二甲胺四环素拮抗新霉素致小鼠耳蜗外毛细胞损伤的机制研究

目的通过体内实验探究二甲胺四环素对新霉素导致外毛细胞损伤的保护作用及其机制。方法选用C57小鼠45只,雌雄不限,将小鼠随机分为对照组,新霉素处理组及新霉素+二甲胺四环素处理组,每组15只,测试3组小鼠听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)阈值;通过免疫荧光染色,比较3组外毛细胞存活情况;采用cleaved caspase-3染色及原位末端标记法(TdT-mediated dUTP-nick end labeling assay,TUNEL)染色,比较3组外毛细胞凋亡情况。结果新霉素+二甲胺四环素处理组ABR阈值在各个频率均显著低于新霉素处理组,且ABR阈值在各个频率比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。基底膜铺片显示,二甲胺四环素处理能显著减轻新霉素导致的外毛细胞损失。在对照组基底膜中,未检测到cleaved caspase-3和TUNEL阳性细胞;新霉素处理组,cleaved caspase-3和TUNEL阳性细胞数量显著上升;新霉素+二甲胺四环素处理组,cleaved caspase-3和TUNEL阳性细胞数量显著下降。结论二甲胺四环素对新霉素导致的外毛细胞损伤具有显著的保护作用,且这种保护作用是通过抑制外毛细胞凋亡通路而介导的。

水杨酸钠对小鼠耳蜗单离外毛细胞Prestin分布的影响

目的探讨水杨酸钠对小鼠听性脑干反应(ABR)阈值和耳蜗外毛细胞动力蛋白(Prestin)分布的影响。方法将28只成年健康小鼠随机分为4组:生理盐水对照组(A组)、水杨酸钠4d组(B组)、水杨酸钠8d组(C组)、水杨酸钠16d组(D组)。水杨酸钠200mg/kg·d,经腹腔注射,采用美国TDT系统测量听性脑干反应(ABR)阈值,荧光显微镜下观察单离外毛细胞Prestin的分布。结果 1听功能检测显示:与A组比较,B组小鼠ABR阈值升高,但变化尚不显著(P>0.05);C组和D组小鼠ABR阈值明显提高,与A组比较有显著性差异(P<0.05);D组小鼠ABR阈值与C组比较有所降低,但无显著性差异(P>0.05)。2荧光显微镜下显示:A组单离外毛细胞侧膜和底部膜可见明显的Prestin抗体阳性染色,B、C、D组Prestin在外毛细胞膜上分布不均匀,主要分布在外毛细胞侧膜。B组底部细胞膜可见少量阳性染色,C、D组底部细胞膜少量或无Prestin的阳性染色。结论水杨酸钠致小鼠听力下降可能与其导致的外毛细胞底部膜Prestin表达异常有关。

庆大霉素及其代谢产物对外毛细胞内游离钙浓度的影响

目的 探讨庆大霉素（ＧＭ）耳毒性与耳蜗外毛细胞（ＯＨＣ）内游离钙（［Ｃａ２＋］ ｉ）之间的关系。方法 离体耳蜗ＯＨＣ经钙荧光指示剂Ｆｌｕｏ－３负载后，用激光扫描共聚焦显微镜测定高钾溶液、ＧＭ、ＧＭ代谢产物等对ＯＨＣ［Ｃａ２＋］i的影响。结果ＧＭ使［Ｃａ２＋］i短暂下降，并阻滞高钾溶液引起的钙内流；ＧＭ代谢产物则使［Ｃａ２ ＋］ｉ持续升高，对高钾引起的钙内流无明显影响。结论 ＧＭ耳毒性与外毛细胞［Ｃａ２＋］i持续升高有关。

川芎嗪抗链霉素耳毒性作用及其对豚鼠耳蜗外毛细胞钾通道的影响(英文)

