复合侵染云南西番莲的两种菜豆金色花叶病毒属病毒的分子鉴定及序列分析

西番莲Passiflora caerulea是我国南部省区广泛种植的一种热带果树。本研究于2020年6月从云南省德宏州西番莲种植区采集到4份疑似感染菜豆金色花叶病毒属病毒的西番莲样品,利用PCR扩增、克隆、测序以及生物信息学分析等方法,明确了西番莲样品受菜豆金色花叶病毒属病毒侵染。对4份西番莲样品进行菜豆金色花叶病毒属病毒全基因组扩增,从中共获得5条菜豆金色花叶病毒属病毒全基因组序列,分别命名为YN7292-6、YN7293-12、YN7293-4、YN7294-16和YN7295-25,均具有菜豆金色花叶病毒属单组分病毒的典型结构,编码7个开放阅读框(open reading frame,ORF);其中YN7292-6、YN7293-12、YN7294-16及YN7295-25与一品红曲叶病毒(Euphorbia leaf curl virus,EuLCuV)的不同分离物的核苷酸相似性均高于99.05%,为EuLCuV的不同分离物;而YN7293-4则与分离自江西西番莲样品的广东番木瓜曲叶病毒(papaya leaf curl Guangdong virus,PaLCuGdV)分离物GNPF1(GenBank登录号:MK673114.1)的核苷酸相似性最高,为99.70%,为PaLCuGdV的一个分离物;重组分析发现,2个分离物EuLCuV-YN7293-12和PaLCuGdV-YN7293-4均为重组病毒。本研究首次在云南省发现EuLCuV和PaLCuGdV这2种菜豆金色花叶病毒属病毒复合侵染西番莲,为有效预防和控制西番莲病毒病害的发生和传播提供理论依据。

河北保定地区黄瓜花叶病毒与马铃薯Y病毒复合侵染叶用莴苣分子鉴定

利用RT-PCR方法对采集自河北保定地区的疑似叶用莴苣病毒病样品进行分子生物学鉴定,并构建系统发育进化树。结果表明,特异性引物CMV和PVY分别扩增得到大小为260、420 bp的单一条带;通过核苷酸序列Blast比对及系统进化树分析,河北保定地区叶用莴苣病毒分离物分别与印度番茄CMV分离物(MN514839.1)、印度马铃薯PVY分离物(JX945850.1)聚在同一分支上,同源性分别为95%、92%。本研究首次检测到河北保定地区叶用莴苣病毒病是由CMV与PVY复合侵染所致。

三七根腐病病原及复合侵染的研究

从三七根腐病不同发病期根部分离到假单胞杆菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．、腐皮镰孢Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ、细链格孢Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｔｅｎｕｉｓ和小杆线虫Ｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ。活体接种假单胞杆菌的致病性最强，腐皮镰孢和细链格孢的致病性弱，小杆线虫无致病性。假单胞杆菌、腐皮镰孢和细链格孢混合接种的发病率都高于单独接种的发病率，尤以３种菌混合接种的发病率最高，含细菌的组合发病率高于不含细菌的发病率，说明细菌在侵染中起了主要作用。

部分烟区烟草病毒病病原检测及复合侵染分析

为明确主要烟区烟草病毒病的主要病毒种类,采用抗原直接包被ELISA法对重庆、四川、云南、贵州、河南、陕西和甘肃等省市部分烟区采集的266个烟草病毒病样品进行了检测。结果表明,样品中共检测到马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)及芜菁花叶病毒(Turnipmo-saic virus,TuMV)等5种病毒。其中PVY的侵染最普遍,总检出率达75.56%;TMV、CMV、ToMV和TuMV的总检出率分别为65.41%、57.14%、36.84%和34.59%,其中,ToMV和TuMV仅在云南、四川、贵州和重庆样品中检测到。在257个阳性样品中有97个样品受CMV、TMV或PVY单独侵染,其检出率分别为7.39%、13.23%和17.12%;其余样品均受2种以上病毒复合侵染,其中55.63%的样品中检测到5种病毒复合侵染。田间烟草样品表现出复杂的病毒病症状类型。这些结果说明田间烟草病毒复合侵染现象严重,PVY已成为当前我国烟区的优势毒原。

包含病原线虫的植物复合侵染病害

包含病原线虫的植物复合侵染病害的研究已逾１００年，对这种复合侵染病害的发现与验证是本世纪５０年代至７０年代间植物病理学的显著发展之一。植物病原学已从单一病原学发展至多重病原学。本文就重要的复合侵染病害及其病原的协同作用方式和协同作用机制等方面的研究进展作了评述。展望２１世纪，相信我国植物病理学者将会越来越多地关注植物复合侵染病害问题，从而推动该领域的研究不断深入与发展。

