斑马鱼叶酸多聚谷氨酸合成酶基因的生物信息学特征及胚胎发育表达

目的探索斑马鱼叶酸多聚谷氨酸合成酶(FPGS)的生物信息学特征及在胚胎发育中的表达模式。方法利用Ensemble数据库及ClustalW程序进行序列比对,分析斑马鱼与哺乳动物FPGS蛋白之间的氨基酸同源性;利用系统发育树分析不同物种间fpgs基因的保守性;运用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析fpgs基因在斑马鱼重要器官及胚胎早期发育中的表达;运用整胚原位杂交技术检测野生型斑马鱼fpgsmRNA的表达。结果生物信息学分析显示,斑马鱼FPGS蛋白在进化上与哺乳动物同源物高度保守。RT-PCR结果显示,斑马鱼fpgs基因不仅在胚胎的各个发育阶段均有表达,且在成鱼的脑、肝和胃组织中高表达。原位杂交结果显示,fpgs基因在斑马鱼胚胎4细胞期广泛表达,而在尾芽期开始仅在卵黄合体细胞层中表达;在斑马鱼胚胎20体节期,fpgs在产生初级造血祖细胞的中间细胞团、眼睛和后脑区域呈现特异性表达;从斑马鱼胚胎受精后48~96 h,fpgs基因在其肝脏及端脑与后脑的交界处特异性表达。结论斑马鱼的FPGS蛋白与哺乳动物同源物高度保守,且fpgs基因在斑马鱼发育中的初级造血区、肝脏、后脑区及眼睛特异性表达,提示该基因在这些组织的发育中可能发挥着重要作用。

γ-多聚谷氨酸水凝胶制备及生物安全性评价

目的:最近应用于临床的纳米创伤敷料中复合了纳米银等抗菌材料,虽抗菌性能较强,但生物相容性差,无法降解,对环境造成污染。拟通过观察γ-多聚谷氨酸酯化改性反应的动力学条件以及酯化后γ-多聚谷氨酸制备新型水凝胶的最佳方法,并对γ-多聚谷氨酸水凝胶的生物安全性进行评价,为创伤敷料、组织工程支架材料等领域提供一种新型的水凝胶材料。方法:实验于2006-08/2007-01在四川大学生命科学学院及高分子科学与工程学院完成。①以γ-多聚谷氨酸为原料,烯丙基溴及溴代正丁烷作酯化剂,在N-甲基吡咯烷酮中,油浴60℃条件下制备酯化γ-多聚谷氨酸。②以酯化γ-多聚谷氨酸为单体,偶氮二异丁腈作引发剂,甲基丙烯酸羟乙酯作交联剂,充N2保护,80℃油浴,制备γ-多聚谷氨酸水凝胶。③采用细胞毒性实验、生物降解实验、皮肤刺激与致敏实验、全身急性毒性实验对γ-多聚谷氨酸水凝胶的生物安全性进行评价。结果:①酯化γ-多聚谷氨酸:酯化度为40%和50%的γ-多聚谷氨酸具有一定疏水性又能保持适当亲水性。②吸水性分析:酯化度为40%的γ-多聚谷氨酸水凝胶吸水率能够达到自身重量的44倍。③细胞毒性实验结果:L929细胞在γ-多聚谷氨酸水凝胶浸提液中形态正常;MTT检测表明γ-多聚谷氨酸水凝胶浸提液组毒性为0级或1级。④生物降解实验结果:γ-多聚谷氨酸水凝胶在5d后即能降解60%,在15d时仅残余少量水凝胶,具有良好的生物降解性。⑤局部斑贴实验结果:γ-多聚谷氨酸水凝胶各时段各部位无红斑和水肿反应,与阴性对照组相比无明显差别,皮肤刺激反应为0级。⑥皮肤致敏实验结果:移去斑贴物1,24,48h后,试验动物贴敷部位均无红斑和水肿出现,反应积分小于1。根据皮肤致敏实验分级标准,γ-多聚谷氨酸水凝胶对豚鼠无明显的潜在致敏性。⑦全身急性毒性实验结果:γ-多聚谷氨酸水凝胶浸提液注射后24,48,72h,小鼠体质量均无明显的变化,与阴性对照生理盐水组无明显差别,全身急性毒性实验为阴性反应。结论:以酯化后γ-多聚谷氨酸制备的水凝胶不仅具有高吸水性,同时还具有优良的生物安全性。

