检测猪链球菌2型胞外因子(EF)的PCR方法的建立

根据猪链球菌 2型的ef基因和ef 基因合成了一对可扩增长度为 6 2 6bp目的片段的引物 ,成功地建立了检测胞外因子 (EF)的PCR方法。用HaeⅡ内切酶进行酶切 ,获得了与预期一致的 35 4bp和 2 72bp的两个片段。并进行了PCR的特异性试验和敏感性试验。对马腺疫链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌和猪肺炎霉形体的PCR检测结果均呈阴性 ;检测的敏感度可达 10 0个细菌。另外 ,对 9株猪链球菌 2型菌株进行了检测 ,7株呈EF阳性 ,1株呈EF 阳性 ,1株呈EF阴性 ;对 15份正常屠宰猪扁桃体分离物的检测结果 1份为阳性。实验结果表明此法特异性和敏感性均很高 。

检测猪链球菌2型的胞外因子(EF)的PCR方法的建立

根据猪链球菌２型的ｅｆ基因和ｅｆ基因合成了一对可扩增长度为６２６ｂｐ目的片段的引物，成功地建立了检测胞外因子（ＥＦ）的 ＰＣＲ方法。用 Ｈａｅ Ⅱ内切酶进行酶切，获得了与预期一致的 ３５４ｂｐ和 ２７２ｂｐ的两个片段。并进行了 ＰＣＲ的特异性试验和敏感性试验。对马腺疫链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌和猪肺炎支原体的ＰＣＲ检测结果均呈阴性；检测的敏感度可达１００个细菌。另外，对９株猪链球菌２型菌株进行了检测，７株呈ＥＦ阳性，１株呈ＥＦ阳性，１株呈ＥＦ阴性；对１５份正常屠宰猪扁桃体分离物的检测结果是１份为阳性。结果表明此法特异性和敏感性均很高，可作为ＥＦ快速诊断和流行病学调查的手段。

猪链球菌2型胞外因子短片段的原核表达及其免疫保护力

以江苏分离株HA9801基因组DNA为模板,扩增猪链球菌2型(SS2)胞外因子ef基因的1423～2203bp片段,并将其亚克隆至表达载体pGEX-4T-1上,构建了重组质粒pGEX-4T-1-ef。将鉴定阳性的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),0.5mmol/LIPTG诱导8h,表达的融合蛋白rGST-sEF大小为56ku,以包涵体形式存在。Western-blotting显示,rGST-sEF能与全菌兔抗血清发生特异性反应。用自制rGST-sEF亚单位疫苗免疫新西兰兔,以最小致死量HA9801攻击,保护率为60%。结果表明,表达的融合蛋白rGST-sEF具有良好的免疫原性和免疫反应性。

猪链球菌2型胞外因子的融合表达及多克隆抗血清的制备

根据GenBank SS2(Streptococcus suis serotype 2,SS2)epf基因序列设计引物,克隆epf基因片段并进行序列分析,同时亚克隆到GST融合蛋白表达载体pGEX4T-2上,将构建的原核表达质粒pGEX4T-2-epf导入大肠杆菌(Eacterium coli)TG1中,诱导融合蛋白EF-GST的表达。经亲和层析、凝血酶切割后,获得纯化的EF为抗原蛋白,用其免疫家兔制备抗血清,成功制备了EF蛋白及其特异的多克隆抗体,为进一步研究EF的功能提供了有用的工具。

miR-892a通过细胞外因子/β-连环蛋白信号通路调控对前列腺癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨miR-892a在前列腺癌细胞中表达情况及其过表达对细胞增殖、凋亡的影响。方法实验分为3组:空白对照组(BC)即BC组,转染空载病毒阴性对照组(NC)即miR-NC组,转染miR-892a过表达慢病毒序列为miR-892a mimic组,每组6个复孔。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-892a在前列腺癌细胞中的表达。慢病毒转染建立过表达miR-892a的前列腺癌细胞系。采用CCK-8、细胞流式检测过表达miR-892a对细胞增殖能力及凋亡能力的影响。qRT-PCR检测细胞外因子(Wnt)、β-连环蛋白(β-Catenin)、c-myc基因及转录因子SOX5分子mRNA的表达水平。结果人前列腺癌细胞(DU145、PC3)中miR-892a的表达水平显著低于人正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)(P<0.05);慢病毒转染之后miR-892a mimic组的miR-892a表达水平显著高于BC组及miR-NC组(P<0.05);miR-892a mimic组24、48、72 h的细胞增殖活力均显著低于BC组及miR-NC组(P<0.05);miR-892a mimic组的前列腺癌细胞凋亡率显著高于BC组和miR-NC组(P<0.05);miR-892a mimic组的Wnt、β-Catenin、c-myc基因及转录因子SOX5的mRNA表达水平显著低于BC组及miR-NC组(P<0.05)。结论前列腺癌中的miR-892a水平下调,过表达miR-892a能抑制前列腺癌细胞的增殖、促进凋亡,其机制可能与Wnt/β-Catenin信号通路相关。