本文旨在研究川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)拮抗链霉素耳毒性作用及其对豚鼠耳蜗外毛细胞K^+通道的影响,探讨TMP拮抗链霉素耳毒性的离子通道机制。60只豚鼠随机分为6组,应用听觉脑干反应(auditory brainstem response,ABR)技术检测豚鼠ABR听阈,观测TMP的抗链霉素耳毒作用;并采用全细胞膜片钳技术观察TMP对耳蜗外毛细胞Ca^(2+)敏感K^+电流的影响。结果显示,TMP明显降低链霉素导致的豚鼠ABR听阈升高,提示TMP具有抗链霉素耳毒性作用;TMP能明显增大豚鼠耳蜗外毛细胞Ca^(2+)敏感K^+电流,并呈浓度依赖关系。结果提示,TMP通过增大K^+通道电导而拈抗链霉素耳毒性作用。

外源性谷氨酸对豚鼠耳蜗内、外毛细胞易损性的比较

目的观察外源性谷氨酸对豚鼠耳蜗电位及耳蜗内、外毛细胞的影响。方法将健康豚鼠30只随机分为3组,应用豚鼠全耳蜗灌流技术,分别经耳蜗灌流人工外淋巴液和不同浓度的谷氨酸2小时,记录灌流前和灌流后的耳蜗电位(CM、CAP);同时应用透射电镜技术观察灌流前后耳蜗形态学的变化。结果灌流人工外淋巴液后豚鼠耳蜗电位及形态学无改变;灌流10 mmol/L谷氨酸后CM幅度虽有下降,其非线性特点无改变,CAP阈值平均升高了35 dB;灌流20 mmol/L谷氨酸后CM幅度明显下降但仍保持其非线性特点,CAP阈值平均升高了48 dB,灌流谷氨酸后耳蜗内毛细胞及传入神经纤维出现空化。结论谷氨酸是耳蜗主要的兴奋性传入神经递质,应用外源性谷氨酸可以引起耳蜗内毛细胞及传入神经的损伤,但对耳蜗外毛细胞无影响。

依托咪酯对氯化钾和咖啡因诱发豚鼠耳蜗外毛细胞内钙离子移动的影响

目的观察不同浓度依托咪酯对氯化钾和咖啡因诱发的豚鼠耳蜗外毛细胞内钙离子移动的影响,探讨其对听觉外周感受器(耳蜗)作用的可能机制。方法①30个活性良好的外毛细胞随机分为3组(n=10):对照组(C组)、低浓度依托咪酯组(E1组)、高浓度依托咪酯组(E2组),用Fluo-3AM荧光指示剂染色,分别给予Hanks液、50、100μmol/L依托咪酯预处理20 min。在激光共聚焦显微镜下动态观察各组预处理前、后以及40 mmol/L氯化钾诱发的细胞内钙荧光染色强度峰值的变化。②分组同①,观察各组预处理前、后以及20 mmol/L咖啡因诱发的细胞内钙荧光染色强度峰值的变化。结果①C组加入40 mmol/L氯化钾后细胞内钙荧光强度峰值从基础值105上升至221(P<0.01),E1组从基础值101上升至187(P<0.01),E2组从基础值103上升至150(P<0.01),E1组、E2组峰值分别较C组下降了近15.4%(P<0.05)和32.1%(P<0.01)。②C组加入20 mmol/L咖啡因后细胞内钙荧光强度峰值从基础值112上升至154(P<0.05),E1组从基础值103上升至148(P<0.05),E2组从基础值104上升至143(P<0.05)。但E1组和E2组细胞内钙荧光强度峰值较C组差异无显著性意义(P>0.05)。结论依托咪酯可浓度依赖性地抑制耳蜗外毛细胞电压依赖性Ca2+通道开放,减少胞外钙内流,降低耳蜗外毛细胞内钙离子浓度,而对内质网Ryanodine型钙库无明显影响。