γ-多聚谷氨酸的生物合成及其相关基因

综述了γ 多聚谷氨酸 (γ PGA)的研究进展。γ PGA是一种高分子可降解生物材料 ,目前 ,高产菌株的产量为 5 4 45～ 5 8 0 8g L ,多用E 培养基 ,发酵温度为 37℃ ,影响产率的因素为碳源、NaCl浓度、通气量和金属离子。用超滤和乙醇沉淀的方法提取分离纯化γ PGA。讨论了γ PGA生物合成机制及其相关基因的克隆、定位和功能。最后简述了γ

γ-多聚谷氨酸的微生物合成

阐述了γ -多聚谷氨酸的化学特性 ,综述了γ -多聚谷氨酸微生物合成常采用的菌株 ,生物合成和提取的方法 ,以及作为一种可分解性的生物高分子 ,γ -多聚谷氨酸在医药、工业、农业等方面的应用。

γ-多聚谷氨酸产生菌高效诱变育种的研究

设计了几组不同的诱变条件对γ多聚谷氨酸生产菌BacilluslicheniformisATCC9945A进行诱变,诱变后将所有菌株混合,以此未经筛选的混合菌共同发酵,并以终产量为指标对发酵条件进行连续的定向调控,使发酵条件逐渐向高产正突变株倾斜,产量得以逐步提高.同时在混合菌状态下找到适合高产正突变株的发酵条件,以此发酵条件作为筛选平板,对混合菌分离纯化,选育到γPGA高产菌Zγ29,产量是出发菌株的4.14倍,筛选条件即为该突变株的最佳发酵条件.

多聚谷氨酸化甲氨蝶呤浓度与类风湿关节炎疗效相关性研究

目的探讨经甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)治疗的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者红细胞内多聚谷氨酸化甲氨蝶呤(methotrexate polyglutamate,MTXPG)的浓度与其疾病活动度的关系。方法选取76例经MTX治疗3个月的RA患者进行横断面研究,采用ELISA方法检测红细胞内MTXPG浓度,根据治疗后疾病活动度(DAS28)以及治疗前后DAS28差异性分值分为显效、有效和无效组,进行各组之间MTXPG浓度的比较及相关性分析。结果经MTX治疗后21例RA患者显效,41例有效,14例无效。显效组红细胞内MTXPG浓度为(158.87±48.27)ng/ml,显著高于有效组(105.89±24.23)ng/ml及无效组(85.80±21.30)ng/ml(P<0.01)。红细胞内MXPG浓度与CRP(r=-0.628,P=0.000)、晨僵时间(r=-0.396,P=0.000)、肿胀关节数(r=-0.321,P=0.005)、压痛关节数(r=-0.376,P=0.001)、视觉模拟评分(VAS)(r=-0.236,P=0.000)、DAS(r=-0.255,P=0.026)呈显著负相关;与血沉、健康问卷评分(HAQ)无相关性(P>0.05)。结论经MTX治疗的RA患者各疗效组间红细胞内MTXPG浓度差异显著,较高浓度的MTXPG与较好的临床疗效相关。

γ-多聚谷氨酸的性质、发酵生产及其应用

系统地介绍了γ 多聚谷氨酸这种水溶性生物可降解的阴离子物质的基本性质、发酵生产方法及其在工业上的潜在应用 ,揭示了这种新型高分子氨基酸聚合物具有极其广泛的经济效益和开发价值。

多聚谷氨酸发酵的响应面法优化

以一株纳豆芽孢杆菌进行多聚谷氨酸发酵,采用Plackett-Burman法对发酵工艺进行评价,得出培养基配方对多聚谷氨酸的产量有显著影响的因子包括:葡萄糖、豆饼粉、谷氨酸钠,然后用响应面法对这几个因素进行优化,所得的最佳培养基配方为:葡萄糖8%,豆饼粉3.2%,谷氨酸钠4.8%,MgSO.43H2O0.06%,CaCl20.06%,K2HPO.43H2O0.39%,KH2PO4 0.3%,灭菌前pH 7.5,PGA产量由原来的15.4 g/L提高到26.2 g/L。