从葎草中检出复合侵染的多种病毒

采用抗原直接包被酶联免疫吸附测定法(ELISA)对采自重庆近郊的34个葎草样品进行了主要病毒种类的检测。其中马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的侵染最普遍,其阳性检出率达44.12%;马铃薯X病毒(Potatovirus X,PVX)的阳性检出率最低,仅为26.47%,其余5种病毒,烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)、芜菁花叶病毒(Turnipmosaic virus,TuMV)及蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus2,BBWV-2)的阳性检出率均为35.29%。葎草样品受多种病毒的复合侵染现象非常严重,15个阳性样品中病毒复合侵染率为80%,其中75%的样品检测到7种病毒复合侵染。

番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒复合侵染的分子鉴定

2013年秋季,在山东寿光设施番茄植株上采集到叶片脉间褪绿黄化、叶片边缘卷曲、叶片皱缩,后期叶片变厚、变脆,并伴随着植株矮化的疑似番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒复合侵染的样本。分别利用番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)外壳蛋白基因(CP)序列引物CP-F/CP-R和番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)特异引物TY1-R/TY1-F、TY2-R/TY2-F、TY3-R/TY3-F对其进行检测、扩增,分别得到774bp(Gen Bank登录号KC709510)和2781bp(Gen Bank登录号KJ546418)的核苷酸序列。经序列测序后表明,KC709510与Gen Bank已登录的番茄褪绿病毒To CV-BJ(KC311375)分离物相似性为99.6%,KJ546418与Gen Bank已登录的番茄黄化曲叶病毒TYLCV-SDWF-L7(KC999850)分离物相似性为99.6%。

云南烟草蚀纹病毒与其他病毒复合侵染的多重RT-PCR检测

烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV)在云南各烟区普遍发生,且症状表型不一,TEV与其他病毒复合侵染,给烟草病毒病防治带来困难。病毒的准确检测是病害防控的前提。本文应用多重RT-PCR检测云南烟草病毒病样品,发现TEV与其他病毒存在3种复合侵染类型,分别为TEV/TVBMV,TEV/TMV和TEV/TVBMV/PVY。其中,TEV单独侵染只占检测样品数目的 19.05%,而TEV/TVBMV复合侵染发生较为普遍,占检测样品数目的 52.38%。初步分析了这3种复合侵染类型在云南烟草产区的分布,其中最主要的复合侵染类型TEV/TVBMV在文山、楚雄、昭通和昆明4个州市不同烟区分布广泛。该试验结果为云南TEV的监控与防治提供了理论依据。

甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒复合侵染甘薯引起的细胞病理学研究

2011～2012年在浙江杭州连续发现感病甘薯植株具有甘薯病毒病SPVD的典型症状,透射电镜观察发现其叶片包含有长度为600～900 nm,直径为12 nm的线状病毒粒子。使用特异性引物进行RT-PCR扩增及测序,其病原为甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)复合侵染。运用透射电镜研究SPVD引起的细胞病理学变化,观察到叶肉细胞的细胞质中含有马铃薯Y病毒属特征性柱状内含体,其结构分类为Ⅳ型;线状病毒样粒子以束状平行排列成聚集体的方式存在于细胞质中;叶绿体伸出伪足状结构包裹线粒体。在维管束细胞的筛管和伴胞中观察到弯曲线状病毒样粒子形成的聚集体,其粒子排列交错,与叶肉细胞中平行排列的病毒样粒子聚集体不同,符合毛形病毒属特征。另外还在维管束和叶肉细胞结合的部位发现复合侵染的细胞病理学特征。本研究表明危害甘薯生产的SPVD已扩散蔓延到浙江省。

枯萎病菌和根结线虫对黄瓜复合侵染研究

黄瓜枯萎病和根结线虫病是三明地区黄瓜的 2种重要病害。经鉴定黄瓜枯萎病的病原为尖镰孢 (Fusariumoxysporum) ,黄瓜根结线虫的种类有南方根结线虫 (Meloidogyne incognita)、爪哇根结线虫 (M.javanica)、花生根结线虫 (M. arenaria)。接种试验证实尖镰孢和南方根结线虫在黄瓜上能复合侵染 ,引起重大损失。