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、基质金属蛋白酶-9和赖氨酸去甲基化酶6B在浸润性乳腺癌组织中的表达及其病理诊断价值

目的探讨浸润性乳腺癌组织中细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和赖氨酸去甲基化酶6B(KDM6B)蛋白的表达及其与临床病理特征的关系,并分析3种蛋白的相关性及其在浸润性乳腺癌病理诊断中的价值。方法选择2014年1月至2017年12月河南中医药大学第五临床医学院/郑州人民医院病理科保存的124例浸润性乳腺癌患者的手术切除活检标本为研究对象,另选取同期保存的低级别导管内癌组织标本20例、高级别导管内癌组织标本27例、距离浸润性乳腺癌>1 cm处癌旁组织标本22例作为对照组。采用免疫组织化学法检测乳腺癌旁组织、低级别导管内癌、高级别导管内癌及浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的表达。分析EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的相对表达量与浸润性乳腺癌临床病理特征的关系;采用Spearman法分析浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN、MMP-9、KDM6B蛋白的相关性,受试者操作特征(ROC)曲线评估EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白对浸润性乳腺癌的诊断价值。结果高级别导管内癌和浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN、MMP-9蛋白的相对表达量显著高于乳腺癌旁组织和低级别导管内癌组织(P<0.05),KDM6B蛋白的相对表达量显著低于癌旁组织和低级别导管内癌组织(P<0.05);浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN、MMP-9蛋白的相对表达量显著高于高级别导管内癌组织(P<0.05),KDM6B蛋白的相对表达量显著低于高级别导管内癌组织(P<0.05);癌旁组织与低级别导管内癌组织中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。EMMPRIN、KDM6B蛋白相对表达量与浸润性乳腺癌患者的年龄、肿瘤部位和肿瘤直径无关(P>0.05),MMP-9蛋白相对表达量与浸润性乳腺癌患者的年龄和肿瘤部位无关(P>0.05)。EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的相对表达量与浸润性乳腺癌的世界卫生组织(WHO)分级、淋巴结转移、TNM分期有关(P<0.05),MMP-9蛋白的相对表达量与浸润性乳腺癌的肿瘤直径有关(P<0.05)。浸润性乳腺癌WHO分级Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级中,EMMPRIN、MMP-9蛋白的相对表达量依次升高,KDM6B蛋白的相对表达量依次降低(P<0.05);浸润性乳腺癌淋巴结有转移组EMMPRIN、MMP-9蛋白的相对表达量显著高于无淋巴结转移组(P<0.05),KDM6B蛋白的相对表达量显著低于无淋巴结转移组(P<0.05);TNM分期Ⅲ~Ⅳ期组EMMPRIN、MMP-9蛋白的相对表达量显著高于Ⅰ~Ⅱ期组(P<0.05),KDM6B蛋白的相对表达量显著低于Ⅰ~Ⅱ期组(P<0.05)。在浸润性乳腺癌肿瘤直径≤2 cm、2~5 cm、>5 cm组中MMP-9蛋白的相对表达量依次升高(P<0.05)。Spearman相关性分析显示,浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN与MMP-9蛋白的表达呈显著正相关(r=0.990,P=0.000),EMMPRIN与KDM6B蛋白的表达呈显著负相关(r=-0.606,P=0.000),MMP-9与KDM6B蛋白的表达呈显著负相关(r=-0.612,P=0.000)。ROC曲线分析显示,EMMPRIN蛋白诊断浸润性乳腺癌的曲线下面积(AUC)为0.875[95%置信区间(CI):0.823~0.926,P<0.05],最佳界值为10.043,敏感度为79.0%,特异度为76.8%;MMP-9蛋白诊断浸润性乳腺癌的AUC为0.863(95%CI:0.808~0.917,P<0.05),最佳界值为10.070,敏感度为74.2%,特异度为76.8%;KDM6B蛋白诊断浸润性乳腺癌的AUC为0.267(95%CI:0.196~0.338,P<0.05),最佳界值为11.003,敏感度为71.0%,特异度为98.6%。结论EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白与浸润性乳腺癌的发生发展有关,检测EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的表达有助于浸润性乳腺癌的病理诊断及其浸润转移的临床判断。