手机微波辐射对豚鼠耳蜗外毛细胞膜电位的影响

目的探讨手机微波辐射对豚鼠耳蜗外毛细胞膜电位的影响。方法取成年豚鼠20只随机分为对照组和辐射组,每组各10只。对照组不做任何处理;辐射组:距豚鼠右侧耳廓2cm处对辐射组豚鼠进行手机微波辐射,辐射时间分别为1、6、12、24和48h,然后分别于各时间点随机活杀两组中的豚鼠各2只,取出听泡,分离耳蜗外毛细胞,用2 000Hz纯音进行不同强度的声刺激,观察离体单个外毛细胞(OHC)膜电位的变化特征。结果对照组离体单个OHC予2 000Hz、10dB HL纯音刺激时,于第40s细胞内荧光值开始升高,并于第50s达到峰值(1.112u),随后细胞内荧光值开始回落,于第60s至最低值(1.000u)。辐射组微波辐射1小时后,OHC细胞膜的去极化和复极化时间明显增加,并且不能完全去极化和复极化;辐射6和12h后,随着间断的声刺激可见OHC内荧光值缓慢上升,辐射6小时组之毛细胞于第70s荧光值达峰值(1.100u),而辐射12小时组之毛细胞于第90s荧光值达峰值(1.050u),随后整条曲线呈微上升趋势;辐射24和48h后,经过声刺激,曲线呈微上升、微下降波动,无明显峰值及回落。结论长时间的手机微波辐射能导致离体豚鼠耳蜗OHC膜离子通透性的改变,影响OHC膜电位的形成及细胞去极化、复极化,从而导致离体OHC膜电位对不同强度纯音刺激的敏感性逐渐降低。

应用胰蛋白酶分离豚鼠耳蜗外毛细胞

目的 :采用胰蛋白酶孵育后机械分离法以获得单离的豚鼠耳蜗外毛细胞。方法 :豚鼠被迅速断头处死 ,暴露耳蜗 ,在解剖显微镜下去除耳蜗侧壁 ,切取第三、四回耳蜗 ,经胰蛋白酶消化并轻轻吹打 ,以获得单离的豚鼠耳蜗外毛细胞。静置后在倒置相差显微镜下观察。结果 :本法每侧耳分离出活性好的外毛细胞约 4 0～ 90个 ,能存活 5小时左右。结论 :此技术能提供足量的单离毛细胞 。

豚鼠耳蜗内毛细胞、外毛细胞及外指细胞钙成像

用ｆｌｕｏ－３／ｆｕｒａ－ｒｅｄ荧光比值作细胞内游离钙指标，用激光扫描共聚焦显微镜测定豚鼠耳蜗分离的内、外毛细胞及外指细胞的游离钙，并利用钙成像技术进行细胞形态计量。单个外毛细胞呈试管状。内毛细胞呈烧瓶状，有明显的颈部。外指细胞分为体部及指状突部。毛细胞的胞内游离钙浓度明显高于外指细胞。毛细胞的胞质、胞核及表皮板的游离钙浓度不同。外指细胞的细胞体与指状突的游离钙浓度也不同。本研究认为，有无颈部为区别分离的内、外毛细胞的重要标准，外指细胞可凭借其特异的指状突结构以资识别。内耳毛细胞及外指细胞胞内游离钙分布的不均一性可能与各部位生理功能不同有关。

外毛细胞基底侧膜动力蛋白分布均一性的研究

目的探讨OHC基底部是否存在动力蛋白(Prestin)的表达及其在侧膜三层结构中的定位。方法分别取正常C57小鼠、Wistar大鼠及豚鼠耳蜗的单离外毛细胞,在激光共聚焦显微镜下,利用Prestin特异性抗体与细胞膜标记di-8-ANEPPS双染,对Prestin在单离OHC上的表达与分布情况进行观察。结果OHC基底侧膜存在Prestin抗体的阳性染色,OHC底端亦见阳性染色;②与细胞膜标记di-8-ANEPPS染色相比,Prestin抗体的阳性染色位于细胞膜的外侧;③经低渗细胞外液处理后,OHC侧膜中的质膜层可与内层表皮下池(subsur-fac cisternae,SSC)和中层质膜下小梁(cortical lattice,CL)分离,在激光共聚焦显微镜下,外毛细胞膜最外层的质膜层上可见明显的Prestin抗体阳性染色。结论动力蛋白(Prestin)分布于外毛细胞膜中最外层的质膜层上,在细胞基底部细胞膜上亦有表达。

