延伸体复合物Elp3亚基表达及功能研究

目的将人延伸体复合物(elongator)的中心亚基elp3(elongtor complexprotein3)基因导入293T细胞,观察它对293T细胞生长特性以及基因转录活性的影响。方法用脂质体将pFlAGCMV4-Elp3真核表达载体导入293T细胞,通过G418持续筛选阳性克隆,建立elp3的稳定表达细胞株。通过RT-PCR、免疫荧光法检测外源性elp3基因的表达。MTT法测定细胞生长曲线、流式细胞仪法测定细胞周期及凋亡情况。瞬时转染不同组合的质粒后,收集细胞用荧光素酶报告基因法检测转染前后荧光素酶活性的变化。结果Elp3可以抑制293T细胞生长,并使细胞出现G1期阻滞,未引起293T细胞凋亡。elp3能激活转录,但作用较弱。elp4也可激活转录,过量表达elp3基因与elp4基因时,可明显激活转录,说明两者有协同激活转录作用。Elp3与转录因子TFⅡF亚基RAP30基因过量表达时,两者也可协同激活转录。结论Elp3对293T细胞的生长有明显抑制作用,可诱导G1期细胞阻滞,具有转录激活功能,并可分别与Elp4亚基、RAP30亚基协同激活转录。

肝细胞生长因子激活因子抑制因子-1的表达与功能

肝细胞生长因子激活因子抑制因子-1(hepatocyte growth factor activator inhibitor type1,HAI-1)是一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制因子,定位于细胞的基底侧,具有膜型和分泌型两种形式,能有效抑制肝细胞生长因子激活因子HGFA和丝氨酸蛋白酶Matriptase的活性,参与HGF/c-Met信号传导途径调节。HAI-1在包括妊娠、再生及肿瘤等各种正常生理及病理状态下均有不同水平的表达,其表达水平的变化以及其与靶蛋白酶表达比例的变化直接影响到靶蛋白酶的活性,从而在调控个体发育、血管生成、组织损伤修复以及抑制肿瘤的侵袭性生长等生理和病理过程中发挥重要作用。

大肠杆菌中的小RNA调节子

小RNA(smallRNAs或sRNAs)是一类长度在40至400个核苷酸、广泛存在于从细菌到哺乳动物多种不同的生物体内、执行多种生物学功能的非编码的RNA分子。对于sRNA分子的研究过去主要集中在哺乳动物。近年来,随着生物信息学和分子生物学技术的不断发展,在原核生物体内也陆续发现了一些sRNA分子,这些sRNA分子具有多样的生物学功能。大肠杆菌作为原核生物的代表在其体内已发现了近70种的sRNA分子。同真核细胞中的sRNA一样,细菌中的sRNA绝大多数也是通过与靶mRNA配对来影响mRNA的稳定性或翻译,从而对基因的表达进行调节。Hfq蛋白作为RNA的分子伴侣对于这些RNA分子的正确折叠和行使功能具有重要的作用。

长非编码RNA与肿瘤

长非编码RNA的广泛存在,在改变人们对分子生物学认知的同时,也改变了对肿瘤等疾病发生机制的看法。肿瘤全基因组突变测序分析发现,非编码区域的突变比遗传密码子区域的突变更能影响疾病的发生。因为长非编码RNA发挥着精准的调控功能,它们可与各种调控因子相互作用,促进肿瘤等疾病的发生,因此,长非编码RNA可作为临床诊断的标志物和治疗靶点。现将从基因的表达与调控的角度出发,介绍长非编码RNA影响肿瘤发生发展的分子机制。