精准序列替换基因组编辑技术研究进展

利用基因组编辑技术可以对微生物、动植物和人类细胞系基因组进行精准的序列替换,加速生物育种进程和遗传性疾病治疗,从而在农业生产和医疗上取得突破。基因组序列替换策略主要分为2种:第1种依赖DNA双链断裂,包括将CRISPR-Cas分别与同源重组、单链退火、微同源末端连接等DNA修复途径相结合,或由位点特异性重组系统介导,实现精准的序列替换;第2种依赖DNA单链断裂,主要包括引导编辑、碱基编辑器等技术。本研究综述了不同精准序列替换策略和技术及相关研究进展,理清各策略和技术的优缺点,有助于根据基因组编辑的目的,选择适合的技术和方法实现精准高效的序列替换。

基因组编辑技术加速猪育种进程

依赖于核酸酶的基因组编辑技术能够在基因组水平对DNA序列进行改造,包括特定DNA片段的插入、敲除、替换以及点突变等遗传修饰。2012年发展起来的CRISPR/Cas9基因编辑技术,具有效率高、通量高、安全性高、操作方便、简单易实现等特点,得到了广泛的关注和应用。基于CRISPR/Cas9系统开发的碱基编辑系统(Base Editor,BE)和引导编辑系统(Prime Editor,PE)可以在不需要DNA模板的情况下对基因进行精准的碱基突变。目前,CRISPR/Cas9及其衍生的基因组编辑技术在猪生产性状的改良和抗病育种新材料的创制方面已经取得了良好进展,并展示出了巨大的发展潜力和应用前景。本文重点介绍了CRISPR/Cas9、碱基编辑、引导编辑技术及其在猪育种中的研究进展,并展望了猪基因组编辑育种面临的机遇与挑战。

推动基因组编辑研究范式升级

生物体的性状由遗传物质DNA中腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)四种碱基的排列组合所编码。在细胞分裂过程中,DNA复制不可避免地会产生错误,使得碱基排列组合可能发生改变,从而产生遗传物质变异。基因组编辑技术能够在海量的遗传密码中进行精准搜索,并靶向创制出预期的基因组变异,使人类开始拥有改造和设计生命体的能力。

CRISPR/Cas9基因组编辑技术在丝状真菌中的应用

丝状真菌次级代谢产物种类繁多,其中许多具重要生物活性物质和药用成分,也有一些具毒素,开展其基因编辑的研究非常有必要,利用该系统可对其基因组进行点突变、插入或缺失,实现基因的敲除,但丝状真菌细胞壁厚且成分复杂,导入外源基因较难,开发出高效的CRISPR/Cas9基因组编辑技术极为重要。运用文献研究法,介绍了CRISPR/Cas9基因组编辑技术的原理、方法及其在丝状真菌中的研究和应用,分析了CRISPR/Cas9系统各组分和呈递体系的优化对丝状真菌中基因编辑效率的影响,其中,Cas9核酸酶、sgRNA表达的优化,启动子、PAM序列及基因组编辑体系的改进都有效地提高了CRISPR/Cas9系统的编辑效率。今后可通过开发无PAM序列要求、可进行基因转录调控、能定向插入和敲除超长目的片段等系列真菌通用的基因编辑体系,实现真菌资源在工业、农业和医药等领域的充分应用。

旗帜鲜明划出红线 力促人类基因组编辑“向善而行”——专家解读《人类基因组编辑研究伦理指引》

为了规范人类基因组编辑研究行为,促进人类基因组编辑研究健康发展,2024年7月8日,科技部官网公布《人类基因组编辑研究伦理指引》(以下简称《指引》)。《指引》明确了开展人类基因组编辑研究的目的、基本原则、一般要求和特殊要求。这份由国家科技伦理委员会医学伦理分委员会研究制定的文件,旗帜鲜明地划出红线——目前进行任何生殖系基因组编辑的临床研究都是不负责任和不被允许的。