病原真菌与根结线虫对罗汉果的复合侵染研究

目的:探讨根结线虫与病原真菌复合侵染罗汉果植株,为防治提供依据。方法:通过组织分离与回接及形态鉴定的方法进行研究。结果:南方根结线虫为罗汉果根结线虫病的病原线虫;茄腐镰孢菌、尖孢镰孢菌、黑白轮枝孢菌是从发病部位分离到的主要菌体,这3种菌及它们的混合菌体均可侵染罗汉果植株,发病率分别为57.14%3、8.10%、47.62%、71.43%;回接试验表明南方根结线虫与这3种菌能复合侵染罗汉果,使植株病害发生更为严重。结论:南方根结线虫与病原真菌可复合侵染罗汉果植株,并提出"病虫同治"的防治建议。

新疆喀什辣椒轻斑驳病毒和黄瓜花叶病毒复合侵染的分子鉴定

2018-2019年,在新疆喀什地区调查时发现部分种植的辣椒植株上心叶发黄皱缩、卷曲,个别植株叶片呈现斑驳花叶状。为了明确引起新疆喀什辣椒病毒病的病毒种类,提取典型症状样品的总RNA,反转录得到cDNA,分别用辣椒轻斑驳病毒和黄瓜花叶病毒特异性引物进行RT-PCR检测,CMV和PMMoV特异引物分别扩增得到约735,472 bp的特异条带,阴性对照未扩增目的条带,核苷酸序列比对发现,分别与韩国西葫芦CMV分离物(GU327368.1)和日本辣椒PMMoV分离物(AB276030.1)序列同源性最高为95%,99%,结果表明,喀什地区辣椒疑似病毒病样本被CMV与PMMoV复合侵染。

山东烟台小麦土传病毒病由小麦黄花叶病毒和土传小麦花叶病毒相关病毒复合侵染所致

Analysis of ISEM, SDS PAGE, Western blot, Northern blot and RT PCR indicated that the soil borne mosaic disease occurred on winter wheat in Yantai district, Shandong Province, was caused by co infection of two different viruses. The filamentous virus was identified to be wheat yellow mosaic virus (WYMV) as it had a coat protein of 33kD, which was serologically related to WYMV, wheat spindle streak mosaic virus(WSSMV) and barley yellow mosaic virus (BaYMV), but not to barley mild mosaic virus(BaMMV) and soil borne wheat mosaic virus(SBWMV). In addition, DNA fragments specifically amplified from its cDNAs template with WYMV primers were identical to those amplified from the homologous template. The rod shaped virus was identified to be a SBWMV related virus as it had a coat protein of 19 kD, which was serologically related to SBWMV and TMV, but not to WYMV, WSSMV, BaYMV, BaMMV and three monoclonal antibodies to SBWMV. Its RNA1 (7.1kb) and RNA2 (3.6 kb) were respectively hybridized by cDNA probes of RNA1(p3H5) and RNA2(pJC2G6) of SBWMV, but no DNA fragments specifically amplified from cDNA template of its RNA with primers of SBWMV RNA 1 and RNA2.

ToCV和TYLCV复合侵染番茄后部分病毒基因序列分析及实时荧光定量PCR分析

番茄褪绿病毒病(ToCV)和番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)存在复合侵染的现象,其发病率逐年递增,成为一种新的威胁番茄产业的病毒病害。为了研究复合侵染样品中2种病毒的互作和基因变异情况,对天津番茄产区发生的TYLCV全基因组和ToCV的CP基因和HSP基因进行了克隆和序列分析。结果表明,与单独侵染样品进行比对,TYLCV的基因序列在复合侵染的样品中共有6处碱基发生了变异,分别为73位A→C、92位A→G、347位C→T、1 209位C→T、1 618位A→G、2 107位A→T,除73位和92位的变异未在编码区,其余的变异碱基均在ORF框内,其中1 209位为同义突变,其他均发生了错义突变。ToCV的CP基因有1处同义突变,ToCV的HSP基因共有4处碱基变异,其中826位由T→C和1 166位由G→A均为同义突变,1 395位和1 630位均由A→G,为错义突变。利用实时荧光定量PCR技术对单独侵染和复合侵染的番茄样品中TYLCV和ToCV病毒积累量进行分析。结果表明,在田间单独侵染和复合侵染的样品中, TYLCV的拷贝数差异不显著,ToCV的拷贝数在单独侵染和复合侵染的样品中差异也不显著。在复合侵染的样品中,TYLCV的拷贝数约为ToCV的262～436倍。