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与心血管疾病

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)属于免疫球蛋白超家族的单通道跨膜糖蛋白受体,表达于正常及炎症组织中,在生理及病理活动中发挥重要作用。研究发现EMMPRIN在动脉粥样硬化、心肌梗死、心肌再灌注损伤等心血管疾病中表达水平增加,对心血管疾病的发生和进展有着重要作用,EMMPRIN可能成为心血管疾病潜在的治疗靶点。

猪链球菌2型四川人源分离株ZYH24细胞外蛋白因子的原核表达及活性分析

目的克隆、表达猪链球菌2型四川人源分离株ZYH24细胞外蛋白因子基因片段,分析蛋白活性。方法根据GenBank S.suis2epf基因序列设计引物,克隆ZYH24株epf基因片段并进行序列分析;构建原核表达质粒pGEX4T-2-epf,在大肠杆菌中诱导带有谷胱苷肽转移酶(GST)标签的融合蛋白EF-GST的表达;亲和层析法纯化融合蛋白EF-GST,用凝血酶切除重组蛋白中的GST,获得纯化的EF抗原;SDS-PAGE和Western blot分析诱导表达及纯化的重组蛋白。结果序列分析表明,获得的epf基因片段长895bp;原核表达的融合蛋白EF-GST分子量约62000,凝血酶处理后的EF抗原分子量约35000,两者均可与制备的EF多克隆抗血清发生特异性反应。结论成功克隆了人源分离株ZYH24epf基因片段,在原核系统实现高效的功能性表达,为开展EF蛋白的相关研究奠定了基础。

近百年全球气候变化与外强迫因子信号检测

利用小波分析方法 ,辅之以滞后相关分析、解释方差分析及位相对应比较方法 ,得到了气温变化及ENSO活动在各尺度层次上的变化 ,突变点位置及特征尺度 ,并确定了太阳活动、火山活动和温室效应等外强迫因子对气温及ENSO的影响尺度、幅度及响应时间。

包含外强迫因子的大气气溶胶数浓度的预测

利用慢特征分析(Slow Feature Analysis,SFA)方法提取大气气溶胶时间序列的外强迫因子信息,并将此外强迫因子信息嵌入到预测模式中,建立一个包含提取外强迫因子信息的预测模式.利用该方法对2011年6月1日至2011年9月14日黄山山底的每小时大气气溶胶数浓度时间序列进行预测试验分析.结果表明,当提前预报一步时,平稳性模式的预测结果与实际观测数据的相关系数为0.6982,而单一外强迫模式的相关系数为0.7390,强迫模式的相关系数是0.7475,外强迫的加入可以有效的提高预测技巧.

猪链球菌2型胞外蛋白因子基因片段的克隆与表达

根据猪链球菌 2型 (Streptococcus suis type 2 )胞外蛋白因子 (extracellular factor protein,EF)基因序列 ,设计和合成 1对引物 ,以猪链球菌 2型江苏 98分离株 HA980 1的基因组 DNA为模板 ,通过 PCR技术 ,扩增 epf基因 12 0 7～16 75 bp序列 ,并按正确的阅读框架定向克隆到表达载体 p GEX- 6 p- 1中谷胱甘肽转移酶 (GST)基因的下游 ;将重组质粒转化入大肠杆菌 BL2 1 株 ,经 IPTG诱导可表达相对分子质量约为 4 10 0 0的融合蛋白。用 EF抗血清进行的免疫印迹分析表明 ,含有 epf基因 12 0 7～ 16 75 bp序列编码的肽段的融合蛋白不能被 EF抗血清识别。

外强迫因子变化在2003年夏季旱涝预测中的作用

利用中国科学院大气物理研究所大气科学和地球流体力学数值模拟实验室研发的全球海洋-大气-陆面过程气候系统耦合模式(IAP/LASG GOALS 4.0),对比分析了考虑和不考虑气候的外强迫因子(太阳活动、温室气体及硫酸盐气溶胶)变化对2003年夏季中国区域的短期气候预测的影响.结果发现,由于外强迫因子变化的影响,模式模拟的中国区域2003年夏季降水距平的分布比不考虑这种变化时更接近实况,它有效地改善了无外强迫变化时模式模拟预测的中国区域降水不真实偏大的缺点,使一些地区的模拟降水量值减小,范围扩大,位置北抬.更重要的是,由于考虑了外强迫的变化,GOALS耦合模式很好地模拟出了2003年夏季淮河流域较大的降水正距平区,同时相应的500 hPa环流场的模拟也有较大的改进.