中国鱼类基因组编辑育种研究现状及存在问题与展望

该文首次系统介绍了我国鱼类基因组编辑育种的研究现状、存在问题和发展前景。首先,作者简要介绍了ZFN(Zinc Finger Nucleases)、TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nucleases)和CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)等3种基因组编辑技术的优缺点。其次,提出了鱼类基因组编辑育种的定义和工作流程。第三,作者重点介绍了我国鱼类基因组编辑育种的主要进展。包括我国科学家建立的尼罗罗非鱼、鲤、鲫、半滑舌鳎、团头鲂、南方鲇等多种养殖鱼类基因组编辑育种技术。尤其是利用TALEN和CRISPR技术创制了雌雄反转、颜色不同的罗非鱼,通过TALEN方法创制了半滑舌鳎dmrt1基因突变、生长快速的F3雄鱼新种质,研制出无肌间刺鲫和团头鲂新种质。这些进展使我国鱼类基因组编辑育种与国际上同类研究相比,实现了从过去的跟跑到现在的并跑,甚至在某些鱼类上领跑的转变。作者最后梳理了目前鱼类基因组编辑育种研究中存在的不足和问题,并对我国鱼类基因组编辑育种的未来发展方向进行了展望,提出了今后鱼类基因组编辑育种的研究重点。该文对于推动我国鱼类基因组编辑育种的研究进程,创制基因组编辑突破性新品种具有重要意义和参考价值。

CRISPR/Cas9系统在基因组编辑中的优化与发展

CRISPR/Cas9是近年来发展起来的新兴技术,其在多种生物和组织的基因组上具有快速、高效、精准的基因编辑与调控能力,这使得该技术在基础科学和合成生物学等应用科学领域均得到了极大的发展与应用。本文首先对CRISPR的历史沿革、分类及CRISPR/Cas9技术的作用机制进行简述,并结合其原理和在基因组工程中面临的脱靶率高、PAM依赖性强等限制因素总结了近年来针对Cas9蛋白和向导RNA (gRNA)进行的一系列优化与改造。接下来详细叙述了CRISPR/Cas9系统结合效应蛋白实现的多种功能,包括基因表达调控、表观基因组编辑、单碱基编辑等。基于gRNA多表达策略和Cas9多路复用策略,本文还对CRISPR/Cas9技术主要的多重应用成果进行了梳理汇总。最后探讨了CRISPR/Cas9作为高精度基因组编辑工具使用的应用前景,以及作为疗法使用时的安全性和风险控制问题。

基于CRISPR/CasX介导的水稻基因组编辑技术的建立

Cas蛋白作为核酸酶发挥其切割活性需要识别特定的PAM序列,如SpCas9识别NGG PAM位点,LbCas12a识别TTTV PAM。已挖掘到新的能够识别TTCN PAM序列的蛋白—CasX蛋白,扩展了基因组编辑技术的编辑范围。本研究利用CasX的两个衍生型蛋白PlmCasX和DpbCasX,建立基于CRISPR/CasX介导的水稻基因编辑系统。通过PEG介导的水稻原生质体瞬时表达分析其编辑活性发现,PlmCasX和DpbCasX两个蛋白能够对水稻内源基因OsCPK16实现有效编辑。后通过水稻稳定遗传转化进一步验证,在TTCA PAM识别位点,DpbCasX蛋白对水稻内源基因OsCPK21的编辑效率为17.5%,PlmCasX蛋白对水稻内源基因OsCPK21的编辑效率为66.07%;在TTCG PAM识别位点,PlmCasX蛋白对OsCPK4的编辑效率为23.21%,而DpbCasX蛋白不能实现有效的基因编辑。并且基于MIDAS方法对PlmCasX蛋白的优化并不能提高其编辑活性。本研究证明了CRISPR/CasX系统在水稻中具有编辑活性,且其能识别TTCR PAM这一特性,扩大了基因编辑技术在水稻中的应用范围。

CRISPR相关转座酶及其细菌基因组编辑应用

CRISPR-Cas能够在RNA引导下靶向DNA或RNA的特定序列,改变RNA序列即可改变靶向位点,利用这一可重编程特性已开发出了各种强大的遗传学工具。最近发现CRISPR元件在进化过程中被Tn7转座子劫持,由此衍生出的CRISPR相关转座酶(CRISPR-associated transposases, CASTs)系统具有RNA引导DNA整合的能力,被部署为靶点可重编程的基因组整合工具,在大片段和多重基因整合上具有广阔的应用前景。本文追溯了CASTs的发现历程,总结了不同类型CASTs的基因座结构特点、介导基因整合的机制模型以及其在多种革兰氏阴性细菌中的部署和应用。