丁胺卡那霉素诱发豚鼠耳蜗外毛细胞凋亡的实验研究

目的 探讨氨基糖苷类抗生素作用于耳蜗时外毛细胞凋亡现象及其凋亡发生特点。方法 用一定剂量的丁胺卡那霉素对 15只豚鼠行耳蜗造模后利用光镜、TUNEL标记技术 (teminal-deoxynucleotidytransferasemediatedd -UTPnick -endlabeling)原位检测凋亡发生。结果 肌注丁胺卡那霉素 1d后即可诱发豚鼠耳蜗底转外毛细胞发生凋亡 ,随着用药时间延长 ,其余各转外毛细胞亦发生凋亡 ,甚至出现部分外毛细胞丢失现象。结论 氨基糖苷类抗生素作用于耳蜗系统时可引起外毛细胞凋亡 ,细胞凋亡是豚鼠耳蜗听毛细胞损伤的一条途径 ;

水杨酸钠对豚鼠耳蜗单离外毛细胞游离钙浓度影响及其调控机制研究

目的 观察水杨酸钠对豚鼠耳蜗外毛细胞 (outerhaircells,OHC)内游离钙浓度 [Ca2 + ]i的影响 ,并对钙通道调控药物的拮抗作用进行观察 ,以深入探讨水杨酸钠耳毒性的分子生物学机制。方法 豚鼠全身麻醉后断头活杀 ,酶 机械法分离获得耳蜗单离OHC。 10 μmol/L的Fluo 3/AM负载30min后用ACASUltima型激光扫描共聚焦显微镜观察不同药物灌流下OHC[Ca2 + ]i的变化。结果 OHC在标准细胞外液灌流过程中 [Ca2 + ]i保持稳定。 1mmol/L水杨酸钠灌流致 8/ 10个细胞的 [Ca2 + ]i明显升高。无钙细胞外液中灌流亦有 10 / 10个细胞 [Ca2 + ]i明显的升高。经 3mmol/L利多卡因作用1h后 ,水杨酸钠灌流不能使细胞 [Ca2 + ]i升高 (n =10 )。盐酸氟桂嗪可以明显阻断水杨酸钠导致的OHC[Ca2 + ]i升高效应 (3/ 12细胞的 [Ca2 + ]i升高 ) ,而尼莫地平无此效应 (7/ 7细胞的 [Ca2 + ]i升高 )。结论 水杨酸钠可以导致OHC[Ca2 + ]i明显增加 ,OHC[Ca2 + ]i升高来源于细胞内钙库的动员和释放。使细胞内 [Ca2 + ]i升高可能是水杨酸钠的耳毒性机制之一。

用共聚焦显微镜观察ACh及ATP对豚鼠耳蜗外毛细胞Ca^（2＋）的调控

用激光扫描共聚焦显微镜研究了一般公认的耳蜗传出神经递质乙酰胆碱（ＡＣｈ）和三磷酸腺苷（ＡＴＰ）对豚鼠耳蜗外毛细胞（ＯＨＣｓ）胞内游离Ｃａ２＋浓度（［Ｃａ２＋］ｉ）的作用，ＯＨＣｓ用Ｃａ２＋敏感荧光染料Ｆｌｕｏ－３着色，胞内Ｃａ２＋的分布以细胞底部稍强。ＡＣｈ在ＯＨＣ底部引起［Ｃａ２＋］ｉ的缓慢上升并维持在一个较高水平。ＡＴＰ在整个ＯＨＣ引起一个急剧的［Ｃａ２＋］ｉ升高，升高的幅度在ＯＨＣ顶部最大。随着ＡＴＰ的持续作用，［Ｃａ２＋］ｉ缓慢下降，呈耗竭趋势，但此时用ＡＣｈ刺激仍能引起［Ｃａ２＋］ｉ的升高，这提示ＡＣｈ引起的［Ｃａ２＋］ｉ升高有胞外Ｃａ２＋流入的成分，ＡＴＰ引起的［Ｃａ２＋］ｉ；升高可能主要为胞内Ｃａ２＋库的释放，但也不排除通过ＡＴＰ门控的阳离子通道的直接进入。