细胞外基质因子检测对肝纤维化早期诊断的预测价值

目的 :通过对多种细胞外基质因子的检测 ,创建出一套无创、简便易行的诊断肝纤维化的方法。方法 :以肝活检为肝纤维化诊断的金标准 ,同时检测肝纤维化和正常对照者血清中的透明质酸、层黏连蛋白、纤黏连蛋白、血清IV型胶原、血清III型前胶原氨基端肽和血清脯氨酸肽酶 ,并采用多元Logistic回归分析建立诊断方程。结果 :肝硬化组和慢性乙型肝炎 (重度 )以上各指标均无显著差别 ,慢性乙型肝炎 (重度 ) >慢性乙型肝炎 (中度、轻度 ) >正常对照。透明质酸、层黏连蛋白、血清IV型胶原、血清III型前胶原氨基端肽和血清脯氨酸肽酶各因素均进入回归方程。以回归方程预测的肝纤维化T值大于 0 .95者做判断肝纤维化的标准 ,结果该法诊断的灵敏度和特异度分别为 86 .7%和 80 .0 % ,符合率为 85 %。结论 :肝细胞基质透明质酸、层黏连蛋白、纤黏连蛋白、血清IV型胶原、血清III型前胶原氨基端肽和血清脯氨酸肽酶是诊断肝纤维化的敏感指标 。

联合检测多种细胞外基质因子对肝纤维化的诊断

目的 创建出一套无创、简便易行的诊断肝纤维化的方法。方法 以肝活检为肝纤维化诊断的金标准 ,同时检测肝纤维化和正常对照者血清中的透明质酸、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、血清IV型胶原、血清III型前胶原氨基端肽和血清脯氨酸肽酶 (以下分别简称HA、LN、FN、IV -C、PⅢP和PLD) ,并采用多元Logistic回归分析建立诊断方程。 结果 肝硬化组和慢性乙型肝炎 (重度 )以上各指标差别均无显著性意义 ,慢性乙型肝炎 (重度 ) >慢性乙型肝炎 (中度、轻度 ) >正常对照。HA、、LN、PⅢP、IV -C、PLD各因素均进入回归方程。以回归方程预测的肝纤维化T值大于 0 95者做判断肝纤维化的标准 ,结果该法诊断的灵敏度和特异度分别为 86 7%和 80 0 % ,符合率为 85 %。结论 肝细胞基质HA、LN、PⅢP、IV -C、PLD是肝纤维化的诊断的敏感指标 。

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与宫颈癌发生发展的关系

背景与目的:细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN,CD147)属于免疫球蛋白家族,在肿瘤细胞中表达增高。EMMPRIN表达增加与肿瘤浸润、转移、耐药以及某些肿瘤细胞的生存相关,但与宫颈癌的关系尚未阐明。本研究旨在确定EMMPRIN是否与宫颈癌发生、发展有关。方法:采用免疫组化法检测21例慢性宫颈炎、22例宫颈上皮内瘤变3级(cervical intraepithelial neoplasia,CIN3)、82例宫颈浸润癌原发灶和22例转移淋巴结中EMMPRIN的表达,并比较EMMPRIN在宫颈病变不同阶段的表达。结果:随着宫颈病变的发展,EMMPRIN过表达阳性率明显升高:宫颈浸润癌中过表达阳性率(52.4%)>CIN3(21.3%)>慢性宫颈炎(0%)(P=0.000)。宫颈原发灶EMMPRIN的过表达与盆腔淋巴结转移呈正相关,有转移组原发灶EMMPRIN过表达为72.7%,无转移组为45.0%,两组间差异有显著性(P=0.026)。在有淋巴结转移的患者中,原发灶和转移灶中EMMPRIN的过表达差异无显著性(72.7%vs54.5%,P=0.210)。EMMPRIN过表达与其他临床病理因素如临床分期、病理类型、组织学分级、脉管浸润、肿瘤大小、浸润深度等无明显相关性。采用Kaplan-Meier方法和Log-Rank检验,单因素分析生存率,宫颈癌EMMPRIN的过表达无任何预后价值,淋巴结转移、深肌层浸润和脉管侵犯提示生存预后差。所有上述因素进入COX比例风险模型多因素分析,采用BackwardLR方法,显示淋巴结转移与患者生存相关(P=0.006;HR=0.380;95%可信区间:0.190～0.763)。结论:EMMPRIN与宫颈癌侵袭转移相关,在宫颈癌的发生、发展中起着重要作用。