基因组编辑技术及其安全管理

基因组编辑技术利用核酸酶对生物体内的DNA双链进行断裂,并以非同源末端连接或同源重组的方式对基因组DNA特定位点进行突变、缺失或者基因的插入与替换。锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶、成簇规律间隔短回文重复序列是目前基因组编辑技术应用中的3种关键核酸酶。基因组编辑技术已在植物基因功能、育种等领域广泛应用,特别是基于成簇规律间隔短回文重复序列的基因编辑技术CRISPR-Cas9。具有优良性状的基因组编辑大豆、玉米等产品已逐步从实验室走向田间,基因组编辑作物展现了较传统转基因作物更为优越的应用前景。本文简要概述了主要使用的3种基因组编辑技术及其原理。对这些技术的优缺点进行了分析,并依据物种分类梳理了利用上述3种技术在动物、植物中突变体建立、基因功能研究、分子育种等方面的研究进展。同时,针对基因编辑产物的产业化应用前景,讨论了基因编辑技术及其产品较传统转基因技术产品的优势,分析了基因编辑技术及其产品可能因脱靶效应而引发的生物安全风险,介绍了美国、欧盟等国家对基因编辑技术及其产品安全管理和商业化应用的政策。文章结合中国现行法规对转基因生物的定义及安全评价(实质等同、个案分析)原则,讨论了基因编辑技术及其产品的安全管理,初步提出了基于传统转基因生物安全评价框架的基因编辑产品的安全评价和管理思路。针对基因编辑产品需要按照个案原则进行评价和管理,安全评价重点开展分子特征及食用安全评价;同时需要针对基因编辑技术的特点建立更加有效、特异的检测新方法,实现对基因编辑产品的有效监测,以促进基因组编辑产品的商业化应用。

基于棉花U6启动子的海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑体系的建立

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是基因功能研究的一种强有力的工具,目前已在许多生物体中成功实现内源靶向基因的突变。利用已克隆的海岛棉新海16的2个U6启动子,分别构建带有新海16内源基因(GbGGB和GbERA1)靶位点DNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体。以新海16的胚性愈伤组织为供试材料,制备海岛棉的原生质体。通过PCR方法大量富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段(包括GbU6::sg RNA和CAMV35S::Cas9两部分),并利用PEG法转化海岛棉的原生质体。对原生质体基因组DNA进行酶切后PCR,成功检测到内源靶基因的突变现象。对PCR产物进行克隆测序,结果显示序列突变的类型主要以碱基替换为主,少数为碱基缺失。结果表明基于海岛棉U6启动子的CRISPR/Cas9基因编辑系统能在海岛棉中实现靶向基因编辑的功能,为棉花功能基因组学研究提供了重要的技术基础。

CRISPR/Cas9基因组编辑技术及其在动物基因组定点修饰中的应用

CRISPR/Cas系统是细菌和古生菌中抵抗外源病毒或质粒入侵的获得性免疫系统,利用CRISPR RNAs(cr RNAs)引导Cas核酸酶沉默入侵的核酸。通过分子生物学改造使Ⅱ型CRISPR/Cas系统成为一种高效的基因组定点修饰技术,并且比锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFNs)和TALE核酸酶(Transcription activator like effector nucleases,TALENs)结构更简单,更容易设计和应用。文章主要介绍了CRISPR/Cas9系统成为高效基因组定点修饰技术的发展历程、Ⅱ型CRISPR/Cas的工作原理和改造过程以及在动物基因组定点修饰的应用,剖析了该技术存在的问题和现有改进方案,并与成功案例相结合展望了CRISPR/Cas9系统的应用前景,以期为动物性状改良和人类疾病动物模型的创立提供新思路。