高效液相色谱法分析甲氨蝶呤及多聚谷氨酸甲氨蝶呤

目的：建立高效液相色谱法测定甲氨蝶呤及多聚谷氨酸甲氨蝶呤的方法。方法：待测样品加入10％三氯醋酸溶液沉淀蛋白，旋涡混合、离心，取上清液进样。XTerraTM RP18（3．9mm×150mm，5μm）色谱柱，流动相为甲醇和磷酸盐缓冲液（7．5mmol·L^-1，pH7．3）梯度洗脱；流速1mL·min^-1；样品温度15℃；柱温30℃；紫外检测器，检测波长309nm。结果：五聚谷氨酸甲氨蝶呤、四聚谷氨酸甲氨蝶呤、三聚谷氨酸甲氨蝶呤、二聚谷氨酸甲氨蝶呤、甲氨蝶呤的保留时间分别为3．194，4．147，5．488，6．738，8．063min;线性范围1．5625～400μmol·L^-1，甲氨蝶呤及多聚谷氨酸甲氨蝶呤的回收率为89．01％～105．54％（RSD〈C5％）；最低检测浓度0．01μmol·L^-1（S／N〉3），9min内可完成5种组分的分析。结论：该方法灵敏度高，结果准确，分析快速、简便。

氨甲蝶呤多聚谷氨酸的检测及其临床应用价值

氨甲蝶呤多聚谷氨酸(methotrexate polyglutamate,MTXPG)为氨甲蝶呤(methotrexate,MTX)在细胞内的代谢产物,其蓄积程度决定着MTX的细胞毒性和治疗效果。MTXPG的检测有利于监测其在细胞内的浓度,指导临床用药和预后判断。本文就MTXPG在细胞内的代谢过程、检测方法及其在临床疾病治疗中的应用价值做一综述。

急性淋巴细胞白血病患儿叶酰多聚谷氨酸合成酶和γ-谷氨酰水解酶基因表达与大剂量甲氨蝶呤疗效相关性

目的研究叶酰多聚谷氨酸合成酶(FPGS)、γ-谷氨酰水解酶(GGH)基因表达水平在急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿和正常儿童中是否存在差异,并分析不同基因表达水平与大剂量甲氨蝶呤(MTX)疗效、毒副作用及预后的相关性。方法以深圳市儿童医院(我院)血液科收治的ALL初诊且接受大剂量MTX化疗患儿为ALL组,以非造血系统恶性疾病儿童为对照组;采用SYBR Green荧光定量RT-PCR检测ALL组骨髓和对照组外周血中FPGS与GGH基因相对表达水平,比较ALL组和对照组FPGS与GGH基因表达水平差异。进一步按照ALL组FPGS、GGH基因表达水平的中位数分为相应的高表达亚组和低表达亚组,分析FPGS、GGH不同表达亚组MTX疗效、毒副作用及预后的差异。结果 2003年1月至2013年12月61例ALL患儿进入分析,男39例,女22例,平均年龄4.6岁;对照组纳入30例,男19例,女11例,平均年龄4.2岁。ALL组FPGS、GGH基因相对表达水平及其比值中位数(P25~P75)分别为14.14(6.52~27.31)、9.34(4.97~14.22)和1.74(0.76~2.91),对照组分别为0.59(0.3~1.23)、3.00(0.94~5.26)和0.26(0.13~1.00),差异均有统计学意义(P均<0.01)。FPGS高表达和低表达亚组复发率分别为3.7%(1/27)和23.3%(7/30),差异有统计学意义(P<0.05)。FPGS基因表达水平升高增加发生中性粒细胞减少的风险(OR=4.17,95%CI:1.65~10.52,P=0.003)。GGH基因高表达水平增加肝毒性的风险(OR=5.61,95%CI:1.14~27.47,P=0.033)。未观察到FPGS/GGH比值对MTX疗效及毒副作用的影响。结论 ALL患儿FPGS、GGH基因表达水平及其比值高于正常儿童;FPGS基因表达水平对ALL患儿大剂量MTX疗效及毒副作用有一定的影响。

