谷氨酸棒杆菌基因缺失菌株的定点构建

通过目标基因内部缺失片段的获得以及DNA重组交换等技术的有效运用 ,在氨基酸工业重要生产菌谷氨酸棒杆菌中 ,成功地定点构建了两个目标研究基因的单基因缺失菌株和双基因缺失菌株 ,并通过了PCR和测序等方法的分析验证。

胸膜肺炎放线杆菌flp基因缺失菌株的构建及生物学特性

flp（fimbrial low-molecular-weight protein）操纵子由13~15个基因组成,在细菌中广泛存在,主要编码一种类菌毛（Flp菌毛）的束状纤维蛋白,与细菌在宿主中的黏附和定植有关。本试验利用同源重组技术获得了无抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清Ⅰ型4074菌株的flp基因缺失菌株,通过对基因缺失菌株进行一系列的生物学特性研究,探索胸膜肺炎放线杆菌的flp基因功能。结果表明,flp基因的缺失不会对胸膜肺炎放线杆菌在体外的生长和其溶血活性产生明显影响,但能导致猪胸膜肺炎放线杆菌4074菌株丧失形成菌毛的能力;以小鼠为模型的动物试验结果显示,基因缺失菌株的致病力较亲本菌株有所降低。

橙色红曲菌及其pksCT基因缺失株液态发酵产橘霉素及色素的变化

以橙色红曲菌AS3.4384(原始菌株)及其pksCT基因缺失株(PHDS26)为发酵菌株,分别于酵母浸膏蔗糖(YES)、米粉、米粉无机盐培养基中进行液态发酵,采用高效液相色谱法(HPLC)和紫外分光光度法分别测定AS3.4384及PHDS26菌株于上述培养基中橘霉素和红曲色素的含量。结果表明:在酵母浸膏蔗糖(YES)、米粉、米粉无机盐培养基中,PHDS26橘霉素最高产量较橙色红曲菌AS3.4384橘霉素最高产量分别降低了97.24%、98.35%、39.18%。在米粉培养基中PHDS26红曲色素最高产量较橙色红曲菌AS3.4384红曲色素最高产量降低了71.0%,而在含无机盐的米粉培养基中PHDS26红曲色素最高产量较橙色红曲菌AS3.4384红曲色素最高产量却提高了60.2%。

沙门菌外膜蛋白相关基因缺失株的致病性

为探究沙门菌外膜蛋白基因fadL、ompN、ybfM以及sRNA RybB和伴侣蛋白Hfq缺失对该菌致病性的影响,构建了鼠伤寒沙门菌基因缺失菌株,并测定了基因缺失菌株的生长曲线,同时通过小鼠腹腔注射测定了基因缺失菌株的毒力及其在小鼠脾脏和肝脏上的定殖能力.结果显示,与鼠伤寒沙门菌亲本野生型菌株LT2相比,基因缺失菌株的生长能力变化不大.LT2对小鼠的LD_(50)为3.97×10^(7)CFU;外膜蛋白基因缺失菌株ΔompN、ΔfadL和ΔybfM的LD_(50)分别为1.58×10^(5)、6.29×10^(5)、9.97×10^(5)CFU,毒性明显增强;sRNA敲除菌株(ΔrybB)的LD_(50)为9.97×10^(7)CFU,毒性有所下降;伴侣蛋白Hfq敲除组(Δhfq)及rybB&hfq双敲除组的小鼠死亡数未超过50%,毒性明显下降.感染48 h后,与对照组(LT2)相比,所有基因缺失菌株处理组的脾脏指数均极显著性升高;ΔrybB&Δhfq、Δhfq处理组的脾脏载菌量显著降低,其余菌株处理组的载菌量与LT2差异不显著;ΔrybB、ΔrybB&Δhfq、ΔfadL、ΔybfM处理组的肝脏指数均显著下降,而Δhfq、ΔompN处理组的肝脏指数变化不显著;ΔrybB、ΔfadL处理组肝脏载菌量变化不显著,Δhfq、ΔrybB&Δhfq处理组的肝脏载菌量显著下降,而ΔompN、ΔybfM处理组的载菌量显著上升.总的来说,hfq、rybB缺失降低了鼠伤寒沙门菌的致病力,而fadL、ompN、ybfM的缺失提高了鼠伤寒沙门菌的致病力.

应用CRISPR/Cas9系统构建大肠埃希氏菌irp2基因缺失株

CRISPR/Cas9是一个新兴的基因编辑技术,利用该技术对临床分离的撒坝猪致病性大肠埃希氏菌中的irp2基因进行编辑,为进一步研究该基因在致病中的作用提供基础。首先构建靶向irp2基因的sgRNA,PCR扩增上、下游同源臂,利用重叠PCR技术连接sgRNA与上、下游同源臂,再通过酶切与酶连构建出靶向irp2基因的pTargetF重组质粒。将pCas与pTargetF重组质粒转化临床分离的撒坝猪致病性大肠埃希氏菌中,成功构建了该菌株的irp2基因缺失菌株,为进一步研究其致病机制奠定基础。

基于转录组测序筛选鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失菌的差异表达基因

旨在鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株转录组测序中分析适应环境变化及细菌分泌通路,筛选相关基因。通过使用实时荧光定量PCR对鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株转录组测序结果进行验证,从而对鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株的细菌趋化性通路、细菌双组分通路、细菌分泌通路进行深入分析,筛选相关的重要调控基因。结果显示:在细菌趋化性通路中筛选出yiaD、STM 3138、STM 3216和malE等4个共表达基因;在细菌分泌通路中筛选出spaP、invA、prgH、invE、spaS、invG和ssaV等7个共表达基因;在细菌双组分通路中筛选出ybfM、htrA、pagO、STM 3138、STM 3031、ttrB、hilD、pstS、STM 1530、hilA、pgtC、hydH、pocR、STM 3216、ttrR和fljB等16个共表达基因。在鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株的趋化性通路、细菌双组分通路、细菌分泌通路中筛选出差异表达基因,hfq能够对这些基因进行调控,从而影响如运动性、毒力等相关作用,为沙门菌中的sRNA与hfq后续研究及沙门菌的防治奠定一定基础。

酿酒酵母中对抗真菌药物克霉唑敏感的突变菌株的筛选

克霉唑是一种临床上用于抗真菌感染的抗真菌药物,同时也具有治疗其他疾病如疟疾、脚气病、足癣和癌症的前景。通过96孔板液体培养及倍比稀释的方法,对模式真菌酿酒酵母双倍体单基因缺失株文库中的4 532个非必需基因缺失株进行初步筛选及表型验证,对筛选出的敏感菌株测定了加克霉唑和不加克霉唑细胞内的ROS水平变化。筛选得到了127个克霉唑敏感的单基因缺失株,127个敏感菌株缺失的基因,其功能分别参与细胞的代谢过程、细胞周期和DNA加工过程、转录过程、蛋白命运(折叠,修饰,靶向运输)、细胞运输、细胞通讯/信号转导机制、细胞命运、细胞组分的发生和起源、不同细胞类型的分化、细胞营救、防御及毒力、细胞与环境交流和调节代谢及蛋白功能的过程,也有33个基因的功能未知。ROS测定结果显示,加入克霉唑之后,和野生型相比,25个菌株细胞内ROS显著升高,13个菌株细胞内ROS水平反而显著降低。克霉唑的抗真菌作用可能是多个细胞过程的集合,研究结果为克霉唑的改进利用及新的抗真菌药物研发提供理论基础。