基因组编辑技术应用于作物遗传改良的进展与挑战

基因组定点编辑(site-specific genome editing)是指在基因组水平上对生物DNA序列进行定点改造的遗传操作技术,其在基因功能解析、动植物遗传改良和新品种培育等方面具有重大的应用价值。基因组定点编辑工作原理是利用序列特异性核酸内切酶(sequence-specific nucleases,SSNs)在基因组靶定位置切割DNA双链,造成DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs),并通过非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或同源重组(homology-directed repair,HDR)的DNA修复途径在基因组特定位点造成靶标基因的碱基插入、缺失或DNA片段替换,从而实现基因组的定点改造。目前,已成功应用于作物遗传改良的SSNs主要包括锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)、成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins,CRISPR/Cas system)。从发展态势看,基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑技术必将成为作物遗传改良和分子设计育种的核心技术之一。论文简要概述了ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas系统这3种基因组编辑的技术背景及工作原理;结合案例重点综述上述3种技术在作物产量、品质、抗病性、抗逆性改良及水稻雄性不育系创制上的研究进展;详细梳理基于CRISPR/Cas的植物基因组单碱基编辑系统和DNA-free植物基因组编辑系统的技术创新和应用;比较分析3种技术的优缺点,并提出基因组编辑技术应用于作物遗传改良的一般原则;介绍了美国和欧盟等对基因编辑技术及其产品安全监管和商业化应用的政策法规,及业界人士对基因编辑作物提出的监管框架协议;最后,针对基因编辑技术自身的技术优势和缺陷,讨论该技术应用于作物遗传改良和分子育种的机遇和挑战。

美国白蛾Wnt-1基因的基因组编辑

【目的】为了从分子水平上揭示美国白蛾飞行能力的机制,利用基因组编辑技术对翅形成相关基因Wnt-1进行功能研究。【方法】根据美国白蛾的基因组和转录组信息设计引物,克隆得到HcWnt-1基因CDS区全长,利用在线软件分析HcWNT-1蛋白的结构特征;通过RT-PCR确定该基因在其生长发育过程中的时间表达模式,并通过免疫组化方法确定HcWNT-1蛋白的时空表达模式;通过CRISPR/Cas9技术对HcWnt-1基因进行编辑,观察胚胎期突变体表型和基因型特点,利用直接PCR和阳性克隆测序检测HcWnt-1基因突变。【结果】HcWnt-1基因核苷酸序列大小为1 221 bp,编码407个氨基酸,HcWNT-1蛋白含有螺旋-转角-螺旋DNA结合基序和24个保守的半胱氨酸残基,并且高度保守的Motif分散分布于整个序列。转录水平和翻译水平验证表明:美国白蛾HcWnt-1基因在胚胎早期高表达,且其表达水平随着体节分化和附肢发育而呈时序性变化;24 h时,早期胚带形成,转录水平出现第1个表达高峰,HcWNT-1蛋白表达主要集中于原头区;随着胚胎的发育,HcWnt-1基因表达水平逐渐下降,HcWNT-1蛋白表达沿着前后体轴由头部向尾部逐渐延伸;在144 h,转录水平出现第2个表达高峰,HcWNT-1蛋白表达主要集中于附肢。美国白蛾HcWnt-1基因的突变造成了胚胎期99.8%的个体死亡(注射1 000头),突变率为62.5%,PCR测序结果显示2个靶点之间存在片段删除,最大删除片段为423 bp;大部分突变体不能形成胚胎,少数能形成胚胎的个体体节形成异常和附肢发育受阻。【结论】美国白蛾胚胎发育类型符合短胚带和中间胚带型;CRISPR/Cas9基因组编辑技术可以对美国白蛾基因组进行高效编辑,可为林业以及非模式害虫基因功能研究提供理论支持;HcWnt-1基因敲除影响美国白蛾体节分化和附肢形成,说明该基因对于美国白蛾胚胎发育至关重要。此外,HcWnt-1突变造成美国白蛾胚胎期死亡,可作为未来美国白蛾遗传防治的靶标基因。

茶树咖啡碱合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建

CRISPR/Cas9技术是一门新兴的基因组定点编辑技术,具有操作简单、高效的优点,可轻松实现对目标基因的敲除、替换和定点突变等操作。该技术刚诞生,就受到了全球生命科学领域研究者的关注,不到3年的时间就已经成功应用于多种动、植物当中。然而CRISPR/Cas9技术在茶树中的应用面临载体构建问题,本文以茶树咖啡碱合成酶为例,联合采用常规PCR、Overlapping PCR和Golden Gate Cloning技术,构建了包含茶树咖啡碱合成酶双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,为CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术在茶树中的应用奠定了坚实基础。