外消旋聚乳酸复合神经生长因子缓释导管促周围神经再生的形态学研究

目的建立外消旋聚乳酸复合神经生长因子(poly-D,L-lacticacid/nervegrowthfactor,PDLLA/NGF)可吸收性缓释导管桥接修复大鼠坐骨神经缺损的动物模型,观察复合导管对大鼠坐骨神经缺损再生的促进作用。方法利用溶剂挥发法制备PDLLA单纯导管和PDLLA/NGF缓释导管,每根缓释导管含NGF450U。SD大鼠40只随机分成4组,每组10只,切除中段坐骨神经10mm之后分别行自体神经移植(A组)、单纯导管桥接(B组)、单纯导管加一次性给药(C组)、PDLLA/NGF缓释导管桥接(D组)修复坐骨神经,除A组外,均保留10mm缺损。术后3个月观察神经再生情况,比较各组光镜、电镜及图像分析等指标。结果术后3个月导管与周围组织粘连松,并开始降解,但外形仍保持完整。再生神经均顺利通过导管腔,组织学观察A组和D组内神经纤维数目多,大小均匀,成熟良好;B组和C组纤维结缔组织多,神经纤维细小,髓鞘薄。图像分析显示除神经纤维计数D组高于A组外,A组和D组在纤维直径、轴突直径和髓鞘厚度方面差异均无统计学意义(P>0.05),并明显优于B组和C组(P<0.05)。结论PDLLA/NGF缓释导管能够有效促进大鼠坐骨神经缺损再生,组织学观察指标接近自体神经移植。

养殖场环境中链球菌胞外蛋白因子PCR检测方法建立

为了快速检测养殖场环境中链球菌的污染情况,试验利用链球菌胞外蛋白因子核苷酸特异序列设计引物,建立养殖场环境中链球菌的PCR快速检测方法。结果表明:从链球菌标准阳性株中获得大小为197 bp的特异性目的片段,而肠毒性大肠杆菌、沙门杆菌、金黄色葡萄球菌等均不能检出;10倍系列稀释结果显示该方法敏感性可达到单个菌株;在处理环境样品时,能检测到4×103cfu/g的环境链球菌。说明该方法具有简单、快速、准确的特点,大大缩短了检测环境中致病性猪链球菌的时间。

舌鳞癌组织细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达及其与预后的关系

目的:研究舌鳞癌组织中细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)的表达及其与舌癌患者临床病理特征和生存期之间的相关性。方法:应用SP免疫组织化学法,检测68例舌鳞癌组织及相应的癌旁组织中EMMPRIN的表达情况,并对68例舌鳞癌患者进行随访观察。应用非参数秩和检验检测两个独立样本的EMMPRIN的表达差异,应用SPSS 13.0软件包进行生存分析;应用Cox比例风险模型分析预后。结果:EMMPRIN在舌鳞癌组织中的表达阳性率高于相应的癌旁组织(P<0.05)。舌鳞癌组织中EMMPRIN的表达与肿瘤大小和临床分期密切相关,与性别、年龄、淋巴结转移和肿瘤病理分化程度不相关。Cox比例风险模型多因素预后分析显示,EMMPRIN表达是影响舌鳞癌患者预后的独立因素。结论:EMMPRIN可以作为舌鳞癌预后判断的参考指标,并有望成为口腔癌生物治疗的潜在靶点。

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子在巨噬和泡沫细胞中的表达

目的观察细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)在单核向巨噬和泡沫细胞分化过程中的表达变化。方法体外诱导THP-1单核细胞分化为巨噬和泡沫细胞,应用Real-time RT-PCR和Western blot测定EMMPRIN基因和蛋白表达。结果单核细胞分化为巨噬细胞后EMMPRIN mRNA和蛋白表达均显著增加,当进一步分化为泡沫细胞时,EMMPRIN的表达与巨噬细胞比较无显著性差异。结论单核细胞向巨噬细胞的分化诱导EMMPRIN表达,而进一步向泡沫细胞分化对其表达无影响。

用外推容量因子法测定药物的疏水性

本文利用不同体积分数的甲醇-水作流动相,用外推容量因子法测定20种不同结构类型药物的疏水性,该法操作简便、快速、测定疏水性范围宽,相关性好。