内毛细胞缺损对噪声引起外毛细胞损害的潜在影响

目的 观察噪声对正常灰鼠和内毛细胞缺损灰鼠的外毛细胞是否具有不同的破坏效应。方法 6只正常灰鼠和 12只卡铂致聋灰鼠作为受试对象。提前 30天给 12只灰鼠按照 10 0mg/kg的剂量腹腔注射卡铂 ,以达到预先选择性破坏其内毛细胞的目的。将 6只正常灰鼠和 6只经卡铂处理的灰鼠移入噪声室 ,在强度为 12 0dB、中心频率在 4kHz的脉冲噪声环境暴露 6小时 ;另外 6只经卡铂处理的灰鼠不经噪声暴露作为对照组。在噪声暴露后 30天取出耳蜗 ,常规制备耳蜗铺片 ,然后进行全耳蜗毛细胞计数 ,并将各组动物的毛细胞计数结果制备成平均受损情况分布图 ,观察和比较噪声引起的外毛细胞损害水平在具有正常内毛细胞的灰鼠和丧失内毛细胞的灰鼠是否存在差别。结果 单纯注射卡铂的灰鼠内毛细胞平均损失在 90 %左右 ,但外毛细胞无损害。经噪声暴露的正常灰鼠外毛细胞在耳蜗底回中部约相当于 4kHz共振频率区域平均损失 6 0 % ,但是在该区域两侧靠近底回和顶回的外毛细胞损失少于 2 0 %。预先经卡铂破坏 95 %内毛细胞的灰鼠经噪声暴露后 ,外毛细胞在耳蜗底回中部平均损失达到 90 % ,在该区域两侧的外毛细胞损失百分比大于 4 0 %。结论 内毛细胞缺损可以造成更多的外毛细胞在噪声刺激中被破坏 ,提示正常内毛细胞的存在可能有?

催产素对内耳外毛细胞功能的调控作用

采用耳蜗外淋巴液灌流催产素(OXT),记录由鼓阶电极引导的听神经复合动作电位(CAP)及耳蜗微音电位(CM)的输入—输出(I/O)函数。发现OXT可在90dB(SPL)以下各声强提高短纯音诱发的CM振幅以及短声诱发的CAP振幅,而当声强高于90dB时CM变化不明显。但在用含氯化筒箭毒(dTC)的外淋巴液灌流以阻断橄榄耳蜗束胆碱能传出控制后,OXT不再引起CM改变,而对CAP的作用在低声强段(<60dB)依然存在。这些结果提示OXT可能调节传出神经对内耳的控制,并可能对外毛细胞(OHC)的运动能力有直接影响。

豚鼠耳蜗单离外毛细胞游离钙的胆碱能调控

目的 观察胆碱能兴奋剂和拮抗剂对豚鼠耳蜗单离外毛细胞 (OHC)内游离钙浓度 ([Ca2 + ]i)的影响 ,探讨OHC内 [Ca2 + ]i的胆碱能调控机制。方法 健康豚鼠 15只处死 ,Hanks液中分离活性单离OHC ,Fluo - 3/AM负载 30min。分 7组进行不同干预 ,包括乙酰胆碱 (ACH ,胆碱能M和N受体兴奋剂 )、毒蕈碱 (M受体兴奋剂 )、阿托品 (M受体拮抗剂 )、庆大霉素 (N受体拮抗剂 )、加Hanks液对照组和不加干预对照组 ;另 1组为dHanks液中加ACh。用激光扫描共聚焦显微镜 (Bio-Rad ,英国 )观察OHC内 [Ca2 + ]i的变化。结果 Hanks液中不加干预试剂、加毒蕈碱、加Hanks液对照和无钙dHanks液中加ACh等 4组 ,[Ca2 + ]i在 2 5～ 30min内升幅 <1.10倍。Hanks液中加ACh组 [Ca2 + ]i最高升幅平均为 3.0 9倍 ;阿托品 +ACh组 [Ca2 + ]i为 2 .92倍 ;庆大霉素 +ACh组[Ca2 + ]i为 1.81倍。结论 豚鼠耳蜗传出神经递质ACh通过兴奋N受体 ,开放OHC的细胞膜钙离子通道 ,使细胞外Ca2 + 内流外毛细胞内 ;[Ca2 + ]i增加需要细胞外液中钙离子存在。