CRISPR/Cas植物基因组编辑技术研究进展

基因编辑技术的发展与应用为植物功能基因研究和作物遗传改良提供了重要的技术支撑。近年诞生的CRISPR/Cas 基因编辑系统(主要包括 CRISPR/Cas9 和 CRISPR/Cas12a)与其他的基因编辑技术相比,具有操作简单、效率高等优势,因此在动植物中均得到广泛应用。本文结合 CRISPR/Cas 基因编辑技术体系的发展历史及最新研究进展,着重介绍了该技术在植物领域中的应用范围和发展方向,以及基因编辑植物的靶点分析方法;对目前CRISPR/Cas 基因编辑技术体系存在的问题进行了分析并提出了改进策略。

CRISPR/Cas9基因组编辑技术在农业动物中的应用

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR associated proteins)是在细菌和古细菌中发现的一种用来抵御病毒或质粒入侵的获得性免疫系统。目前已发现的CRISPR/Cas系统包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型,其中Ⅱ型系统的组成较简单,由其改造成的CRISPR/Cas9技术已成为一种高效的基因组编辑工具。自2013年CRISPR/Cas9技术成功用于哺乳动物基因组定点编辑以来,应用该技术进行基因组编辑的报道呈现出爆发式的增长。农业动物不仅是重要的经济动物,也是人类疾病和生物医药研究的重要模式动物。本文综述了CRISPR/Cas9技术在农业动物中的研究和应用进展,简述了该技术的脱靶效应及减少脱靶的主要方法,并展望了该技术的应用前景。

植物基因组编辑及衍生技术最新研究进展

基因组编辑技术已经在多个模式植物、动物以及其他生物中得到成功应用。基因组编辑是利用序列特异核酸酶(Sequence-specific nucleases,SSNs)在基因组特定位点产生DNA双链断裂(Double-strand breaks,DSBs),从而激活细胞自身修复机制——非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)或同源重组(Homologous recombination,HR),实现基因敲除、染色体重组以及基因定点插入或替换等。锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)、TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)和CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9)系统是最主要的3类SSNs。ZFN和TALEN是利用蛋白与DNA结合方式靶向特定的基因组位点,而最新的CIRISPR/Cas9系统则是利用更简单的核苷酸互补配对方式结合在基因组靶位点,其构建简单、效率更高效,因而促进了基因组编辑在植物中的广泛应用。利用基因组编辑技术除了实现植物基因定点突变外,还可以将SSNs的DNA结合域与其他功能蛋白融合,实现基因的靶向激活、抑制和表观调控等衍生技术。本文从基因组编辑技术的原理与优势、SSNs组成及构建方法、基因组编辑及衍生技术在植物中应用、优化SSNs突变效率和减少脱靶突变方法等方面进行了系统介绍,并对未来需要迫切解决的一些问题进行了分析和展望。

可遗传基因组编辑引起的伦理和治理挑战

集中讨论可遗传基因组编辑引起的伦理和治理挑战。首先介绍了可遗传基因组编辑讨论的背景,指出美国科学院的《人类基因组编辑:科学、伦理学和治理》以及英国纳菲尔德生命伦理学理事会的《基因组编辑和人类生殖:社会和伦理问题》这两篇报告的重要意义;然后讨论了反对和支持可遗传基因组编辑的论证,指出了从哲学概念出发的哲学论证与从实际出发的生命伦理学论证之间的区别;最后指出在实施可遗传基因组编辑之前必须建立伦理框架和治理安排,并进一步论述了伦理框架和治理安排的初步建议。

CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术的研究进展

CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins)系统为细菌与古生菌中抵御外源病毒或质粒DNA入侵的获得性免疫系统。该系统在crRNA的指导下,使核酸酶Cas识别并降解外源DNA。其中,Ⅱ型CRISPR-Cas系统最为简单,仅包括一个核酸酶Cas9与tracrRNA:crRNA二聚体便可完成其生物功能。基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术的核心为将tracrRNA:crRNA设计为引导RNA,在引导RNA的指导下Cas9定位于特定DNA序列上,进行DNA双链切割,实现基因组的定向编辑。CRISPR-Cas9系统以设计操纵简便、编辑高效与通用性广等优势成为新一代基因组编辑技术,为基因组定向改造调控与应用等带来突破性革命。从CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术的发展与应用等方面综述其最新研究进展,并着重介绍该技术的关键影响因素,为相关研究者提供参考。