固态发酵生产多聚谷氨酸培养条件的优化

目的研究固态发酵多聚谷氨酸的培养基成分及培养条件。方法先用单因素试验考察固体发酵培养基的碳源、氮源、培养基pH和培养温度,以确定各因素的最优水平。然后选取最适碳源、最适氮源、培养基含水量和接种量4个因素,安排4因素3水平试验方案。结果得到固态发酵γ-多聚谷氨酸的最佳条件:淀粉2.6%,大豆粉24.6%,含水量55%,接种量12%,发酵初始pH 7.0,培养温度38℃。结论正交试验结果确定了各因素间的最优组合,可提高固态发酵γ-多聚谷氨酸的产量。

基因多态性对红细胞内多聚谷氨酸甲氨蝶呤浓度影响的研究进展

甲氨蝶呤(MTX)作为一种慢作用的抗风湿药,在临床上已普遍用于治疗类风湿性关节炎。MTX在体内主要是通过其活性代谢产物多聚谷氨酸甲氨蝶呤(MTXPGs)持续发挥药理效应,其与基因多态性的关系有少量报道,并且结果并不一致。因此本文就甲氨蝶呤相关基因多态性对红细胞内MTXPGs浓度影响作一综述,探索MTX疗效与红细胞内多聚谷氨酸甲氨蝶呤浓度和基因多态性的关系,以期为临床研究提供参考。

一株γ-多聚谷氨酸生产菌的分离筛选与鉴定

从菜园土壤中取样,在含有谷氨酸的筛选培养基上采用梯度稀释涂布、平板划线的方法,以菌落/菌液黏稠度为指示,分离筛选生产γ-多聚谷氨酸的菌株。利用氨基酸分析仪测定提取纯化后的γ-多聚谷氨酸的产量,并通过形态学、生理生化特征以及16S rDNA基因序列分析鉴定该菌株,并对其合成γ-多聚谷氨酸的功能基因进行PCR扩增。结果表明:筛选到1株产γ-多聚谷氨酸的细菌C1,其液体摇瓶发酵产量为18.4 g/L,相对分子质量为1.8×106;该菌株为革兰氏阳性,菌落黏稠、菌体呈杆状、产芽胞、且形成荚膜;主要生理生化特点为能利用葡萄糖和蔗糖发酵,水解淀粉,H2O2酶阳性,产吲哚等;经16S rDNA鉴定与Bacillus amyloliquefaciens ATCC23350同源性为100%,故命名为Bacillus amyloliquefaciens C1,且拥有γ-多聚谷氨酸合成的相关基因pgsA、pgsB和pgsC。

甲氨蝶呤多聚谷氨酸盐在甲氨蝶呤治疗急性白血病中的作用及耐药机制研究进展

甲氨蝶呤已成功应用于临床多年，关于其毒性及耐药性机制的研究也较深入。该文主要从甲氨蝶呤多聚谷氨酸化(PG化)与相关酶的关系这一角度阐述其在白血病治疗中的研究进展及临床应用。

添加氧载体对γ-多聚谷氨酸发酵的影响

针对γ-多聚谷氨酸(Poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)好氧发酵过程中存在的供氧不足而导致产量偏低的问题,探究了不同氧载体对γ-PGA发酵的影响,并对最适氧载体的添加量和添加时间进行了优化。结果表明,正十六烷为最适氧载体,其最佳添加条件为:添加量为0.5%(体积比),添加时间为0 h,发酵48 h,γ-PGA产量达到最高值为(18.62±0.84) mg/m L,相比对照组提高了30%以上。本研究为通过添加氧载体,增加溶氧来提高γ-PGA发酵产量提供了理论依据。

多聚谷氨酸对肾衰大鼠尿白蛋白排泄量的影响

多聚谷氨酸对肾衰大鼠尿白蛋白排泄量的影响熊祖应，左静南，侯积寿，蒋更如，刘秀英，宋晓君（上海第二医科大学新华医院肾脏科上海２０００２５）肾小球滤过膜的电荷屏障作用减弱与蛋白尿形成有关，国外曾有学者用带正电荷的多聚阳离子输注引起尿白蛋白的排泄量（ＵＡＥ...