一种辣椒轻斑驳病毒和辣椒斑驳病毒复合侵染的线椒病毒病害分子鉴定

上海奉贤区发生的线椒病害其症状表现为斑驳、花叶,且果实扭曲畸形,严重影响了辣椒的产量和品质.通过电镜病毒粒子观察和RT-PCR检测,确定其毒源为辣椒斑驳病毒（pepper mottle virus,PepMoV）和辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus,PMMoV）复合侵染.根据它们的外壳蛋白（coatprotein,CP）核苷酸序列,在GenBank 上进行BLAST 比对,其同源性PepMoV 为85%-99%,PMMoV 为94%-99%.系统进化分析表明,PepMoV和PMMoV上海分离物变异均存在一定的地域相关性.这是首次在我国辣椒田间病毒病样中检测到这两种病毒的复合侵染.

沈阳市番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒复合侵染的分子鉴定

在辽宁省沈阳市辽中设施蔬菜产区采集到疑似感染番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)和番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)的番茄样品,利用ToCV的特异性引物ToC5/ToC6进行RT-PCR检测,结果从4份病样中检测到ToCV预期大小的特异片段。利用ToCV外壳蛋白(coat protein, CP)和热激蛋白(heat shock protein 70, HSP70)基因的特异性引物进行CP基因和HSP70基因扩增及序列测定,结果得到ToCV辽中分离物CP基因和HSP70基因全长分别为774bp(GenBank登录号:MF278016)和1665bp(GenBank登录号:MF278017),序列分析结果表明ToCV辽中分离物的CP核苷酸序列与北京ToCV分离物(KC887999)和河北的ToCV分离物(KP217196)的CP 核苷酸序列的相似性最高,均为99.87%;HSP70核苷酸序列与山东ToCV分离物(KC709510)的HSP70核苷酸序列的相似性最高,为99.76%。同时该样品利用背靠背引物TY-F/TY-R对TYLCV的DNA-A分子进行全基因序列扩增及序列测定,结果得到TYLCV辽中分离物的DNA-A分子全基因长度为2784 bp,序列分析结果表明TYLCV辽中分离物与山东TYLCV分离物(GU199587)的DNA-A分子全基因核苷酸序列的相似性为99.64%。从而证实了沈阳市辽中区的番茄受到ToCV与TYLCV复合侵染。

山东省甘薯病毒复合侵染的分子鉴定

为明确山东省甘薯病毒种类及发生现状,本研究对7个甘薯种植区进行调查及样品采集,通过RT-PCR/PCR技术分析山东省甘薯病毒种类及侵染类型。结果显示,140份甘薯样品中感染甘薯病毒的样品有133份,共检出7种甘薯病毒,其中甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)检出率最高;由多种病毒复合侵染的甘薯样品占77%,单个甘薯样品中最多检出6种病毒,复合侵染组合共33种。表明山东甘薯病毒复合侵染情况严重,是威胁甘薯生产发展的重要因素。

复合侵染瓠瓜的两种病毒的互作研究

小西葫芦黄化花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)和黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)是侵染葫芦科植物的主要病毒。本研究在三种供试品种的瓠瓜上单独和混合接种ZYMV和CMV,对各处理的病情和病毒积累量进行分析。两种病毒在三种瓠瓜供试品种上均表现明显的致病性。ZYMV和CMV的复合侵染加重瓠瓜发病症状,表现为协生作用。应用酶联免疫吸附法(ELISA)对三种瓠瓜上ZYMV与CMV进行检测并分析了病毒的积累量。结果表明,复合侵染情况下CMV的积累高于单独侵染,与致病性检测结果一致。

尖孢镰刀菌及欧文氏杆菌复合侵染引起的半夏腐烂病研究

以家种健康半夏、发毛半夏和腐烂半夏为材料,对引起半夏腐烂病的尖孢镰刀菌和欧文氏杆菌进行分离、提纯、镜检、回接和药敏试验。结果在家种健康半夏和发毛半夏中分离出尖孢镰刀菌,在发毛半夏和腐烂半夏中分离到欧文氏杆菌。通过对2种菌回接,半夏接种尖孢镰刀菌腐烂病发病率为0,发芽率75%;接种欧文氏杆菌腐烂病发病率为20%,发芽率60%;而先接种尖孢镰刀菌,过3 d后再接种欧文氏杆菌的腐烂病发病率为90%,发芽率20%。药敏试验和盆栽试验发现,尖孢镰刀菌对三唑类农药戊唑醇敏感,欧文氏杆菌对乙蒜素敏感,并具有很好的防治效果。综上,半夏腐烂病是由尖孢镰刀菌和欧文氏杆菌复合侵染引起。