耳蜗外毛细胞静纤毛束变异的判定标准与抵抗耳中毒的能力

目的建立耳蜗外毛细胞(OHC)静纤毛束变异的判定标准,观察毛细胞静纤毛束变异对庆大霉素耳中毒的抵抗能力。方法对豚鼠测定听性脑干反应(ABR)阈值和畸变产物耳声发射(DPOAE)振幅后,选取静纤毛束正常和变异豚鼠各5只,连续肌注庆大霉素(grntamicin,GM)12d后,测定ABR阈值,扫描电镜观察耳蜗外毛细胞静纤毛束变异情况,耳蜗铺片计数毛细胞的损失数。结果耳蜗底回第一排外毛细胞静纤毛束转位超过45°、“W”变形数超过10%,作为豚鼠耳蜗外毛细胞静纤毛束变异的判定标准。5只静纤毛变异豚鼠GM注射12d后平均ABR阈值51.0±8.76dBSPL,外毛细胞损失约16%～39.96%,柯替器受损程度较轻;而外毛细胞(OHC)正常豚鼠GM注射12d后ABR阈值上升到58.4～100dBSPL,OHC基本消失,柯替器毛细胞破坏较为严重。结论耳蜗外毛细胞静纤毛束变异豚鼠较OHC正常者对GM中毒具有较大的耐受能力。

碱性成纤维细胞生长因子对豚鼠耳蜗外毛细胞钙调控的影响

目的 观察碱性成纤维细胞生长因子 (Basicfibroblastgrowthfactor ,bFGF)对豚鼠耳蜗外毛细胞 (Outerhaircells,OHCs)钙调控的影响以及这种影响与硫酸链霉素的拮抗效应 ,旨在深入探讨硫酸链霉素急性耳毒性和bFGF防治作用的分子生物学机制。方法 豚鼠全麻后断头活杀 ,酶 -机械法分离获得单离的OHCs。 10 μmol·L-1的Fluo 3 /AM负载 ,室温下放置 60min后用ACASUltima型激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM ,MeridianUSA)观察各种条件下OHCs[Ca2 + ]i的变化。结果 ① 10 0mmol·L-1的高钾细胞外液和含 1nmol·L-1bFGF的正常细胞外液灌流分别导致 10 /11和 9/9个细胞的 [Ca2 + ]i升高 ,而高钾无钙细胞外液和含 1nmol·L-1bFGF的无钙细胞外液灌流则分别为 0 /7和 0 /8个细胞 [Ca2 + ]i 升高。②经 1 0mmol·L-1的硫酸链霉素处理后 ,灌流高钾细胞外液则 0 /12个细胞 [Ca2 + ]i 升高 ,灌流bFGF则为 4/8个细胞 [Ca2 + ]i 升高。③ 1nmol·L-1的bFGF作用后 ,灌流高钾细胞外液 ,OHCs[Ca2 + ]i升高的幅度较高 ,持续时间较长。④ 3组细胞均提前 1h加入 1mmol·L-1的硫酸链霉素 ,实验前 5min分别加入 0 1、1 0和 10nmol·L-1的bFGF ,灌流高钾细胞外液则分别导致 4/11、6/9和 12 /12个细胞 [Ca2 + ]i的升高。结论 bFGF和?