酶联免疫吸附法测定红细胞内多聚谷氨酸化甲氨蝶呤浓度的方法建立及其初步应用

目的建立检测红细胞内多聚谷氨酸化甲氨蝶呤（methotrexate polyglutamates,MTXPG）的酶联免疫吸附测定法（ELISA）方法。方法将含有MTXPG的红细胞采用冻融法、化学裂解法、酶法、超声破碎法等方法裂解,加入血清与裂解液在抗坏血酸、巯基乙醇保护液作用下将MTXPG转化为甲氨蝶呤（methotrexate,MTX）,转化液采用高氯酸、三氯乙酸及饱和硫酸铵溶液沉淀蛋白,最后将溶液p H值调整为3.0～9.0,采用ELISA检测MTX浓度。经方法学考核后,检测临床标本对方法准确性进行评价。结果发现冻融法与冻融法裂解红细胞显著优于酶法和化学裂解法（P〈0.05）,抗坏血酸配制的保护液明显优于巯基乙醇（P〈0.05）,转化液37℃孵育3 h时MTXPG转化完全,高氯酸、三氯乙酸、饱和硫酸铵溶液3种蛋白沉淀剂无明显差异（P〉0.05）,最适p H为6～8,最佳p H值为6.8。浓度在0.2～10.0 ng/m L范围内线性关系良好（r=0.9967）,回收率为96.6%～103.3%,RSD为8.0%～14.3%,日内差异为1.7%～11.7%,日间差异为7.4%～13.5%,RSD均小于15%。检测患者红细胞内MTXPG浓度为（64.75±28.45）ng/m L。结论建立的红细胞内MTXPG的ELISA法有良好的准确性和特异性,方法操作简单易行,可用于临床红细胞内MTXPG浓度的监测。

抗体导向药物的研究——Ⅰ.以多聚谷氨酸为中介载体的抗体药物偶合物的制备

本文以多聚-L-谷氨酸(PLGA)为中介载体,将抗肿瘤药物丝裂霉素C、柔红霉素及阿霉素分别与抗胃癌单克隆抗体MGb_2偶联,研制抗体导向偶合物。为了避免多聚物的形成,我们采用了一种反应选择性的交联策略。首先于PLGA分子中引入一定数目的保护性巯基,制备PLGA衍生物(Ⅰ);在碳二亚胺作用下,丝裂霉素C、柔红霉素或阿霉素与(Ⅰ)缩合,得药物-PLGA缩合物(Ⅱ);然后以二硫苏糖醇还原脱保护,即得巯基化的药物-PLGA缩合物(Ⅲ);相应地,制备马来酰亚胺取代的抗体衍生物(Ⅳ);最后,(Ⅲ)分子中的巯基与(Ⅳ)分子中的马来酰亚胺基的双键进行反应,形成以硫醚键交联的抗体导向偶合物R-NH-PLGA-S-MGb_2(Ⅴ_(1～3))。

SLCO1B1基因多态性与类风湿关节炎患者多聚谷氨酸化甲氨蝶呤浓度及疗效的关系

目的:研究SLCO1B1388A>G和521T>C基因多态性与类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者服用小剂量甲氨蝶呤治疗后红细胞中多聚谷氨酸化甲氨蝶呤(methotrexate polyglutamates,MTXPGs)浓度、疗效及肝毒性的关系。方法:前瞻性收集接受小剂量甲氨蝶呤治疗的137例RA患者,采用基因芯片法检测SLCO1B1基因,经HPLC-MS/MS法检测患者红细胞中MTXPGs浓度,应用SPSS软件分析SLCO1B1基因多态性与MTXPGs浓度、疗效及肝毒性的关系。结果:G、C等位基因的频率分别为73.7%、11.7%,SLCO1B1基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡检测。388A>G和521T>C突变组与野生组间红细胞中MTXPGs浓度在患者服药第8,12,24,40周后差异均无统计学意义(P>0.05),同时不同基因型患者间疗效与肝毒性差异亦无统计学意义(P>0.05)。结论:SLCO1B1388A>G和521T>C基因多态性与MTXPGs浓度、疗效及肝毒性可能无关。